Il problema delle basse dosi. Dosi non letali. dal cgy al Gy in funzione del bersaglio

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1 Il problema delle basse dosi Dosi non letali dal cgy al Gy in funzione del bersaglio

2 Il problema delle basse dosi Negli Stati Uniti sono state eseguite 62 milioni di Tac nel 2006, contro i tre milioni del 1980 [the New England Journal of Medicine (NEJM) Nov. 2007]

3 Il problema delle basse dosi

4 Il problema delle basse dosi Forum europeo ( ) sul problema degli effetti sulla popolazione delle dosi dovute ad esami di imaging biomedico. Presidenza italiana del forum ISS

5 Un Programma di lavoro Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Comprensione degli effetti non-lineari Contributo alla valutazione del rischio

6 EXCALIBUR (EXposure effects At Low-doses of Ionizingradiation in Biological cultures) Università e Sezioni INFN (Istituto Nazionale di Fisica Nucleare) partecipanti BO CA LNF LNGS LNL PV PI SI SS Roma3

7 Dose dall ambiente Equivalente di dose annuale media è ~3.6 msv

8 Dose media per irraggiamento esterno (msv/y) da fondo naturale G. Moschini, G. Pavarin, M. Pelliccioni, E. Righi

9 Esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Contributo delle varie sorgenti naturali di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media all uomo negli U.S.A. Principali sorgenti naturali Terrestri e loro vite medie Potassio K 1.3x10 9 a Rudio Rb 5x10 10 a Torio Th 1.4x10 10 a Uranio U 4.5x10 10 a Contributo alla dose media annuale delle principali sorgenti di irraggiamento interno Contributo relativo delle varie sorgenti di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media all uomo nel mondo. Potassio K 17 mrem/a Carbonio C 10mrem/a Polonio-210 sino a Piombo- 210 Totale 210 Po 210 Pb 12 mrem/a 39mrem/a 9 F.A. Mettler et al, 1995 S.C. Bushong, 1998

10 Valutazione di rischio alle basse dosi Studi a dosi medio-alte: - studi in vitro: irraggiamenti a fascio largo - studi epidemiologici: sopravvissuti di Hiroshima e Nagasaki, minatori di uranio, Chernobyl, popolazione medicalmente esposta? + Estrapolazione alle basse dosi assunzione cautelativa in radioprotezione: andamento lineare alle basse dosi Studi epidemiologici diretti a basse dosi (E.J. Hall, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 65, No. 1, pp. 1 7, 2006) - misura dell esposizione indoor di radon e correlazione con l incidenza di cancro ai polmoni problemi metodologici nella determinazione dell esposizione dell individuo

11 Obiettivi Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti, con particolare riguardo agli effetti nonlineari (ipersensibilità, radioresistenza indotta, risposta adattativa, effetti di bystander..) 1. Studio dei meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi di radiazioni, in colture cellulari, in funzione della qualità della radiazione (raggi γ/x; protoni, alfa e ioni pesanti di varie energie) 2. Studio dell influenza dello stato di crioconservazione sulla risposta cellulare alle radiazioni ionizzanti (raggi γ) di sistemi biologici in-vitro e invivo, esposti al fondo naturale di radiazioni. 3. Contributo alla valutazione di rischio per esposizioni alle basse dosi di R.I. 4. Sistematica di effetti biologici indotti in diversi sistemi cellulari di mammifero, in coltura o crio-conservati, in funzione della qualità della radiazione e della dose(nel regime delle basse dosi), inclusi sistemi in-vivo (embrioni di pecora)

12 Stato dell arte (1) Per esposizioni alle basse dosi di R.I. (<0.5 Gy) in radioprotezione, in via cautelativa, la valutazione di rischio è effettuata estrapolando i dati delle alte dosi, mediante una relazione lineare senza soglia (LNT, Linear No-Threshold cancer risk model), con l assunzione a prioristica che gli organismi viventi rispondano allo stesso modo alle basse come alle alte dosi. In effetti, evidenze sperimentali accumulate negli ultimi 15 anni hanno mostrato la presenza di effetti non-lineari specifici alle basse dosi, non riscontrati alle alte dosi, quali: l ipersensibilità e la radioresistenza indotta (HRS/IRR); l effetto bystander (BE); l instabilità genomica.

13 Stato dell arte (2) Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR) Fenomeni di ipersensibilità e radioresistenza indotta sono stati riscontrati in più di 40 linee cellulari in vitro (umane, normali e tumorali, e di roditore), in seguito a irraggiamenti con basse dosi di radiazioni di raggi X/γ. In esperimenti di sopravvivenza cellulare, tali effetti si traducono in una deviazione per dosi < 1 Gy dal convenzionale andamento lineare o lineare-quadratico delle curve dose-risposta, con una mortalità maggiore (HRS) alle dosi più basse e radioresistenza (IRR) successiva al crescere delle dosi.

14 Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità (HRS) e Radioresistenza indotta (IRR) (Marples and Joiner,Int. J. Radiat. Biol. 2001, vol. 77, ) Irraggiamenti cellulari con RX: Cellule normali e tumorali di radiosensibilità Iper-sensibilità alle basse dosi Radioresistenza indotta Meccanismo protettivo indotto da basse dosi di radiazioni Con neutroni e pioni di alto LET: Andamento lineare (no HRS/IRR)

15 Stato dell arte (3) Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR) Più recentemente HRS/IRR sono stati osservati anche con radiazioni densamente ionizzanti (ioni pesanti) in cellule di roditore, in contrasto però con quanto osservato con neutroni, pioni nel picco di Bragg e protoni di alta e bassa energia.

16 Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (E.Tsoulou et al., Int. J. Rad. Biol. (2001),vol. 77, ) at LNL: broad ion beam cell irradiations: 60 Co γ rays and 4 He 2+ ions of different energies (59, 79 and 102 kev/µm LET) Chinese hamster V79 cells Iper-sensibilità alle basse dosi (HRS) Radioresistenza indotta (IRR)

17 Effetto Lazzaro Effetti delle basse dosi (studi in vitro) G. Borhnsen et al., Radiat. Prot. Dos.(2001),vol. 99, Tsoulou,..,Cherubini et al., Radiat. Prot. Dosim. 99(2002) GSI SIS facilty scanned pencil beam and LNL broad ion beam cell irradiations: 6MV photons and 12 C 6+ ions of 92.5 MeV/amu on target (27.5 kev/µm LET) 60 Co γ rays and 4 He 2+ ions of different energies (59, 79 and 102 kev/µm LET) Chinese hamster V79 cells Low dose hyper-radiosensitivity Induced radioresistance

18 Stato dell arte (4) Effetto bystander (BE) In esperimenti in vitro è stato osservato che il danno da radiazione è espresso anche in cellule non direttamente interessate dal deposito energetico, ma vicine (a contatto o non) a cellule irradiate. Tale effetto è stato riscontrato, in molte linee cellulari (di roditore, umane normali e tumorali), per diversi end-point biologici (scambi di cromatidi fratelli, aberrazioni cromosomiche, micronuclei, apoptosi, morte clonogenica, trasformazioni oncogeniche, mutazioni) e con diversi approcci sperimentali (irraggiamenti con micro fasci di RX o ioni; irraggiamenti con fasci larghi di ioni o con sorgenti con mascheramento di parte della popolazione cellulare esposta; esperimenti di trasferimento del terreno di coltura da una popolazione irraggiata a una non irraggiata; esperimenti di co-cultura tra popolazione irraggiata e non).

19 Effetti delle basse dosi: Bystander effect By soluble molecules? By gap-junction? 1 cellula colpita all interno di una popolazione Danno (morte cellulare, apoptosi, induzione di micronuclei, trasformazioni oncogeniche) espresso in più di 1 cellula (..evidenze sperimentali..) Quali meccanismi di induzione e trasmissione del danno?... secrezione di fattori citotossici nel mezzo di coltura da parte delle cellule irraggiate comunicazione diretta tra cellule attraverso gap-junction. ROS/RNS (NO);.

20 Radiazione Mitocondrio produce energia (possiede il suo DNA - mtdna) Interazione diretta (e - δ) e indiretta (ROS) Nucleo = sede del materiale Genetico (DNA) Citoplasma Citoplasma SG2008 N = Nucleo ( 8 μm ) Modificato da L.E. Feinendegen,2005

21 Signaling between Tissue Cells and Matrix Hit Cell Tissue Gap Junction Cells = Bystander Effects Matrix L.E. Feinendegen, 2005 Ulteriore Open problem : Qual è il target della radiazione?

22 Risposta adattativa 1) Priming dose: 5-40 cgy RX qualche h prima dell irraggiamento 2) Irraggiamento (Challenging dose) Osservato: in vivo e in vitro (protozoi, alghe, cell vegetali e di mammifero) per diverse linee cellulari per diversi end-point biologici (mutazioni, trasformazioni oncog., micronuclei, danno cromosomico e sopravvivenza cellulare)

23 Stato dell arte (5) Instabilità genomica L esposizione a radiazioni può dare inizio ad una cascata di eventi che produce un aumento del rateo di alterazioni nel genoma delle progenie di cellule irraggiate che non hanno manifestato un danno immediatamente dopo l irraggiamento (effetti tardivi). L instabilità è stata misurata in termini di una molteplicità di end-point biologici, ma con particolare attenzione al danno cromosomico. Anche tale effetto è stato evidenziato per diverse linee cellulari (cellule umane normali, linfociti umani, etc..) nonché per radiazioni sia a basso che ad alto LET. L instabilità genomica è stata anche riscontrata nella progenie di cellule non direttamente irraggiate, ma in comunicazione, attraverso gap-junction o terreno di coltura, con cellule irraggiate, evidenziando una possibile relazione di tale effetto col BE.

24 Effetti delle basse dosi: Instabilità Genomica L esposizione a radiazioni produce un aumento del ritmo di mutazioni con danno cromosomico nella progenie di cellule irraggiate Alterazioni nel cariotipo (numero e morfologia cromosomica) di cellule esposte a dosi di particelle α corrispondenti (in media) a 1 ione/cell Instabilità cromosomica nel: 3% di cloni di cell ibride umane/criceto per 1 Gy di RX; 4% di cloni per 1 Gy di ioni ferro.

25 Stato dell arte (6) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Il metodo di conservazione per lunghi periodi di tempo di sistemi biologici è la cosiddetta crio-conservazione, ovvero il loro mantenimento, con opportuni trattamenti preparatori, mediante congelamento, vitrificazione o ibernazione in opportune installazioni di laboratorio (dewar per azoto liquido, -196 C, 77 K). Alle temperature criogeniche i processi biochimici cellulari sono inibiti e quindi si impedisce la senescenza cellulare e la degradazione del materiale biologico. La tecnica è ben conosciuta e praticata (30 40 anni) ed è ben misurato il danno prodotto nelle cellule da la procedura congelamento-scongelamento.

26 Stato dell arte (7) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Dipendendo dall ambiente in cui i sistemi biologici crio-conservati vengono depositati, essi subiranno un irraggiamento protratto per anni e spesso per decine di anni, come nel caso delle banche di colture cellulari o delle banche di cellule staminali e/o germinali, a causa del fondo naturale di radiazioni.

27 Stato dell arte (8) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Dipendendo dal tempo di conservazione e mancando l azione antagonista continua dei meccanismi di riparazione, i danni prodotti dall esposizione delle cellule crio-conservate al fondo di radiazioni, in principio andranno accumulandosi, trasformando l esposizione a dose protratta (bassissimo rateo di dose del fondo ambientale) in esposizione a dose acuta, al momento dello scongelamento e rivitalizzazione delle cellule.

28 Stato dell arte (9) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Recenti risultati sperimentali ottenuti confrontando la risposta a raggi-γ di diversi sistemi biologici in condizioni criogeniche e a temperature ambiente, in termini di vari end-point biologici, hanno mostrato un effetto protettivo della crio-conservazione rispetto all azione delle R.I (raggi-γ)

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30 Stato dell arte (10) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Nei tutti i sistemi cellulari di mammifero in coltura e crio-conservati, inclusi sistemi in-vivo (embrioni di pecora) si riscontra un effetto protettivo della crio-conservazione. In particolare 9 Gy di γ su embrioni di pecora freschi portano (100%) all aborto dell embrione. Embrioni congelati irraggiati con 19 Gy di γ sono nati e gli agnelli si sono riprodotti e stiamo studiando la generazione dei nipoti che non mostra nessun comportamento anomalo.

31 Attività sperimentale attuale 1.Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance) 2.Irraggiamenti raggi-x, γ e particelle cariche su cromosomi ed analisi genomica 3.Irraggiamenti raggi-x, γ e particelle cariche su cellule ed analisi membranica

32 Attività EPR (1) Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance) per misurare la concentrazione di radicali liberi prodotti da irraggiamento, allo scopo di: 1. determinare gli effetti dello stato di crioconservazione sulla natura e distribuzione dei prodotti radicalici; 2. confronto con la radiolisi in fase liquida; 3. effetti della dose, del rateo di dose e della natura delle radiazioni.

33 Attività EPR (2) Metodologia: 1. preparazione dei campioni di cellule V79, dei terreni di coltura e di irraggiamento e dei loro componenti; 2. irraggiamenti a 77 o K con radiazioni γ da 60 Co, raggi X, H+, D+ ed α; 3. spettroscopia EPR in matrice e in fase liquida con agenti di spin trapping

34 Attività EPR (3) Campioni A1-A9: A1 : H2O Pura A2: H2O + DMSO* ( 10%) A3 : terreno di coltura DMEM completo A4 : Terreno di coltura DMEM completo + DMSO A5 : Terreno di coltura DMEM completo + FBS A6 : Terreno di coltura completo + FBS** + DMSO = terreno di congelamento A7 : Cellule in terreno di coltura completo + FBS (1.5x10 7 cellule totali) A8 : Cellule in terreno di congelamento(1.5x10 7 cellule totali) A9: H2O + FBS *Dimetilsolfossido (DMSO) per crioprotezione cellulare **Fetal bovine serum (FBS) da aggiungere al medium di coltura per far crescere le cellule

35 Attività EPR (4) aree irraggiati a1 3,00E+04 2,50E+04 A4 Terreno di coltura DMEM completo + DMSO A8 cellule in terreno di congelamento x1 a3 a4 Area Totale (U.A.) area 2,00E+04 1,50E+04 a5 x2 a7 a8 1,00E+04 a9 5,00E+03 0,00E tempo irraggiamento (h) Tempo di irraggiamento ( h, 0.35 kgy/h) A5 Terreno di coltura DMEM completo + FBS A1 acqua pura A9 acqua + FBS A3 terreno di coltura DMEM completo

36 Attività EPR (5) ANALISI PARZIALE EFFETTUATA: 1. la presenza di DMSO aumenta la produzione di radicali liberi (metilici), la cui dinamica deve essere studiata; 2. i radicali OH (in misura minore anche i radicali HO 2 ) sono dominanti in H 2 O pura e sono presenti in tutti i sistemi irraggiati. I radicali OH decadono a 140 o K senza generare nuove specie per reazione con gli altri componenti presenti; 3. il fenomeno descritto riduce drasticamente il danno mediato dalla radiolisi dell acqua sulle cellule e costituisce una differenza sostanziale rispetto alla radiolisi in fase liquida; 4. non c è, per ora, evidenza chiara del danno radicalico diretto o indiretto sulle cellule. Gli spettri EPR sono sostanzialmente gli stessi ottenuti dai sistemi senza cellule; 5. dobbiamo aumentare la popolazione di cellule nei campioni e si devono eseguire misure preliminari con sospensioni delle cellule in acqua pura.

37 Attività genomica (1) Il telomero è la regione terminale del cromosoma, da cui deriva il nome stesso, composta di DNA altamente ripetuto, che non codifica per alcun prodotto proteico. Ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. La DNA polimerasi, infatti, non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione; se non ci fossero i telomeri, che quindi vengono accorciati ad ogni replicazione, la replicazione del DNA comporterebbe in ogni occasione una significativa perdita di informazione genetica. Vi sono prove che questo progressivo accorciamento dei telomeri sia associato all'invecchiamento della cellula e dell'intero organismo. I telomeri (in giallo) sono evidenziati sui cromosomi attraverso una Fluorescent in situ hybridization (FISH) Elizabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Szostak, Nobel per la Medicina 2009, per aver individuato l'esistenza dei telomeri e delle telomerasi, correlandone l accorciamento con l invecchiamento cellulare.

38 Attività genomica (2) Il telomero è composto da sequenze ripetute di DNA e da alcune proteine ed ha la funzione di proteggere le terminazioni dei cromosomi. Ciò impedisce da una parte la degradazione progressiva con rischio di perdita di informazione, dall'altra che tale regione, non presentando una corretta struttura a doppia elica, sia processata come estremità di filamento spezzato, con il rischio di fusione tra due regioni telomeriche di cromosomi diversi. I telomeri sono estesi dall'enzima telomerasi, che rappresenta una classe di retrotrascrittasi specializzate, presenti in numerosi organismi (tra cui l'uomo), ma non in tutti (e soprattutto non in tutte le fasi dello sviluppo). In particolare, nell'uomo le telomerasi (così come nella maggior parte degli eucarioti multicellulari) sono attive solo nelle cellule della linea germinale: ciò significa che, ad ogni replicazione, i telomeri umani si accorciano di un certo numero di paia di basi.

39 Attività genomica (3) Esistono teorie (e dati sperimentali) che associano il continuo accorciarsi dei telomeri con la senescenza delle cellule della linea somatica e con la prevenzione del cancro. Questo perché i telomeri agirebbero come una sorta di orologio biologico, legato cioè ad un numero massimo di mitosi (e di replicazioni del DNA), al termine del quale la cellula sarebbe troppo vecchia per essere mantenuta in vita e prenderebbe la via dell'apoptosi. Per garantire un efficace ricambio cellulare, in ogni caso, in molti tessuti dell'organismo sono presenti cellule staminali, che mantengono la corretta lunghezza dei telomeri attraverso la presenza di telomerasi attive. Il meccanismo molecolare attraverso cui i telomeri troppo corti possono portare alla morte cellulare sembra essere legato alla perdita del loro corretto ripiegamento naturale (evento legato ad una loro dimensione troppo ristretta). Secondo alcune teorie comunemente accettate, la cellula è infatti in grado di riconoscere questo diverso ripiegamento come danno al DNA, avviando il processo dell'apoptosi sulla base dell'attività di molecole come p53. Tale processo di morte cellulare può anche essere avviato da una fusione tra cromosomi.

40 Attività genomica (4) Nell'uomo, la sequenza ripetuta nei telomeri è composta di sei nucleotidi TTAGGG, ripetuti per una lunghezza che va da 3 a 20 kilobasi. Sono presenti kilobasi addizionali di ripetizioni telomero-associate, che si dispongono tra il telomero ed il resto del cromosoma. La sequenza telomerica varia da specie a specie. Tipo di organismo Vertebrati Piante Superiori Alghe Verdi Insetti Sequenza telomerica TTAGGG TTTAGGG TTTTAGGG TTAGG

41 Attività genomica (5) Le misure finora effettuate (4 Gy) mostrano che: 1. i fibroblasti, di uomo e di topo, esibiscono differenti comportamenti, per quanto riguarda la lunghezza del telomero, per iraggiamenti con radiazioni di basso od alto LET: accorciamento per basso LET, allungamento per alto LET; 2. la qualità della radiazione e la conseguente complessità del danno indotto a livello del DNA, sembrano giocare un ruolo nell attivazione dei processi di ricombinazione a livello del telomero; 3. è del tutto sconosciuto, a nostra conoscenza, il significato radiobiologico di questo allungamento del telomero (genomic instability??).

42 Attività genomica (6) ISIS Software Metasystems T/C% = Tel fluo Cen 2 fluo X-rays 3 MeV protons Telomere length (T/C%) hrs 96 hrs * * * 0 Gy X rays Number of Telomeres = 1808 Mean length = 25,51 St. Dev. = 15, Number of Telomeres = 1810 Mean length = 17,87 St. Dev. = 11,79 28,5 kev/um protons Number of Telomeres = 2204 Mean length = 25,65 St. Dev. = 17, Number of Telomeres = 1818 Mean length = 29,58 St. Dev. = 18, Gy Doses (Gy)