Definizione del profilo biomolecolare su campioni citologici
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1 Patologia nodulare della tiroide: focus sugli approcci diagnostici Definizione del profilo biomolecolare su campioni citologici Dr.ssa Michela Visani, BSc, PhD Laboratorio di Patologia Molecolare AUSL Bologna Istituto Oncologico F. Adarii - Policlinico S. Orsola, viale Ercolani 4/2 - Bologna Bologna, 18 Aprile 2018
2 Profilo biomolecolare: principali alterazioni delle lesioni tiroidee Acquaviva et al., Molecular pathology of thyroid tumours of follicular cells: a review of genetic alterations and their clinicopathological Relevance. Histopathology 2017 DOI: /his.13380
3 Profilo biomolecolare: principali alterazioni delle lesioni tiroidee Acquaviva et al., Molecular pathology of thyroid tumours of follicular cells: a review of genetic alterations and their clinicopathological Relevance. Histopathology 2017 DOI: /his.13380
4 Profilo biomolecolare: quando viene richiesto AIOM Linee guida Tumori della Tiroide Ottobre In caso di citologia dubbia (III-IV/Thy3a o Thy3f/TRI3A-TIR3B): ausilio diagnostico - In caso di sospetta lesione maligna (V/Thy4/TIR4 o VI/Thy5/TIR5): ausilio prognostico/predittivo o di aiuto nel management clinico del paziente
5 Profilo biomolecolare: quali tecniche possono essere utilizzate PCR Mutazioni specifiche Solo mutazioni prestabilite Rapide e poco lab-intensive IIC (POSITIVO/NEGATIVO) Solo mutazioni prestabilite Non su FNA diretti/strisci Metodiche rapide e non richiedono apparecchiature supplementari Sequenziamento classico Tutte le mutazioni Diversi marker analizzati Lab intensive
6 Profilo biomolecolare: quali tecniche possono essere utilizzate GEC (Gene Expression Classifier) Afirma GEC: espressione mrna, microarray technology Costoso Next generation sequencing (NGS) Pannelli genici ristretti (es. custom panel or ThyGenX 8 geni) Pannelli genici ampliati (es. custom panel or ThyroSeq.v2 14 geni) Costoso (in base al lab-throughput) Lab intensive
7 Profilo biomolecolare: materiale di partenza - Citologico diretto dedicato alle indagini molecolari - Citologico striscio: vetro dedicato per le analisi molecolari o lo stesso utilizzato per diagnosi citologica - Cell block
8 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Citologico diretto PRO DNA di buona qualità (fissativo Etanolo assoluto) Processazione immediata del campione Analisi molecolare in parallelo a quella citologica CONTRO Non si ha cognizione delle cellule analizzate (stima basandosi su strisci usati per la diagnosi anatomo-patologica)
9 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Citologico striscio PRO Analisi effettuata direttamente sul vetro usato per la diagnosi E possibile la valutazione del campione: selezione dell area, calcolo della % di arricchimento E possibile effettuare sia metodiche estrattive che in situ (ISH)
10 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Citologico striscio la selezione Il numero di cellule analizzabili corrisponde esattamente a quelle osservate sul vetro scelto per lo studio molecolare Numero di cellule lesionali nell area da microdissezionare > <100 Rapporto cellularita tumorale/non tumorale nell area da microdissezionare (raccomandazione di riferimento >50%): 70%
11 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Citologico striscio dissezione manuale ESTRAZIONE DNA
12 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Citologico striscio PRO Analisi effettuata direttamente sul vetro usato per la diagnosi E possibile la valutazione del campione: selezione dell area, calcolo della % di arricchimento E possibile effettuare sia metodiche estrattive che in situ (ISH) CONTRO Bisogna attendere che si stacchi il coprioggetto Il materiale citologico viene esaurito per effettuare l analisi molecolare (può essere utile prevedere uno striscio dedicato per l analisi molecolare)
13 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Citologico striscio Diagnosi citologica: sospetto per carcinoma papillifero (V/Thy4/TIR4) Molecolare: mutazione BRAF p.v600e Diagnosi istologica: carcinoma papillero Diagnosi citologica: sospetto per neoplasia follicolare (IV/Thy3f/TIR3B) Molecolare: mutazione NRAS p.q61r Diagnosi istologica: carcinoma follicolare
14 Profilo biomolecolare: materiale di partenza Cell Block PRO E possibile valutare il materiale analizzato E possibile la valutazione del campione: selezione dell area, calcolo della % di arricchimento E possibile effettuare sia metodiche estrattive che in situ (ISH/ICC) CONTRO Importante che ci sia sufficiente materiale per effettuare la diagnosi anatomo-patologica
15 Campioni paucicellulati: considerazioni e accorgimenti Una quantità di cellule sufficienti per una diagnosi o un sospetto morfologico non necessariamente corrisponde ad una quantità adeguata per l analisi molecolare.
16 Campioni paucicellulati: considerazioni e accorgimenti
17 Campioni paucicellulati: considerazioni e accorgimenti Campione mutato Test altamente sensibile
18 Campioni paucicellulati: considerazioni e accorgimenti Campione mutato Campione WT (FN) Test altamente sensibile Test poco sensibile
19 Campioni paucicellulati: considerazioni e accorgimenti Meno cellule di partenza Minor input di DNA Cercare di usare una tecnica di analisi che risenta il meno possibile di una bassa quantità di DNA e che non richieda alta concentrazione di partenza Utilizzare tecniche con alta sensibilità analitica: per poter garantire la detection di mutazioni a basse % se il campione di partenza non è molto arricchito
20 La nostra esperienza Laboratorio di Patologia Molecolare, AUSL Bologna Materiali di partenza: citologici diretti, citologici strisci, cell block, campioni paraffinati Tecnica utilizzata: Next Generation sequencing Profilo biomolecolare: custom somatic panel BRAF K-RAS H-RAS N-RAS TERT TP53 PIK3CA PTEN EIF1AX
21 Grazie per l attenzione Dr.ssa Michela Visani, BSc, PhD Laboratorio di Patologia Molecolare AUSL Bologna Istituto Oncologico F. Adarii - Policlinico S. Orsola, viale Ercolani 4/2 - Bologna michela.visani@unibo.it Responsabile: Prof. Giovanni Tallini, MD, PhD Scuola di Medicina e Chirurgia Università di Bologna - Dipartimento DIMES Laboratorio di Patologia Molecolare AUSL Bologna Istituto Oncologico F. Adarii - Policlinico S. Orsola viale Ercolani 4/2 - Bologna
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