Manuale di laboratorio WHO per l esame del liquido seminale QUINTA EDIZIONE

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1 Manuale di laboratorio WHO per l esame del liquido seminale QUINTA EDIZIONE

2 Manuale di laboratorio WHO per l esame del liquido seminale QUINTA EDIZIONE Traduzione del WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, fifth edition, a cura della Società Italiana di Andrologia e Medicina della Sessualità (SIAMS)

3 WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, fifth edition, pubblicato dall Organizzazione Mondiale della Sanità, Organizzazione Mondiale della Sanità, Il Direttore Generale dell Organizzazione Mondiale della Sanità ha concesso i diritti di traduzione e pubblicazione per l edizione italiana alla SIAMS che è la sola responsabile per l edizione italiana. Manuale di laboratorio WHO per l esame del liquido seminale, quinta edizione. Società Italiana di Andrologia e Medicina della Sessualità (SIAMS), Tutti i diritti sono riservati. Le pubblicazioni dell Organizzazione Mondiale della Sanità possono essere ottenute da WHO Press, World Health Organization, 20 Avenue Appia, 1211 Ginevra 27, Svizzera (tel.: ; fax: , bookorders@who.int). Le richieste di autorizzazione a riprodurre o tradurre le pubblicazioni WHO sia per la vendita che per la distribuzione non commerciale devono essere indirizzate a WHO Press, all indirizzo sopra indicato (fax: ; permissions@who.int). Le denominazioni usate e la presentazione del materiale in questa pubblicazione non implicano l espressione di qualsiasi opinione da parte dell Organizzazione Mondiale della Sanità, relativa allo status giuridico di qualsiasi paese, territorio, città o area o delle sue autorità, o relative alla delimitazione delle loro frontiere o confini. Le linee tratteggiate sulle cartine rappresentano linee di confine approssimative per le quali potrebbe non esserci pieno accordo. La menzione di specifiche aziende o di prodotti di determinati costruttori non implica che essi siano approvati o raccomandati dall Organizzazione Mondiale della Sanità rispetto ad altri della stessa natura che non sono menzionati. Salvo errori e omissioni, i nomi dei prodotti di proprietà si distinguono per la lettera iniziale maiuscola. Tutte le precauzioni necessarie sono state prese dall Organizzazione Mondiale della Sanità per verificare le informazioni contenute nella presente pubblicazione. Tuttavia, il materiale pubblicato viene distribuito senza garanzie di alcun tipo, sia espressa che implicita. La responsabilità per l interpretazione e per l uso del materiale spetta al lettore. In nessun caso l Organizzazione Mondiale della Sanità è responsabile per i danni derivanti dal suo uso. Finito di stampare nel dicembre 2010 per i tipi della Eurolit, Roma. Si ringrazia per il gentile contributo dato alla realizzazione di questo manuale il Centro Interuniversitario di Andrologia Sperimentale (CASPER).

4 III INDICE Ringraziamenti XII Acronimi e abbreviazioni usati in questo manuale XIV Capitolo 1 Stato dell arte Introduzione La quinta edizione Scopo del manuale 3 PARTE I. ANALISI DEL LIQUIDO SEMINALE Capitolo 2 Procedure standard Introduzione Raccolta del campione seminale Preparazione Raccolta del campione a fini diagnostici o di ricerca Raccolta in contenitore sterile per la riproduzione assistita Raccolta in contenitore sterile per analisi microbiologica Raccolta del campione a casa Raccolta del campione con profilattico Sicurezza nella manipolazione dei campioni Valutazione macroscopica iniziale Fluidificazione Viscosità del liquido seminale Aspetto dell eiaculato Volume del liquido seminale ph del liquido seminale Valutazione microscopica iniziale Accurato miscelamento del campione e prelevamento di aliquote rappresentative dell intero campione seminale Allestimento del preparato a fresco Aggregazione nemaspermica Agglutinazione nemaspermica Componente cellulare non nemaspermica Motilità nemaspermica Categorie di movimento nemaspermico Preparazione e valutazione di un campione per la motilità Esempi Limiti inferiori di riferimento Vitalità nemaspermica Test di vitalità mediante eosina-nigrosina Test di vitalità con l utilizzo della sola eosina Test di vitalità mediante l uso del rigonfiamento iposmotico Concentrazione nemaspermica Tipi di camere di conta Emocitometro di Neubauer modificato Utilizzo della griglia dell emocitometro 36

5 IV Manutenzione della camera di conta Fissativo per la diluizione del liquido seminale Importanza di una conta sufficiente di spermatozoi Procedura di conta di routine Determinazione della diluizione richiesta Preparazione delle diluizioni e caricamento delle camere emocitometriche Valutazione del numero di spermatozoi nelle camere di conta Calcolo della concentrazione degli spermatozoi nel liquido seminale Esempi Limiti di riferimento inferiori per la concentrazione degli spermatozoi Calcolo del numero totale di spermatozoi nell eiaculato Limiti di riferimento inferiori per la concentrazione totale degli spermatozoi Numero di spermatozoi basso: criptozoospermia e sospetto di azoospermia Quando non è necessaria una valutazione accurata del basso numero di spermatozoi Casi che non richiedono ulteriori valutazioni Valutazione dei campioni centrifugati per identificare gli spermatozoi Esame dei campioni non centrifugati per identificare spermatozoi mobili Quando è richiesta una accurata valutazione di un basso numero di spermatozoi Valutazione di bassi numeri di spermatozoi nell intera camera Neubauer modificata (con microscopio a contrasto di fase) Valutazione di bassi numeri di spermatozoi in vetrini monouso per grandi volumi (microscopia a fluorescenza) Conta delle cellule non nemaspermiche Calcolo della concentrazione delle cellule rotonde nel liquido seminale Sensibilità del metodo Esempi Morfologia nemaspermica Il concetto di spermatozoi normali Preparazione degli strisci seminali Metodi di colorazione Fissazione tradizionale e colorazione sequenziale Procedimento di colorazione Papanicolaou per la morfologia nemaspermica Procedura di colorazione Shorr per la morfologia nemaspermica Procedura di colorazione rapida per la morfologia nemaspermica Esame delle preparazioni colorate Classificazione della normale morfologia nemaspermica Classificazione della morfologia degli spermatozoi atipici Tavole della morfologia Analisi morfologica di uno striscio di liquido seminale Valutazione della normale morfologia degli spermatozoi Esempi pratici Limite di riferimento inferiore Valutazione della morfologia degli spermatozoi atipici Esempi Valutazione di particolari difetti degli spermatozoi 106

6 V 2.18 Valutazione dei leucociti nel liquido seminale Colorazione della perossidasi cellulare mediante o-toluidina Valutazione delle cellule germinali immature nel liquido seminale Analisi degli antigeni di superficie degli spermatozoi Mixed antiglobulin reaction test L IBT diretto L IBT indiretto 118 Capitolo 3 Procedure facoltative Indici di difetti multipli degli spermatozoi Calcolo degli indici di difetti morfologici multipli Esempio Colorazione immunocitochimica per i globuli bianchi (CD45) Principi Reagenti Procedura Interazione fra spermatozoi e muco cervicale Test in vivo (post-coital test) Test in vitro Test in vitro semplificato Test del capillare Saggi biochimici per la funzione delle ghiandole accessorie Misurazione dello zinco nel plasma seminale Dosaggio del fruttosio nel plasma seminale Dosaggio dell alfa-glucosidasi neutra nel plasma seminale Analisi computerizzata del liquido seminale Introduzione Uso del CASA per valutare la motilità nemaspermica Uso del CASA per valutare la concentrazione di spermatozoi Valutazione morfometrica computerizzata dello spermatozoo 146 Capitolo 4 Procedure di ricerca Specie reattive dell ossigeno Introduzione Misurazione delle specie reattive dell ossigeno generate da sospensione di spermatozoi Test di interazione fra spermatozoo e ovocita Test di legame alla zona pellucida Valutazione della reazione acrosomiale Procedura mediante fluorescenza per la valutazione dello status acrosomiale Test per la reazione acrosomiale indotta Hamster test Protocollo Valutazione della cromatina nemaspermica 164 PARTE II. PREPARAZIONE DEGLI SPERMATOZOI Capitolo 5 Tecniche di preparazione degli spermatozoi Introduzione 167

7 VI Quando gli spermatozoi devono essere separati dal plasma seminale Scelta del metodo Efficienza di separazione degli spermatozoi dal plasma seminale e da organismi infettivi Principi generali Lavaggio semplice Reagenti Procedura Swim-up diretto Reagenti Procedura Gradienti discontinui di densità Reagenti Procedure Preparazione di campioni seminali con infezione da HIV Preparazione di spermatozoi testicolari e dell epididimo Metodo enzimatico Metodo meccanico Preparazione delle sospensioni di spermatozoi per l iniezione intracitoplasmatica Preparazione di campioni da eiaculazione retrograda Preparazione di campioni con eiaculazione stimolata 175 Capitolo 6 Crioconservazione di liquido seminale Introduzione Protocolli di crioconservazione del liquido seminale Procedura standard Protocolli di congelamento modificati per campioni oligozoospermici e spermatozoi recuperati chirurgicamente Codifica delle paillettes e registrazione 183 PARTE III. L ASSICURAZIONE DI QUALITÀ Capitolo 7 Assicurazione di qualità e controllo di qualità Controllo di qualità nel laboratorio di andrologia La natura degli errori nell analisi del liquido seminale Ridurre al minimo l errore di campionamento statistico Il programma di assicurazione di qualità Il manuale delle procedure di laboratorio Il controllo di qualità interno Campioni per il QC acquistati Campioni per il QC realizzati in laboratorio Campioni conservati (acquistati o prodotti in laboratorio) Campioni freschi per il QC (prodotti in laboratorio) Procedure statistiche di analisi e registrazione degli errori sistematici intra e inter seminologi La carta X bar La carta S QC per le percentuali Valutazione delle carte X bar e S 198

8 VII Come riconoscere i valori fuori controllo Cause di valori fuori controllo Risposte ai valori fuori controllo Procedure statistiche per l analisi e la registrazione della variabilità fra seminologi Comparare i risultati tra due o più seminologi Controllo mensile delle medie Controllo e assicurazione di qualità esterni Valutazione dei risultati EQC Le risposte ai risultati fuori del controllo Frequenza e priorità del controllo di qualità Addestramento Consigli pratici per quando si incontrano difficoltà nel valutare la concentrazione degli spermatozoi Consigli pratici quando si verificano difficoltà nel valutare la morfologia degli spermatozoi Consigli pratici in caso di difficoltà nella valutazione della motilità degli spermatozoi Consigli pratici quando si verificano difficoltà nel valutare la vitalità degli spermatozoi 213 BIBLIOGRAFIA 217 APPENDICI Appendice 1 Valori di riferimento e nomenclatura seminale 235 A1.1 Valori di riferimento 235 A1.2 Nomenclatura 237 Appendice 2 Attrezzature e sicurezza 239 A2.1 Forniture di base necessarie in un laboratorio di andrologia 239 A2.2 Possibili rischi biologici in un laboratorio di andrologia 242 A2.3 Procedure di sicurezza per il personale di laboratorio 242 A2.4 Procedure di sicurezza per le apparecchiature di laboratorio 244 A2.5 Procedure di sicurezza per la manipolazione dell azoto liquido 245 Appendice 3 Microscopia 247 A3.1 Allestimento del campione 247 A3.2 Regolazione degli oculari 249 A3.3 Messa a fuoco dell immagine 249 A3.4 Messa a fuoco degli oculari 250 A3.5 Messa a fuoco del condensatore di luce 250 A3.6 Centratura del condensatore 250 A3.7 Regolazione degli anelli di fase 251 A3.8 Microscopia a fluorescenza 251 Appendice 4 Soluzioni madre 252 A4.1 Biggers, Whitten e Whittingham 252

9 VIII A4.2 Tampone fosfato salino Dulbecco 252 A4.3 Soluzione di Earle 253 A4.4 Soluzione di Ham F A4.5 Soluzione salina bilanciata di Hanks 254 A4.6 Fluido tubarico umano 254 A4.7 Terreno Krebs-Ringer 255 A4.8 Soluzione salina Tris tamponata 255 A4.9 Soluzione di Tyrode 255 A4.10 Colorante Papanicolaou 255 Appendice 5 Muco cervicale 260 A5.1 Introduzione 260 A5.2 Raccolta e conservazione del muco cervicale 261 A5.3 Valutazione del muco cervicale 262 Appendice 6 Scheda di registrazione per l analisi del liquido seminale e del muco cervicale 266 A6.1 Modello di registrazione di analisi del liquido seminale 266 A6.2 Modello di registrazione del muco cervicale 268 Appendice 7 Errori di campionamento e controllo di qualità 269 A7.1 Errori nella misurazione della concentrazione di spermatozoi 269 A7.2 L importanza di comprendere gli errori di campionamento 271 A7.3 Errori nella misurazione delle percentuali 272 A7.4 Produzione di campioni seminali per il controllo di qualità 276 A7.5 Preparazione di una video-registrazione per il controllo di qualità interno dell analisi della motilità spermatica 277 A7.6 Preparazione del seme diluito per il controllo di qualità interno e determinazione della concentrazione di spermatozoi 281 A7.7 Preparazione dei vetrini per il controllo di qualità interno per la valutazione della morfologia nemaspermica 285 A7.8 Taratura delle apparecchiature 287 Appendice 8 Programmi nazionali di controllo di qualità esterno per l analisi del liquido seminale 289 FIGURE Fig. 2.1 Variazione nella concentrazione di spermatozoi per eiaculato e per ml in un periodo di oltre un anno e mezzo 9 Fig. 2.2 Aggregazione non-specifica di spermatozoi nel liquido seminale 20 Fig. 2.3 Schema delle diverse localizzazioni delle agglutinazioni nemaspermiche 21 Fig. 2.4 Supporti alla valutazione della motilità 25 Fig. 2.5 Striscio con colorazione eosina nigrosina osservato al microscopio ottico in campo chiaro 29 Fig. 2.6 Rappresentazione schematica delle tipiche modificazioni morfologiche in spermatozoi umani sottoposti a stress iposmotico 33 Fig. 2.7 Emocitometro di Neubauer modificato 36 Fig. 2.8 Quali spermatozoi contare nei quadrati della griglia 37

10 IX Fig. 2.9 Valutazione dell intero vetrino coprioggetto per la presenza di spermatozoi mobili 49 Fig Spermatozoi morfologicamente normali 60 Fig Metodi di striscio seminale per la morfologia nemaspermica 61 Fig Preparazione di uno striscio di un liquido seminale normale 62 Fig Disegni schematici di alcune forme atipiche di spermatozoi umani 73 Fig Cellule perossidasi-positive e negative in liquido seminale umano 109 Fig. 3.1 Leucociti in liquido seminale 125 Fig. 3.2 La scala di valutazione per il test di Kremer 133 Fig. 3.3 Terminologia standard per le variabili misurate dai sistemi CASA 145 Fig. 4.1 Chemioluminescenza generata in risposta a trattamento con zimosan opsonizzato 151 Fig. 4.2 Rispettivi contributi delle sottopopolazioni di leucociti e spermatozoi alla capacità di generare specie reattive dell ossigeno da parte di sospensioni cellulari 152 Fig. 4.3 Colorazione degli spermatozoi umani mediante agglutinina fluorescente Pisum sativum (PSA) 156 Fig. 4.4 Microfotografia a contrasto di fase di un ovocita di hamster contenente spermatozoi umani 164 Fig. 7.1 Un diagramma X bar per la concentrazione degli spermatozoi 196 Fig. 7.2 Un diagramma S per la concentrazione degli spermatozoi 198 Fig. 7.3 Una carta Bland-Altman di stime manuali e col sistema CASA della percentuale progressiva di motilità spermatica 201 Fig. 7.4 Un grafico di Youden per la stima delle concentrazioni degli spermatozoi 202 Fig. A2.1 Nomogramma per la determinazione della forza centrifuga relativa (RCF) a partire dal raggio del rotore e dalla velocità di rotazione 243 Fig. A5.1 Esempi di cristallizzazione a foglia di felce nel muco cervicale essiccato all aria su vetrino 261 Fig. A7.1 Differenze accettabili tra due conte replicate in una funzione del numero totale di spermatozoi valutati 270 Fig. A7.2 Le differenze accettabili tra le percentuali replicate sono funzione della percentuale vera e del numero totale di spermatozoi valutati 274 Fig. A7.3 Supporto alla valutazione della motilità degli spermatozoi 280 Fig. A7.4 Vista attraverso un oculare con reticolo (reticolo rosso) 280 Fig. A7.5 Immagine video-registrata del micrometro sul monitor e la sovrapposizione dei tratti 281 RIQUADRI Riquadro 2.1 Conferma della qualità del contenitore in cui è stato raccolto il campione 11 Riquadro 2.2 Preparazione della bromelina 15 Riquadro 2.3 Accurato miscelamento del liquido seminale 19 Riquadro 2.4 Spessore del preparato a fresco 19 Riquadro 2.5 Errori nella valutazione delle percentuali 26 Riquadro 2.6 Confronto tra percentuali di replicati 26 Riquadro 2.7 Errori nella valutazione del numero 38 Riquadro 2.8 Ottenere una conta di 200 spermatozoi per replicati nelle tre griglie centrali della camera Neubauer modificata 39 Riquadro 2.9 Volume osservato per pcv in una preparazione a fresco con spessore di 20 μm 40

11 X Riquadro 2.10 Confronto tra conte replicate 44 Riquadro 2.11 Ottenere 200 spermatozoi per replicato in tutte le 9 griglie della camera Neubauer modificata 50 Riquadro 2.12 Ottenere 200 spermatozoi per replicato in una camera monouso per volumi grandi di 100 μm di profondità. 54 Riquadro 2.13 Volume osservato per campo visivo in una camera monouso a grande volume, 100 μm di profondità 56 Riquadro 2.14 Mezzi di montaggio 65 Riquadro 3.1 Preparazione della cera di vaselina 128 Riquadro 3.2 Volume osservato per campo visivo in una preparazione di muco cervicale di profondità 100 μm 128 Riquadro 4.1 Induzione dell ovulazione in hamster 161 Riquadro 4.2 Preparazione di pipette di vetro 162 Riquadro 6.1 Motivi per la crioconservazione degli spermatozoi 177 Riquadro 6.2 Valutazione del rischio della crioconservazione e dello stoccaggio del liquido seminale umano 178 Riquadro 7.1 Terminologia nell assicurazione e nel controllo di qualità 188 Riquadro 7.2 Determinazione dei valori per i limiti di controllo di azione e di allarme di una carta X bar 195 Riquadro 7.3 Metodo alternativo per il calcolo dei limiti di controllo X bar dall insieme delle deviazioni standard 196 Riquadro 7.4 Determinazione dei valori per i limiti di controllo di allarme e di azione di una carta S 197 Riquadro 7.5 Regole di controllo di base per le carte QC 199 Riquadro 7.6 Valutazione delle differenze sistematiche tra seminologi 204 Riquadro 7.7 Principali caratteristiche delle procedure IQC 205 Riquadro 7.8 Calendario per il controllo di qualità 207 Riquadro 7.9 Sommario dei test QC 208 Riquadro A2.1 Calcolo forze centrifughe 242 Riquadro A3.1 L obiettivo 248 Riquadro A5.1 Misurare il volume del muco raccolto 263 Riquadro A5.2 Volume di un preparato di muco profondo 100 μm osservato al microscopio con un obiettivo a 40x 264 TABELLE Tabella 2.1 Differenze accettabili tra due percentuali medie, determinate da conte replicate di 200 spermatozoi (400 spermatozoi totali contati) 26 Tabella 2.2 Errori di conta arrotondati (%) secondo il numero totale di spermatozoi contati 38 Tabella 2.3 Diluizioni necessarie del liquido seminale, modalità di preparazione, camere da utilizzare, potenziali aree da valutare 40 Tabella 2.4 Differenze accettabili tra due conte replicate relative ad una data somma 43 Tabella 2.5 Differenza accettabile tra due conte per una data somma: basse concentrazioni 52 Tabella 2.6 Spiegazioni utilizzate nei commenti alle Tavole Tabella 2.7 Quantità di liquido seminale da utilizzare per l Immunobead test 116 Tabella 3.1 Calcolo degli indici dei difetti multipli degli spermatozoi 121

12 XI Tabella 3.2 Indici dei difetti nemaspermici da uomini di coppie fertili e infertili 122 Tabella 3.3 Grado di densità di penetrazione degli spermatozoi 134 Tabella 3.4 Classificazione dei risultati del test del capillare 135 Tabella 7.1 Fattori per la determinazione dei limiti di controllo per le carte X bar e S basati sulla deviazione standard media (S bar ) 195 Tabella 7.2 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della concentrazione nemaspermica e soluzioni proposte 209 Tabella 7.3 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della morfologia degli spermatozoi e soluzioni proposte 211 Tabella 7.4 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della motilità degli spermatozoi e soluzioni proposte 212 Tabella 7.5 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della vitalità degli spermatozoi e soluzioni proposte 213 Tabella A1.1 Valori di riferimento minimi delle caratteristiche seminali (5 percentile e intervallo di confidenza del 95%) 236 Tabella A1.2 Distribuzione dei valori per i parametri seminali relativi a uomini le cui partner sono entrate in gravidanza entro 12 mesi dalla sospensione dell uso di metodi contraccettivi 237 Tabella A1.3 Nomenclatura seminale 238 Tabella A7.1 Differenze accettabili tra 2 conte replicate relative ad una data somma 271 Tabella A7.2 Differenze accettabili tra due percentuali medie, derivate da conte replicate di 100 spermatozoi (200 contati) 275 Tabella A7.3 Differenze accettabili tra due percentuali medie, derivate da conte replicate di 200 spermatozoi (400 contati) 275 Tabella A7.4 Differenze accettabili tra due percentuali medie, derivate da conte replicate di 400 spermatozoi (800 contati) 276

13 XII Ringraziamenti Questa pubblicazione è stata prodotta dalla UNDP / UNFPA / WHO / Programma Speciale di Ricerca, Sviluppo e Formazione in Riproduzione Umana (HRP) della Banca Mondiale, dall OMS Dipartimento di Salute Riproduttiva e Ricerca (RHR). Per la partecipazione nella preparazione e redazione di questo manuale si ringraziano le seguenti persone: Editor Dr Trevor G Cooper Centre of Reproductive Medicine and Andrology of the University, Münster, Germany (WHO Collaborating Centre for Research in Male Reproduction) Team editoriale Dr John Aitken Biological Sciences School of Life and Environmental Sciences University Drive Callaghan, New South Wales, Australia Dr Jacques Auger Service de Biologie de la Réproduction Pavillon Cassini Hôpital Cochin Paris, France Dr HW Gordon Baker University of Melbourne Department of Obstetrics and Gynaecology Royal Women s Hospital Carlton, Victoria, Australia Dr Chris LR Barratt Division of Maternal and Child Health Sciences The Medical School Ninewells Hospital Dundee, Scotland Dr Hermann M Behre Centre for Reproductive Medicine and Andrology Martin-Luther-University Halle, Germany Dr Lars Björndahl Andrology Centre, Karolinska University Hospital and Institute, Stockholm, Sweden Ms Charlene Brazil Center for Health and the Environment University of California Davis, CA, USA Dr Christopher De Jonge University of Minnesota Reproductive Medicine Center Minneapolis, MN, USA Dr Gustavo F Doncel CONRAD Department of Obstetrics and Gynecology Eastern Virginia Medical School Norfolk, VA, USA Dr Daniel Franken Department of Obstetrics and Gynaecology Tygerberg Hospital Tygerberg, South Africa Dr Trine B Haugen Faculty of Health Sciences Oslo University College Oslo, Norway Dr Aucky Hinting Andrology Unit, Department of Biomedicine School of Medicine Airlangga University, Surabaya, Indonesia

14 XIII Mr Godwin E Imade Department of Obstetrics and Gynaecology Faculty of Medical Sciences University of Jos Jos, Nigeria Dr Thinus F Kruger Reproductive Biology Unit Stellenbosch University Tygerberg, South Africa Dr Hesbon O Odongo Department of Zoology University of Nairobi Nairobi, Kenya Ms Elizabeth Noonan Fred Hutchinson Cancer Research Center Statistical Center for HIV/AIDS Research and Prevention Seattle, WA, USA Dr Steven M Schrader National Institute for Occupational Safety and Health Centers for Disease Control and Prevention Cincinnati, OH, USA Dr Christina CL Wang Harbor-UCLA Medical Center Torrance, CA, USA Dr William Shu-Biu Yeung Department of Obstetrics and Gynaecology University of Hong Kong Hong Kong SAR, China Segreteria WHO, Dipartimento di Salute Riproduttiva e Ricerca Dr Kirsten M Vogelsong Scientist Research Area Manager Dr Sigrid von Eckardstein Former Acting Research Area Manager Dr Michael T Mbizvo Direttore ad interim Ms Maud Keizer Segretario Ulteriori ringraziamenti vanno a: Ms Cathy Treece, Ms Charlene Tollner e il Professor Jim Overstreet (University of California, Davis, CA, USA) per la produzione di fotografie della morfologia e il controllo dei terreni di coltura; al Dr Rune Eliasson (Sophiahemmet Hospital, Stockholm, Sweden) per l aiuto nella definizione di cellule non nemaspermiche; al Dr Timothy Farley (World Health Organization, Geneva, Switzer land) per la revisione delle sezioni sul controllo di qualità; e al Dr Gary N Clarke (The Royal Women s Hospital, Carlton, Australia), al Dr Roelof Menkveld (Tygerberg Academic Hospital and University of Stellenbosch, Tygerberg, South Africa), e al Professor Pieter Wranz (University of Stellen bosch, Tygerberg, South Africa) per aver fornito ulteriori informazioni utilizzate nella compilazione del manuale. Si ringrazia la Società Internazionale di Andrologia per il sostegno finanziario. Questa edizione del manuale è dedicata alla memoria del compianto Geoffrey Waites ( ), ex direttore del WHO Task Force sui metodi di regolazione della fertilità maschile e coeditore della seconda, terza e quarta edizione di questo manuale di laboratorio. La devozione del comitato editoriale per la sua missione era guidata dall apprezzamento per l onestà, l equità e l impegno per i bisognosi di Geoff.

15 XIV Acronimi e abbreviazioni usati in questo manuale Ab AI AID AIH ALH ANOVA APAAP AR ART ASA BAEE BCF BSA BWW CASA CASMA CBAVD CD CD CD45 CD46 CO 2 DMSO DNA DPBS DS DVD EDTA EQA EQC ERC ES FITC FMLP GIFT GPC H 2 O 2 anticorpo inseminazione artificiale inseminazione artificiale con seme di donatore inseminazione artificiale con seme del partner ampiezza dello spostamento laterale della testa analisi della varianza complesso fosfatasi alcalina anti-fosfatasi alcalina acrosoma reagito tecniche di riproduzione assistita anticorpo antispermatozoo N-benzoil-L-arginina etil estere frequenza del battito laterale (Hz) albumina sierica bovina Biggers, Whitten e Whittingham computer aided sperm analysis computer aided sperm morphometric assessment assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti compact disk goccia citoplasmatica cluster di determinazione 45 (marker pan-leucocitario) cluster di determinazione 46 (antigene acrosomiale) diossido di carbonio dimetil sulfossido acido deossiribonucleico tampone fosfato salino di Dulbecco deviazione standard digital versatile disc acido etilendiaminotetracetico garanzia di qualità esterna controllo di qualità esterno eccesso di residuo citoplasmatico errore standard isotiocianato di fluoresceina formil-metionil-leucil-fenilalanina transfer gametico intratubarico glicerofosfolcolina perossido di idrogeno

16 XV HBSS HBV hcg HCV HIV HOP HOS HRP HSA HTF IB IBT IC ICSI Ig IM IQC IR IUI IVF KRM LC LIN LLQ MAD MAI MAR NA NP PBS pcv PDCA PMA PMSG PNPG PR PSA QA QC Hanks balanced salt solution virus epatite B gonadotropina corionica umana virus epatite C virus da immunodeficienza umana penetrazione nell ovocita di hamster rigonfiamento iposmotico perossidasi di rafano albumina serica umana fluido tubarico umano immunobead Immunobead test intervallo di confidenza iniezione intracitoplasmatica di spermatozoo immunoglobulina assenza di motilità controllo di qualità interno indice di rifrazione inseminazione intrauterina fecondazione in vitro Krebs Ringer Medium limiti di confidenza linearità limite inferiore di quantificazione spostamento angolare medio indice di anomalie multiple mixed antiglobulin reaction apertura numerica motilità non progressiva tampone fosfato salino campo visivo pianificare, fare, controllare, agire forbolo 12-miristato 13-acetato gonadotropine di siero di cavalla gravida p-nitrofenolo glucopiranoside motilità progressiva agglutinina Pisum sativum assicurazione di qualità controllo di qualità

17 XVI RCF RNA ROS r.p.m. SDI SDS SOP STR TBS TGG TZI UI VAP VCL VSL WHO WOB forza centrifuga relativa acido ribonucleico specie reattive dell ossigeno giri al minuto indice di alterazione spermatica sodio dodecilsolfato procedura operativa standard rettilineità (VSL/VAP) Tris-buffered saline Tyrode s glucose glycerol indice di teratozoospermia unità internazionale velocità media di percorso velocità curvilinea velocità in linea retta (rettilinea) World Health Organization oscillazione (VAP/VCL)

18 1 CAPITOLO 1 Stato dell arte 1.1 Introduzione Il Manuale di laboratorio per l esame del liquido seminale e dell interazione spermatozoi-muco cervicale è stato pubblicato la prima volta nel 1980 per rispondere alle crescenti esigenze di una standardizzazione delle procedure necessarie per l esame del liquido seminale umano. Da allora è stato aggiornato tre volte e tradotto in numerose lingue. Negli ultimi trent anni, il manuale ha fornito degli standard globali ed è stato ampiamente impiegato nei laboratori di ricerca e clinici di tutto il mondo. Nonostante questo successo, ci si è resi progressivamente conto che alcune delle raccomandazioni presenti nelle edizioni precedenti del manuale dovevano essere riviste alla luce delle nuove acquisizioni, e che alcuni concetti dovevano essere spiegati in maniera più approfondita e con maggiori prove a sostegno. Sulla base di queste considerazioni, il WHO ha istituito un comitato di redazione che rivedesse tutti i metodi descritti nel manuale, al fine di confermarli, modificarli o aggiornarli. In molti casi questo si è dimostrato estremamente difficile, in quanto con i metodi descritti nel manuale erano stati ottenuti dati insufficienti. In alcuni casi, i laboratori più accreditati sono stati in grado di ottenere risultati consistenti che, peraltro, non sono stati confermati da altri. Alla luce di tutto questo, il comitato di redazione ha messo a punto una consensus, dopo aver valutato la letteratura pertinente. Ulteriori raccomandazioni sono state fatte ai seminologi e ai ricercatori, in particolare per quanto riguarda la necessità di maggiori dettagli per molti dei metodi descritti. La mancanza di dettagli nelle precedenti edizioni ha fatto sì che alcuni laboratori hanno utilizzato metodi descritti altrove, o hanno messo a punto personali versioni di tali metodi, pur sostenendo di effettuare l analisi del liquido seminale secondo i criteri del manuale del WHO. Per tale motivo, al fine di rendere più semplice il confronto fra i laboratori di tutto il mondo, questa edizione del manuale è molto più dettagliata, spiegando approfonditamente il razionale dell impiego di una particolare tecnica nei casi in cui ci siano più metodi di analisi a disposizione per quel singolo parametro. Raccomandiamo pertanto ai laboratoristi che fanno riferimento a questo manuale, di riportare nella descrizione dei risultati pubblicati negli articoli scientifici il metodo specifico impiegato. 1.2 La quinta edizione La quinta edizione consta di tre parti: l analisi del liquido seminale (capitoli 2-4), la preparazione degli spermatozoi (capitoli 5 e 6) e il controllo di qualità (capitolo 7). La Parte I, che riguarda l analisi del liquido seminale, ricalca le edizioni precedenti, ma è stata divisa in tre capitoli: i metodi standard, rappresentati dalle procedure di routine universalmente accettate per la determinazione della qualità del liquido seminale; i test opzionali, che possono essere utilizzati in determinate situazioni o per scelta del laboratorio; i test di ricerca, che non sono attualmente considerati di routine. Dal momento che la spermiocoltura non viene eseguita routinariamente nel laboratorio di seminologia, è stata menzionata solo nella sezione relativa alla raccolta sterile del liquido seminale. La sezione sulla preparazione degli spermatozoi comprende, oltre agli spermatozoi eiaculati, anche gli spermatozoi ottenuti dal testicolo e dall epididimo. Intercalati agli elenchi puntati delle istruzioni metodologiche, si

19 2 CAPITOLO 1 Stato dell arte trovano Note (spiegazioni della metodologia), Commenti (interpretazione dei risultati) e Riquadri (contenenti ulteriore materiale esplicativo). Le caratteristiche principali di questa quinta edizione sono le seguenti. I capitoli relativi all analisi del liquido seminale includono dettagli su tutte le soluzioni di lavoro, procedure, calcoli e interpretazioni, in modo che ogni metodologia sia quanto più possibile completa, con rimandi minimi ad altre parti del manuale. La sezione sulla preparazione del seme è stata ampliata, ed è stato aggiunto un nuovo capitolo sulla crioconservazione degli spermatozoi. Le procedure per l analisi del muco cervicale sono state divise tra il capitolo sulle procedure opzionali e un appendice sulle caratteristiche del muco. Ci sono meno appendici rispetto alle edizioni precedenti, e sono limitate alle informazioni altamente specialistiche o raramente impiegate. Valutazione del numero degli spermatozoi. Le diluizioni del seme e le aree della camera di conta utilizzate per valutare il numero di spermatozoi nel liquido seminale sono state modificate per consentire la conta di 200 spermatozoi per replicato. È stata ribadita l importanza sia degli errori di campionamento, che della certezza dei risultati numerici ottenuti. Il comitato di redazione ha ritenuto che il numero totale di spermatozoi per eiaculato fornisca una valutazione più accurata della funzionalità del testicolo rispetto alla concentrazione degli spermatozoi, ma è imperativo che il volume del liquido seminale venga misurato con estrema precisione. Valutazione della azoospermia. Anche se apparentemente semplice, la diagnosi di azoospermia può essere resa difficile da vari fattori, fra cui grossi errori legati al conteggio di pochi spermatozoi, l elevato numero di campi microscopici da analizzare e le difficoltà nell esaminare il pellet post-centrifugazione in caso di campioni ricchi di detriti. Modifiche raccomandate includono la necessità di esaminare campioni fissati, non centrifugati, indicando la sensibilità dei metodi di conta utilizzati. Tuttavia, sono previsti anche metodi di centrifugazione per accumulare un numero sufficiente di cellule a fini terapeutici, e metodi per la valutazione di spermatozoi mobili in campioni non fissati di liquidi seminali post-vasectomia. Valutazione della motilità nemaspermica. Un cambiamento importante rispetto alle precedenti edizioni è la classificazione della motilità degli spermatozoi. Attualmente viene consigliato di classificare gli spermatozoi come progressivamente mobili, non progressivamente mobili e immobili (invece dei gradi a, b, c, d). Valutazione della morfologia nemaspermica. Alcuni laboratori valutano solo le forme normali, mentre altri considerano più importanti il tipo, la localizzazione e l estensione delle atipie. È ancora controverso se queste o altri tipi di valutazione o valutazioni semiquantitative rendano più attendibile l analisi del liquido seminale. Prove a sostegno della relazione tra la percentuale di forme normali (definite dai criteri stretti o dalla valutazione computerizzata della morfologia) e tassi di fecondazione in vivo giustificano il tentativo di identificare, nel liquido seminale, una sottopopolazione di spermatozoi morfologicamente distinta. In questa edizione, abbiamo incluso un numero maggiore di fotografie di migliore

20 CAPITOLO 1 Stato dell arte 3 qualità di spermatozoi considerati normali e borderline, accompagnate da spiegazioni del perché ogni spermatozoo è stato classificato in quel modo. Questo dovrebbe aiutare i seminologi a classificare gli spermatozoi in maniera uniforme. Dati recenti, provenienti da una popolazione fertile, hanno permesso di fornire valori di riferimento per la percentuale di forme morfologicamente normali. Controllo di qualità. Questo capitolo è stato completamente riscritto. Affinché i metodi analitici siano attendibili è necessario che ci sia un rigoroso controllo di qualità dell analisi seminale. Vengono forniti consigli e suggerimenti su come migliorare le prestazioni di laboratorio nei casi in cui i risultati del controllo di qualità siano insoddisfacenti. Range e limiti di riferimento. I range di riferimento di questo manuale sono stati dedotti dai dati della qualità del liquido seminale di uomini fertili, la cui partner ha ottenuto una gravidanza entro i 12 mesi. Per i valori di riferimento, sono stati impiegati i dati grezzi di un numero variabile da 400 a campioni di liquido seminale provenienti da uomini di otto paesi di tre continenti, che sono diventati padri di recente. Per convenzione statistica si considera il 2.5 percentile, di un intervallo di riferimento a due estremi, come soglia sotto la quale i valori possono essere considerati provenienti da una popolazione differente. Tuttavia, un intervallo di riferimento ad un solo estremo è stato ritenuto più opportuno per il liquido seminale, dal momento che elevati valori di qualunque parametro difficilmente sono pregiudizievoli per la fertilità. Il quinto percentile è dato come limite inferiore di riferimento, e la distribuzione completa per ogni parametro seminale è riportata nell Appendice Scopo del manuale I metodi descritti in questo manuale hanno l intento di linee guida per migliorare la qualità dell analisi del liquido seminale e la comparabilità dei risultati. Non dovrebbero essere necessariamente presi come obbligatori da strutture di accreditamento locale, nazionale o internazionale. L analisi seminale può essere utile sia in campo clinico che di ricerca, per valutare lo stato della fertilità maschile così come per monitorare la spermatogenesi nel follw-up della regolazione della fertilità maschile.