Media geometrica: radice ennesima del prodotto delle n osservazioni

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1 Moda: valore a più alta frequenza Mediana: valore al di sotto del quale cadono il 50% delle osservazioni Media aritmetica: valore che corrisponde alla somma di tutti i valori diviso il numero delle osservazioni Media geometrica: radice ennesima del prodotto delle n osservazioni 1

2 Devianza (somma dei quadrati degli scarti dalla media): dove μ è la media dei dati Varianza: devianza divisa per il numero dei dati Deviazione standard: radice quadrata della varianza Da questa serie di valori: 25, 15, 18, 19, 17, calcolare la media, la devianza, la varianza, la deviazione standard, la mediana e la media geometrica 2

3 Servono per definire se 2 fenomeni osservati sono realmente diversi Quando si effettua un test di significatività statistica, inizialmente si assume la cosiddetta ipotesi zero (o ipotesi nulla ), secondo la quale non esiste nessuna differenza tra i gruppi riguardo al parametro considerato Come sempre avviene, i risultati di un test statistico non hanno un valore di assoluta e matematica certezza, ma soltanto di probabilità Pertanto, una decisione di respingere l'ipotesi zero (presa sulla base del risultato del test statistico) è probabilmente giusta, ma potrebbe essere errata La misura di questo rischio di cadere in errore si chiama livello di significatività del test 3

4 Confronto tra due percentuali Se si riesce a dimostrare che la differenza non è dovuta al caso, allora si può affermare che è «statisticamente significativa» Si deve calcolare il valore di chi-quadrato relativo alle osservazioni sperimentali fatte Per fare questo di costruisce una tabella 2x2 dove si inseriscono i valori osservati 4

5 Sulla base dei dati totali osservati si calcolano le frequenze attese e infine il valore di chi-quadrato Il chi-quadrato aumenta con l'aumentare della differenza dei dati posti a raffronto Se supera i valori prefissati (tabelle reperibili via Internet o in qualsiasi libro di statistica e sono disponibili sia per valori di p<0,05 che p< 0,01) la differenza viene ritenuta significativa (rifiuto ipotesi nulla) In caso contrario, non si può affermare l'esistenza di una significativa differenza tra i due eventi considerati (ipotesi nulla vera) 5

6 Il conteggio di cellule eseguito in prove replicate dello stesso campione ha fornito i seguenti valori (cellule/ml): A=51, B=40, C=66, D=49. Stabilire se i conteggi differiscono statisticamente o meno sapendo che il valore sperimentale del X 2 è pari a 1,47 e che i valori tabulari del X 2 con 3 gradi di libertà sono: X 2 0,05=7,51 X 2 0,01=11, 34 Confronto tra 2 medie (dati parametrici) 6

7 I calcoli da eseguire per effettuare il test t sono un più complicati rispetto a quelli del chi-quadrato, a titolo di curiosità, questa è la formula di calcolo del valore t Calcolato il valore di t si confronta con i valori tabellari del t di Student, se il valore è superiore a quello tabellare si rifiuta l'ipotesi zero e si concludere che la differenza è significativa I programmi attuali restituiscono direttamente il valore p 7

8 Un medico sportivo utilizza un particolare test per misurare la condizione fisica degli atleti. Considerato un campione casuale di giocatori di calcio costituito da 25 atleti, si rileva un punteggio medio al test pari a 47,5, con s=4,8. I manuali indicano che il punteggio medio di popolazione nel test è pari a 37,5. Verificare se il punteggio medio riscontrato nel campione è migliore di quello di popolazione considerando che t = 10,42 e che per 24 gradi di libertà con un livello di significatività pari a 0,05 il valore tabellare è di 1, Le tecniche spettroscopiche sono tutte quelle tecniche basate sull interazione tra la materia e le radiazioni elettromagnetiche Ogni radiazione, o onda elettromagnetica, è caratterizzata dai parametri: Frequenza (n) - numero di vibrazioni nell'unità di tempo Lunghezza d'onda (l) - distanza tra due punti adiacenti in fase (ad esempio tra due massimi consecutivi) Velocità di propagazione (c) - dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione (nel vuoto il suo valore è di circa 3 x 10 8 m/sec) La relazione che lega questi parametri è: l = c/n La frequenza è inversamente proporzionale alla lunghezza d onda 8

9 È utile anche considerare le radiazioni elettromagnetiche come un treno di particelle chiamate fotoni o quanti La l di una radiazione elettromagnetica è in relazione con l energia contenuta in un quanto mediante la relazione E = h n (cioè E = n/l) Energia e frequenza sono direttamente proporzionali Energia e la lunghezza d onda sono inversamente proporzionali!!!! Esistono vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia) Nome radiazione Ultravioletto (UV) Lunghezza d onda (nm) Visibile

10 L'analisi spettrofotometrica consiste in misurazione di radiazioni elettromagnetiche per ottenere informazioni sia qualitative che quantitative l'analisi dello spettro permette di individuare la natura della sostanza in esame la misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di risalire alla quantità di sostanza analizzata Principio Atomi o molecole, trovandosi in campi energetici possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia quando atomi o molecole vengono eccitati da adatte radiazioni elettromagnetiche ( hν ), passando a stati energetici maggiori, si ha il fenomeno di assorbimento quando dagli stati eccitati, ritornano allo stato fondamentale, gli atomi e le molecole emettono quanti di energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche ( hν ) si ha il fenomeno di emissione (fluorescenza) 10

11 Quando una radiazione elettromagnetica attraversa una sostanza, provocherà una transizione elettronica e la radiazione emergente dalla sostanza avrà una intensità inferiore I 0 = Intensità radiazione incidente I R = Intensità radiazione riflessa I A = Intensità radiazione assorbita I T = Intensità radiazione trasmessa I 0 = I R + I A + I T Con Trasmittanza si indica T = I T / I 0 Con Assorbanza si indica A = Log I 0 / I T La frazione della radiazione incidente (I 0 ) assorbita da una soluzione ad una data lunghezza d onda (λ) è correlata al cammino ottico (l) ed alla concentrazione (c) della specie assorbente Queste due relazioni sono combinate nella legge di Lambert e Beer Dove I = luce incidente I = luce trasmessa e = coefficiente di estinzione molare l = cammino ottico (cm) c = concentrazione Assorbanza o Densità Ottica 11

12 Il coefficiente di estinzione molare ε rappresenta l Assorbanza di una soluzione a concentrazione 1M a cammino ottico unitario (1 cm) e varia con: la natura chimica del composto il solvente la lunghezza d onda Le sue dimensioni sono M -1 cm -1 Quindi la concentrazione molare di una sostanza si calcola: C = DO/(coeff. estinzione molare x cm) I componenti essenziali sono: Sorgente di luce policromatica (tungsteno per il visibile, deuterio per l UV) Fessura d ingresso-lente (per minimizzare la luce diffusa e rendere paralleli i raggi della sorgente) Filtro o monocromatore (per selezionare una banda di l definita) Fessura d uscita Cella o cuvetta Fotomoltiplicatori (trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico) 12

13 Uno spettrofotometro lavora sia nella regione del visibile ( nm) che del vicino ultravioletto ( nm) Attenzione al materiale della cuvetta che non deve schermare i raggi UV (no vetro o plastica ma quarzo ) La parte della sostanza assorbente si chiama cromoforo Massimi di assorbimento per i solventi più comuni Singolo raggio Doppio raggio 13

14 Determinare la concentrazione di una soluzione di Mioglobina (Mb) dopo aver letto con uno spettrofotometro una assorbanza di 0,110 a 415 nm sapendo che il coefficiente di estinzione mm della Mb è 131 Determinare la concentrazione di una soluzione di emoglobina umana (Hb) dopo aver letto con uno spettrofotometro una assorbanza di 0,710 a 415 nm sapendo che il coefficiente di estinzione mm della Hb è 131 e che la soluzione iniziale è stata diluita 100 volte Determinare la concentrazione di una soluzione di emoglobina umana (Hb) dopo aver letto con uno spettrofotometro una assorbanza di 0,810 a 415 nm sapendo che il coefficiente di estinzione mm della Hb è 131 e che la soluzione iniziale è stata diluita 100 volte Il coefficiente di estinzione molare a 420 nm dell'enzima catalasi isolato da Aspergillus niger è pari a 150 mm -1 cm -1 Qual è la concentrazione molare di una soluzione dell'enzima la cui assorbanza a 420 nm è pari a 1.8 una cuvetta con un cammino ottico di 1 cm? Determinare la concentrazione di una proteina che, analizzata in una cuvetta con un cammino ottico pari a 0.5 cm, assorbe 0,54 a 280 nm, sapendo che il suo ε 280 è pari a 2x10 5 Calcolare quanto assorbirebbe in cuvetta da 1 cm una soluzione 50 μm di una proteina con estinzione a 350 nm = 30 mm -1 cm -1 14

15 Gli acidi nucleici assorbono la luce UV con un massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 260 nm (spettro di assorbimento varia da 230 nm a 280 nm) Per il dosaggio degli acidi nucleici è necessario apportare una variazione alla legge di Lambert-Beer perché è impossibile ottenere soluzioni 1M degli acidi nucleici Si usa il coefficiente di estinzione specifico K, anziché il coefficiente di estinzione molare K è stato determinato sperimentalmente ed esprime l assorbanza di una soluzione a concentrazione 1mg/1ml alla lunghezza d onda di 260 nm 15

16 Quindi (a 260 nm): conc. acido nucleico (mg/ml) = (DO/K) Oppure si può usare il coefficiente di estinzione molare medio : il coefficiente di estinzione molare degli acidi è la somma dei coefficienti di estinzione molare di ciascun nucleotide è impossibile calcolare questa somma per tutti i nucleotidi, quindi è usato un coefficiente di estinzione molare medio (concentrazione espressa in µg/ml per avere una assorbanza pari a 1con un cammino ottico di 1 cm) che è: dsdna 50 (µg/ml) -1 cm -1 ssdna 37 (µg/ml) -1 cm -1 RNA 40 (µg/ml) -1 cm -1 Quindi la concentrazione di DNA si può calcolare anche come segue: c (µg/ml) = A 260 x 50 µg/ml 16

17 L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziata mediante il calcolo dei "rapporti Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza degli acidi nucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm per in DNA il rapporto deve essere 1,6-1,8 per l'rna 1,8-2,0 rapporti inferiori indicano una contaminazione da proteine L'assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campione dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2,2 rapporti inferiori indicano contaminazione da solventi (fenolo), carboidrati, glicogeno rapporti superiori indicano che si sta usando una soluzione inappropriata per il bianco (diverso ph, diversa forza ionica...) 17

18 L analisi spettrofotometrica di una soluzione contenente DNA ha fornito i seguenti risultati: A 260 = 0,80 A 230 = 0,30 A 280 = 0,40 Determinare la purezza del DNA Calcolare la concentrazione del DNA sapendo che l assorbanza a 260 nm di 50 μg/ml è pari a 1,00 Calcolare la concentrazione di DNA a doppio filamento sapendo che la sua assorbanza a 260 nm è pari a 0,4. e se il campione viene diluito 10 volte? e se il DNA fosse a singolo filamento? Calcolare la concentrazione di DNA a doppio filamento sapendo che la sua assorbanza a 260 nm è pari a 0,055 e che il campione prima dell analisi è stato diluito 40 volte 18

19 La retta di taratura è una retta che permette di risalire alla concentrazione del composto che si vuole quantizzare Per costruire una retta di taratura si usano campioni standard Y = DO X = concentrazione Utilizzando il metodo di Bradford in un campione a concentrazione ignota di proteine è risultato un valore di assorbanza a 595 nm pari a 0,973. Calcolare la concentrazione di proteine nel campione (X) sapendo che l equazione della retta di taratura (conc = mg/ml) ottenuta con lo stesso metodo è pari a Y = 0,012x Un campione a concentrazione ignota (X) di proteine è stato diluito 50 volte e, utilizzando il metodo di Bradford per la valutazione delle proteine, si è ottenuto un valore di assorbanza a 595 nm pari a 0,012. Calcolare la concentrazione di proteine nel campione (X) sapendo che l equazione della retta di taratura (conc = mg/ml) ottenuta con lo stesso metodo è pari a Y = 0,025x-8,

20 La luminescenza è l emissione di fotoni per rilassamento da uno stato elettronico eccitato ad uno con energia inferiore in una sostanza, che viene definita fluoroforo Tipicamente si tratta di fotoni con lunghezza d onda nell intervallo dell ultravioletto visibile vicino infrarosso ( nm) Vi sono due tipi di luminescenza: la fluorescenza e la fosforescenza Nella fluorescenza il rilassamento avviene da uno stato elettronico eccitato di singoletto e si tratta di un processo molto veloce, dell ordine di 10 ns Nella fosforescenza il rilassamento avviene da uno stato elettronico eccitato di tripletto e si tratta di un processo che avviene in tempi dell ordine di 1 ms 1 s Tecnica ottica di analisi qualitativa e quantitativa basata sul fenomeno della fluorescenza 20

21 Il fluorimetro è composto da: una sorgente di luce per l eccitazione del campione (lampada ad arco allo Xe che emette in tutto l intervallo UV-visibile) un monocromatore ed una fenditura per selezionare solo l intervallo di lunghezza d onda di eccitazione desiderato l alloggiamento portacampioni (celle da fluorescenza a sezione quadrata con 1 cm di cammino ottico) il rivelatore (solitamente consiste in un fototubo o, in alcuni casi, in un fotodiodo) le misure di fluorescenza sono riportate su una scala di intensità verso lunghezza d onda (in nm) oppure verso energia (in ev o, più raramente, in cm -1). La scala di intensità è in unità arbitrarie e non assolute L intensità di fluorescenza dipende da: Concentrazione di fluoroforo Efficienza dell assorbimento di radiazione (e) Efficienza dell emissione radiativa (resa quantica, ) resa quantica Intensità della lampada Efficienza dei monocromatori Banda passante utilizzata Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore fotoni emessi fotoni assorbiti 21

22 Quindi l intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche dallo strumento con cui è stata determinata Per effettuare misure quantitative della radiazione emessa, ovvero per misurare la resa quantica di fluorescenza, si deve confrontare lo spettro di emissione del campione con quello di uno standard fluorescente di cui si conosca la concentrazione e la resa quantica di emissione Al contrario, l assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)] la resa quantica è una misura assoluta Molecole fluorescenti usate in biologia 22

23 L assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no Sensibilità del cromoforo fluorescente molto maggiore all ambiente (processi non radiativi) Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elettrico Fattori che influenzano la separazione: Natura del supporto Campo elettrico applicato Caratteristiche della particella: massa carica dimensioni forma 23

24 Un apparato per elettroforesi è costituito da: alimentatore camera elettroforetica (orizzontale o verticale) supporto solido poroso (su carta da filtro o acetato di cellulosa) su gel (poliacrilammide o agarosio) Su carta Su gel 24

25 Preparazione gel d agarosio Posizionamento del gel nella camera elettroforetica Aggiunta del tampone elettroforetico Caricamento del campione Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel, contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa Avvio della corsa elettroforetica Si utilizza tampone a ph alcalino (valori intorno a 8,4) in modo che le proteine migrino verso l anodo con una velocità che è direttamente proporzionale alla carica elettrica globale di ogni molecola e inversamente proporzionale alla massa di questa Finita la migrazione le strisce vengono rimosse dalla vasca asciugate e colorate (15 minuti in una soluzione di rosso Ponceau, lavaggi con una miscela di acido acetico- metanolo e diafanizzazione) 25

26 Analisi al densitografo integratore strumento in grado di trasformare in ampiezza ed in altezza di una curva le differenze d intensità e di larghezza delle bande colorate che costituiscono il tracciato Il termine di integratore indica la possibilità che ha lo strumento di calcolare l area di ogni singola zona della curva densitometrica Un sistema elettromeccanico fa scorrere lentamente la striscia sotto una lampada a luce monocromatica ed i raggi di questa passati attraverso il supporto con le bande vanno a colpire il sensore di un colorimetro Le variazioni di estinzione percepite dal colorimetro vengono amplificate e trasformate nella curva o tracciato elettroforetico che si osserva nei referti 26

27 Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro) Il gel e messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l elettrodo positivo Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l elettrodo positivo e si legano alla membrana Fatto a 4 C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo Serve per: Identificare con sicurezza una proteina Quantificare la concentrazione della proteina La PCR è una metodica sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere grosse quantità di materiale genetico a partire da piccole quantità La permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero bersagli molto rari in un genoma complesso: 100mila geni Una zona specifica di DNA viene bersagliata con due oligo (3 rivolti l uno verso l altro) che amplificano, tramite la reazione polimerasica, la zona stessa copiandola in un enorme numero di volte e rendendola visibile e manipolabile per l analisi Elementi necessari alla reazione: Due tipi di oligonucleotidi complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai lati della regione che si vuole amplificare (primers) polimerasi termostabile (non viene denaturata se portata a 95 c) i 4 desossinucleotidi trifosfati DNA stampo che contenga la regione da amplificare Si usa una Taq polimerasi 27

28 Al termine gli amplificati vengono caricati in un gel di agarosio e sottoposti ad elettroforesi per visualizzare i prodotti di amplificazione Utilizzata per: Indagini rapide di identificazioni virali o batteriche In ambito giuridico, antropologico ecc In generale i metodi prevedono: l estrazione del DNA dai campioni in studio la digestione del DNA con 1 o più enzimi di restrizione, che generano centinaia di frammenti (il numero è in relazione all enzima di restrizione utilizzato che può essere a taglio frequente o a taglio non frequente ) la separazione dei frammenti attraverso elettroforesi Poiché ceppi dello stesso clone contengono sequenze di DNA praticamente identiche, ugualmente identici saranno i siti di restrizione, e alla elettroforesi forniranno profili di migrazione sovrapponibili 28

29 Le varie tecniche generano un fingerprinting molecolare che assume le sembianze di un codice a barre, il numero delle quali dipende dal tipo di tecnica utilizzata L'identificazione di un isolato batterico ignoto avviene mediante confronto con il codice a barre ottenuto con uno o più ceppi tipo 29

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