Italian Journal of Freshwater Ichthyology, 2014 vol. 1 Atti XIII Congresso Nazionale Associazione Italiana Ittiologi Acque Dolci Sansepolcro (Ar)

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1 It.J.Fresh.Ichthyol. 2014(1) : USO DI MARCATORI MOLECOLARI PER LA CARATTERIZZAZIONE GENETICA DEL TEMOLO Thymallus thymallus (Linnaeus, 1758) DI CEPPO ADRIATICO, A FINI RIPRODUTTIVI E DI RIPOPOLAMENTO SILVIA BATTISTELLA*, MARTINA MODONUT*, CHIARA VICENTINI *Università degli Studi di Trieste, Dipartimento di Scienze della Vita, Via Giorgieri, Trieste Abstract In questo lavoro vengono presentati i primi risultati di un progetto finanziato dall Ente Tutela Pesca del Friuli Venezia Giulia, volto a fare chiarezza sullo status genetico del temolo adriatico, salmonide autoctono particolarmente apprezzato dai pescatori sportivi. Nella seconda metà degli anni settanta il suo progressivo calo a causa della sua sensibilità alla qualità e alla portata delle acque spinse gli organi gestori a ripopolare i fiumi con temoli, purtroppo di ceppo diverso da quello locale, tanto che in alcuni fiumi il ceppo danubiano attualmente è prevalente. Per discriminare i due ceppi è stata condotta l analisi delle sequenze del DNA mitocondriale di un frammento di 394bp della regione di controllo e di uno di 363bp della regione del gene del citocromo b. Nell arco di tre anni sono stati analizzati esemplari provenienti dal Bacino dell Isonzo (5), del Tagliamento (34), del Meduna-Cellina (14) e del Livenza (15). In questo studio preliminare, dai risultati ottenuti, il bacino dove il ceppo padano è risultato predominante è il Livenza a seguire il Tagliamento e il Cellina-Meduna. L Isonzo, con un numero peraltro troppo esiguo di esemplari analizzati, risulta comunque avere una netta prevalenza del ceppo danubiano. Tra gli esemplari analizzati sono stati scelti esemplari di ceppo padano da avviare alla riproduzione al fine di ripopolare i fiumi con pesci locali. Keywords: Thymallus thymallus, mitochondrial DNA, control region, cytochrome b gene, conservation biology Introduzione Il temolo europeo (Thymallus thymallus) è un Salmonide con un areale di distribuzione che comprende l Europa continentale dagli Urali ai Pirenei, la Scandinavia e l Inghilterra. In Italia vive solamente nei fiumi che fanno capo al sistema padano e nei laghi alpini (Tortonese, 1970; Alessio e Gandolfi, 1983; Buda Dancevich et al., 1988). In Italia, come nel resto d Europa, negli ultimi decenni la sua consistenza numerica ha manifestato un progressivo calo principalmente a causa della sua elevata sensibilità alla qualità e portata delle acque, tanto da procedere in diversi bacini, ad immissione di esemplari da allevamenti d oltralpe (Austria, Slovenia) per supportare lo sforzo di attività alieutica, dal momento che il temolo è fra le specie maggiormente apprezzate dai pescatori sportivi (Gandolfi et al., 1991). Nel nostro paese il temolo si identifica con il ceppo padano ed è caratterizzato da un fenotipo preciso i cui tratti salienti sono riconducibili al colore blu della pinna caudale e al colore grigio del corpo. Il suo areale si stende alla Slovenia nel fiume Soča-Isonzo e suoi tributari e qui viene denominato temolo adriatico, a differenza del temolo presente in Austria e negli altri fiumi della Slovenia, riconducibile al ceppo danubiano, con pinna caudale rossa e corpo giallastro. Oltre a queste differenze riguardanti il colore della livrea e della coda, i due ceppi presentano altri caratteri distintivi quali nel ceppo danubiano, le dimensioni inferiori delle scaglie e una macchia irregolare vinaccia sui fianchi, nella metà posteriore del corpo, mentre quello adriatico di solito presenta sui fianchi, delle decise macchioline nere di forma variabile (Gentili et al., 2000; Sušnik et al., 1999a; Sušnik et al., 2001; Uiblein et al., 2001; Sabbadini, 2007). 127

2 In Europa, i primi studi genetici sul temolo, intrapresi per far chiarezza sullo status delle popolazioni a supporto della gestione di questo Salmonide, vennero pubblicati negli anni novanta ed erano basati su analisi allozimatiche (Bouvet et al., 1990; 1992; Persat e Eppe, 1997). Dal 1999 in poi diversi gruppi di ricerca hanno indagato più a fondo dal punto di vista genetico le popolazioni di temolo europeo, come i vicini sloveni che mediante l uso di marker microsatelliti evidenziarono differenze tra il temolo del Danubio e quello dell Isonzo (Sušnik et al., 1999a, 1999b). Gli stessi autori negli anni successivi (Sušnik et al.,2001) studiarono la diversità evolutiva del temolo del sistema fluviale Adriatico, basato sulla variazione del mtdna. Dall analisi delle sequenze del DNA mitocondriale di un frammento di 394bp della regione di controllo e di uno di 363bp della regione del gene del citocromo b, di esemplari di temolo dei sistemi fluviali adriatico, danubiano e atlantico, emerge un antica origine monofiletica della popolazione adriatica, ben distinta dagli altri ceppi. Inoltre fu rilevata introgressione genetica tra temoli selvatici di ceppo adriatico e temoli di allevamento di origine danubiana (Sušnik et al., 2004). Dal 2007 anche l Ente Tutela Pesca del Friuli Venezia Giulia ha finanziato un progetto di monitoraggio a livello genetico delle popolazioni naturali di temoli per avere un quadro della situazione di questo salmonide nei principali bacini regionali e nello stesso tempo con l intento di selezionare temoli di sicuro ceppo Adriatico da utilizzare come riproduttori, in modo da ripopolare con pesce locale i nostri fiumi. L Ente gestore è stato spinto a intraprendere tali studi dalle medesime motivazioni dei vicini sloveni, dal momento che anche in Friuli Venezia Giulia per contrastare il calo di questo salmonide, sono stati immessi nella seconda metà degli anni settanta fino agli inizi degli anni novanta (Pizzul et al., 2007), in diversi bacini, esemplari di temolo di allevamento di ceppo danubiano, tanto che nel tratto italiano dell Isonzo, dall osservazione della livrea, il ceppo prevalente risulta essere quello danubiano. Per discriminare i due ceppi e stata usata l analisi delle sequenze del DNA mitocondriale. Nell arco di tre anni sono stati analizzati esemplari provenienti dai principali bacini regionali: Isonzo, Tagliamento, Meduna-Cellina, Livenza, dal momento che il temolo in Friuli Venezia Giulia, anche se costituito da popolazioni non ben strutturate e non molto abbondanti se non in ristrette aree, ha un ampio areale di distribuzione. Materiali e metodi I temoli sono stati catturati dagli operatori dell Ente Tutela Pesca del Friuli Venezia Giulia mediante elettrostorditore nei principali bacini regionali: Isonzo (5 esemplari), Tagliamento (34 esemplari), Meduna-Cellina (14 esemplari), Livenza (15 esemplari). Da ciascun esemplare è stata prelevata un pezzo di pinna adiposa conservata in etanolo 96%. Il DNA genomico è stato estratto dal tessuto utilizzando il kit di estrazione Genomic DNA Purification Kit (Fermentas), con l aggiunta di Proteinase K e un lavaggio in fenolo/cloroformio. L amplificazione mediante PCR è stata condotta su un segmento di approssimativamente bp, che comprende il citocromo b e la regione di controllo mediante i primer HN20 (Bernatchez & Danzmann, 2001) e C-Glu (Cronin et al., 1993). Le amplificazioni mediante PCR sono state condotte in un termociclatore opportunamente programmato (HYBAID THERMAL REACTOR). A un volume totale di 30µl contenente 1µM di ciascun primer, 0,2 mm di dntp, 1,5 mm MgCl 2, 1 x di soluzione Buffer e 1U di Taq Polimerasi (GoTaq, Promega), sono stati aggiunti 100ng di DNA genomico. Sono stati eseguiti i seguenti cicli: denaturazione (95 C, 3 min), seguito da 30 cicli costituiti da 3 step, denaturazione (94 C, 60s), annealing (53 C, 30s), estensione (72 C. 90s). I frammenti di DNA amplificato, sono stati fatti correre in un gel di agarosio 1,5%, e purificati dal gel utilizzando il Kit Nucleospin Extraction (Fermentas). Tutti gli amplificati sono stati sottoposti alla reazione di sequenziamento con il metodo di Sanger. Per poter comparare il grado di mutazione all interno delle regioni del mtdna codificanti e non codificanti, sono stati sequenziati, per tutti gli esemplari, un segmento di 363bp al 5 del gene del citocromo b ed un segmento di 394bp della regione di controllo. Il primer di sequenziamento al 5 del gene del citocromo b è C-Glu (Cronin et al., 1993). Il sequenziamento al 5 della regione di 128

3 controllo è stato attuato usando il primer interno RIBa : 5'-CACCCTTAACTCCCAAAGCT AAG-3'. I campioni così preparati sono stati spediti al centro BMR Genomics di Padova per la reazione di sequenziamento (Big Dye Termination reaction, Applied Biosystem) con il sequenziatore automatico ABI 3730XL. Le sequenze così ottenute sono state lette con il software FinchTV (Freeware, Questo software permette di visualizzare la stringa di basi nucleotidiche direttamente in un cromatogramma. Successivamente è stata fatta l'analisi di similarità di ciascuna sequenza confrontandola con le sequenze depositate nelle banche dati con il programma euristico BLAST ( In seguito le sequenze sono state allineate con il programma DNASTAR Lasergene SeqMan e confrontate con la sequenza di riferimento dell aplotipo Adriatico (Ad1) (Sušnik et al., 2001) corrispondente al temolo padano e registrato in banca dati nucleotidica NCBI con il codice AF La nomenclatura aplotipica usata in questo lavoro segue quella proposta da Uiblein et al. (2000) dando i nomi in accordo con l origine geografica degli esemplari (Da per Danubiano e Ad per Adriatico), Sušnik et, al. (2001), e Weiss et al., (2002), per quanto riguarda l assegnazione dei diversi aplotipi. Risultati e discussione Sono state determinate le sequenze di un segmento di 394-bp al 5 della regione di controllo e di 363-bp al 5 del gene del citocromo b di 68 esemplari di temolo provenienti da 6 popolazioni (Tab.1, Fig.1). Nel segmento della regione di controllo sono state evidenziate 20 sostituzioni che identificano 7 aplotipi. Di questi, gli aplotipi danubiani riscontrati, (Da23, Da24), sono gli stessi riportati da Weiss et al. (2002) che li identifica con il tratto sloveno della Sava, affluente di destra del Danubio. Per quanto riguarda gli aplotipi adriatici, è stato identificato l aplotipo Ad1, lo stesso riportato da Sušnik et al. (2001) e corrispondente alla sequenza AF depositata in Genebank. Oltre a questo sono state identificate altre sostituzioni che hanno portato all evidenza tre nuovi aplotipi: Ad1 1, Ad1 2, Ad1 3 (Tab.2). L aplotipo più rappresentativo della regione di controllo è risultato essere il profilo Ad1 1 caratteristico di 26 esemplari sui 48 adriatici Fig.1 Distribuzione del temolo in Friuli Venezia Giulia (Pizzul, 2007) e aree di prelievo dei campioni di temolo nei principali bacini regionali individuati, ma non identificativo di un determinato bacino, mentre l aplotipo danubiano più rappresentativo è stato il Da24 presente in 15 campioni dei 20 danubiani individuati. Nella regione del gene del citocromo b sono state evidenziate 17 sostituzioni nucleotidiche, anche diverse da quelle riportate da Sušnik et al. (2001), la maggior parte delle quali, avvenute a livello della terza base, non hanno portato a una sostituzione aminoacidica, mentre in tre casi la sostituzione ha prodotto una nuova tripletta corrispondente a un diverso aminoacido. Queste sostituzioni hanno dato origine a 3 aplotipi danubiani (Da1, Da2, Da4 1 ) di cui i primi due identificati anche da Sušnik et al. (2001) mentre Da4 1 è un aplotipo diverso riscontrato in soli due esemplari appartenenti però a due diversi bacini regionali. Sono stati inoltre identificati 7 aplotipi adriatici (Ad1, Ad1 1, Ad1 2, Ad1 3, Ad1 4, Ad1 5, Ad1 6 ), di cui solo Ad1, corrispondente a quello individuato da Sušnik et al. (2001) e depositato in Genebank con il codice AF L aplotipo più frequente è risultato essere Ad1 1, con 21 esemplari su 48 adriatici evidenziati, ma comunque non localizzato in un solo bacino. Degli altri aplotipi identificati, Ad1 2 e Ad1 5, presentano delle 129

4 mutazioni a livello dei nucleotidi 349, 352, 361 (rispetto alla sequenza di riferimento AF270690) che non vengono riportate nel lavoro di Sušnik et al. (2001) (Tab.3). Tab.1 In tabella vengono riportati il bacino di provenienza, il fiume in cui sono stati catturati gli esemplari di temolo con il rispettivo codice identificativo, il numero di individui analizzati, e per ogni campione, gli aplotipi complessivi ottenuti dalla combinazione dei risultati aplotipici della regione di controllo e del gene del citocromo b indicato con la lettera c Posizione sostituzioni Aminoacidi Pro Leu/Pro Leu/Ser Ser/Thr Val Ala Gly Phe Ile Ser Val Ile Leu Leu Thr Ad1 (AF270690) CCC CTA CTA TCA GTG GCT GGA TTT ATC TCT GTG ATT CTC CTT ACT Ad T --C --A Ad T --C --A Ad A A --C Ad1 4 --A -CC TC C T --C --A Ad C T --C --A Ad C Da1 (AF270689) --A --C T A G --C --T --A --A --C Da2 (AF270691) --A --C T-- --G --A G --C --T --A --A --C Da4 1 --A --- T C --T C Tab.2 Sostituzioni nucleotidiche riscontrate rispetto alla sequenza di riferimento Ad1 (AF ) della regione di controllo dell mtdna Queste sostituzioni avvengono a livello della terza base della tripletta nucleotidica, non comportando alcuna sostituzione aminoacidica. Per quanto riguarda gli aplotipi danubiani, il profilo più rappresentativo è risultato essere Da1 con 12 esemplari sui 20 analizzati. La composizione aplotipica complessiva data dalla combinazione dell aplotipo ottenuto dall analisi della regione di controllo e dal gene del citocromo b ha evidenziato 15 profili adriatici, 5 danubiani (Tab.1). La nomenclatura segue le indicazione fornite da Sušnik et al. (2001) e da Weiss et al. (2002): per primo è indicato l aplotipo corrispondente alla regione di controllo analizzata e di seguito l aplotipo identificativo del gene del citocromo b seguito dalla lettera c in pedice. Sul totale dei 68 esemplari analizzati è stata evidenziata una percentuale pari al 70,6% di temolo di ceppo adriatico, 29,4% di ceppo danubiano. Tab.3 Sostituzioni nucleotidiche riscontrate rispetto alla sequenza di riferimento Ad1 (AF ) del gene del citocromo b dell mtdna 130

5 Analizzando i singoli bacini emerge che nel Meduna-Cellina su 14 esemplari la percentuale di temoli adriatici è del 64%, mentre i danubiani sono presenti per il 36%. Il bacino del Livenza è rappresentato dal 93% da temoli adriatici, mentre nel bacino del Tagliamento gli esemplari adriatici rinvenuti principalmente nel torrente Resia rappresentano il 71% del totale. Infine il campione dell Isonzo, anche se esiguo (5 esemplari) è caratterizzato esclusivamente da esemplari danubiani. Questo risultato non deve sorprendere dal momento che nel Natisone e nell Isonzo dalla seconda metà degli anni 70 sono stati introdotti, sia in territorio sloveno che italiano, esemplari di temolo di ceppo danubiano (Pizzul et al., 2007), tanto che anche in Slovenia il problema degli ibridi tra i due ceppi è molto diffuso (Sušnik et al. 2001, 2004). Nel Natisone, addirittura, la prima presenza del temolo viene segnalata da Specchi et al. (1980), che la attribuiscono a semine condotte nel fiume in area slovena. Anche secondo Vuga (1997) il temolo non è specie indigena, ma frutto di introduzioni nel tratto di fiume compreso tra Stupizza e Pulfero. Precedentemente erano stati segnalati esemplari di temolo vicino al confine sloveno, dovute a immissioni d oltre confine. Le introduzioni iniziate a partire dagli anni 70, di provenienza slovena hanno portato in una decina di anni a popolazioni piuttosto numerose, sostenute da semine fino agli anni (Pizzul et al., 2007). I dati da noi raccolti dall analisi dell mt DNA confermano la presenza di temoli non nativi immessi nei fiumi regionali per scopi alieutici, ma nella maggior parte dei bacini del Friuli Venezia Giulia la popolazione di ceppo adriatico è ancora presente. Benché la caratterizzazione morfologica del temolo permetta di distinguere la linea adriatica da quella danubiana (Sabbadini, 2007), non sempre le caratteristiche fenotipiche sono indicatori assoluti dell appartenenza ad un ceppo, sia perché la descrizione della livrea è molto soggettiva sia perché essa può cambiare a seconda dell ambiente. L identificazione morfologica del ceppo adriatico inoltre è stata complicata dall incrocio tra temoli locali con esemplari introdotti di ceppo diverso. Infatti studi condotti sulle variazioni dell mtdna (Susnik et al., 2001, 2004) hanno dimostrato che il temolo adriatico è geneticamente distinto dal temolo che risiede in altri bacini del centro Europa, tanto da provocare introgressione genetica delle popolazioni di temolo locale, laddove sono stati effettuati ripopolamenti con temoli di allevamento provenienti dal bacino danubiano. Inoltre la divergenza nel pattern del mtdna di campioni facenti capo ai bacini adriatici, atlantici, baltici, mediterranei e del Mar Nero, supporta il panorama di una ricca diversità genetica inter- e intra- bacino, che dovrebbe controvertire la tendenza di ripopolare e rilasciare temoli di altra provenienza in risposta al declino delle popolazioni, soprattutto nei bacini del sud dell Europa (Weiss et al. 2002). Nell intento di selezionare dei riproduttori puri di ceppo adriatico/padano, allo scopo di ripopolare i nostri fiumi con pesce locale, il progetto di gestione del temolo in Friuli Venezia Giulia dovrà proseguire con l analisi di marcatori nucleari da affiancare all analisi mitocondriale e con la marchiatura dei singoli esemplari da avviare all allevamento, in modo da identificare in maniera univoca il fenotipo adriatico al genotipo corrispondente per cercare di ricostruire così le popolazioni originarie. Bibliografia - Alessio G., Gandolfi G., Censimento e distribuzione attuale delle specie ittiche nel bacino del fiume Po. Ist. Di Ricerca delle acque. Quaderno n. 67, CNR. - Bernatchez L., Danzmann R.G., 1993 Congruence in control-region sequence and restrictionsite variation in mitochondrial DNA of brook charr (Salvelinus fontinalis Mitchill) - Mol. Biol. Evol. 10: Buda Dancevich M., Sillani L., Specchi M., Osservazioni sulla struttura delle popolazioni di temolo. Thymallus thymallus (L.) (Osteichthyes, salmoniformes) del fiume Tagliamento e del fiume Meduna. Quaderni E.T.P., 16:

6 - Bouvet Y., Soewardi K., Pattee E., Genetic divergence within natural populations of grailing (Thymallus thymallus) from two French river systems. Arch. Hydrobiol. 119(1): Bouvet Y., Pattee E., Maslin J.L., Comparaison de la variabilité génétique de deux espèces de poissons, l ombre commun et le pardon, dans un fleuve aménagé. Bull. Fr. Pêche Piscic. 324: Cronin MA, Spearman WJ, Wilmot RL Mitochondrial variation in Chinook (Oncorhynchus tsawytscha) and Chum salmon (O. keta) detected by restriction enzyme analysis of Polymerase Chain Reaction (PCR) products. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 50: Gandolfi G., Zerunian S., Torricelli P. e Marconato A., I pesci delle acque interne italiane. Ministero dell ambiente Unione Zoologica Italiana, Istituto Poligrafico e Zecca dello Stato. Roma: Gentili G., Puzzi C. M., Romanò A., Sartorelli M., Trasforini S., Bosi R., Bertoni Z., Ecologia e gestione del temolo (Thymallus thymallus): esperienze italiane ed europee a confronto. Atti del convegno - 14 ottobre 2000 Parco del Ticino Pontevecchio di Magenta (MI). - Persat H., Eppe R., Alevinage, pollution et cloisonnement de l espace fluvial dans les structures génétiques des populations de poisson: l ombre commun, Thymallus thymallus, dans le Rhône au niveau de la Savoie. Bull. Fr. Pêche Piscic : Pizzul E., Distribuzione di Thymallus thymallus (Linnaeus, 1758). In: Il progetto temolo in Friuli Venezia Giulia. Supplemento a Pesca e ambiente Notiziario ETP. - Sabbadini A., Il temolo Thymallus thymallus (Linnaeus, 1758). In: Il progetto temolo in Friuli Venezia Giulia. Supplemento a Pesca e ambiente Notiziario ETP. - Specchi M., Stel G., Vuga A., Osservazioni idrobiologiche sul fiume Natisone (Friuli). Nota preliminare. Gortania, Atti del Museo Friul. St. Nat., Udine, 2: Sušnik S., Snoj A., Dovč P., 1999a. Microsatellites in grayling (Thymallus thymallus): comparison of two geographically remote populations from the Danubian and Adriatic river basin in Slovenia. Molecular Ecol. 8: Sušnik S., Snoj A., Dovč P., 1999b. A new set of microsatellite markers for grayling: BFRO014, BFRO015, BFRO016, BFRO017 and BFRO018. Animal Genetics 30: Sušnik S., Snoj A., Dovč P., Evolutionary distinctness of grayling (Thymallus thymallus) inhabiting the Adriatic river system, as based on mtdna variation. Biol. Journal of the Linnean Society, 74: Sušnik S., Berrebi P., Dovč P., Hansen M.M., and Snoj A., Genetic introgression between wild and stocked salmonids and the prospects for using molecular markers in population rehabilitation: the case of the Adriatic grayling (Thymallus thymallus L. 1785). Heredity 93: Tortonese E., Osteichthyes. In: Fauna d Italia. Calderoni, Bologna. - Uiblein F., Jagsch A., Kössner G., Weiss S., Gollmann P., Kainz E Untersuchungen zu lokaler Anpassung, Gefährdung und Schutz der Äsche (Thymallus thymallus) in drei Gewässern in Oberösterreich. Österreichische Fischerei 53: Uiblein F., Jagsch A., Honsig-Erlenburg W., & Weiss S., Status, habitat use, and variability of the European grayling in Austrian waters. J. Fish Biology, 59 (Suppl. A): Weiss S., Persat H., Eppe R., Schlötterer C. and Uiblein F Complex patterns of colonization and refugia revealed for European grayling Thymallus thymallus, based on complete sequencing of the mithocondrial DNA control region. Molecular Ecology, 11: Vuga A La gestione dell ittiofauna e della pesca sportiva del fiume Natisone. Quaderni ETP, 26: