Esercizi di valutazione di qualità delle analisi sulle diverse matrici biologiche utilizzate nell' analisi di farmaci e sostanze d' abuso

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1 Esercizi di valutazione di qualità delle analisi sulle diverse matrici biologiche utilizzate nell' analisi di farmaci e sostanze d' abuso Simona Pichini, Ilaria Palmi, Rita di Giovannandrea Dipartimento del Farmaco ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Roma

2 COS È UNA VALUTAZIONE ESTERNA DELLA QUALITÀ (VEQ)?

3 IL CONTROLLO DI QUALITA ESTERNO O VERIFICA ESTERNA DI QUALITA (VEQ) E un procedimento che fornisce una valutazione a posteriori dell attendibilità analitica sulla base dei risultati delle analisi eseguite sugli STESSI CAMPIONI (incogniti) in diversi laboratori. Rappresenta la base per un controllo saltuario o regolare (prova valutativa = Proficency Test). Un certo numero di laboratori analizza gli stessi campioni inviando poi i risultati al laboratorio di riferimento che effettua il controllo. Questa procedura ha lo scopo di assicurare un ACCORDO ANALITICO tra i laboratori indipendentemente dalla verifica della qualità interna.

4 Il CONTROLLO DI QUALITA INTERNO (QCI) SERVE A MANTENERE LE PRESTAZIONI ANALITICHE NEI LIMITI COERENTI CON GLI OBIETTIVI E LO STATO DELL ARTE DEL LABORATORIO Il primo compito dello specialista di laboratorio rimane quello di assicurare la qualità analitica del risultato tramite il QCI, basato sull uso di sieri di controllo a titolo noto, elaborazioni statistiche e carte di controllo che producono le DS (deviazioni standard) e i CV% (coefficienti di variazione). Il QCI controlla, in particolar modo, la PRECISIONE e gli ERRORI CASUALI. LA VERIFICA ESTERNA DI QUALITA (VEQ) controlla l ACCURATEZZA e gli ERRORI SISTEMATICI tramite sieri a titolo ignoto. Ci si confronta con gli altri laboratori tramite l uso del BIAS (scostamento percentuale) rispetto al valore medio di consenso o a valori ottenuti con metodi di riferimento. Il professionista di laboratorio deve essere in grado, tramite la valutazione periodica della VEQ, di mantenere gli obiettivi analitici del laboratorio.

5 Obiettivo di un programma di VEQ è il miglioramento della qualità delle prestazioni dei laboratori, attraverso la produzione e la circolazione di dati che: consentono al laboratorio di confrontare l affidabilità delle proprie prestazioni con quella di altri laboratori; facilitano l individuazione delle aree in cui le determinazioni sono ancora poco affidabili; stimolano il miglioramento dell affidabilità degli esami svolti.

6 I PROGRAMMI DI VEQ IN ITALIA

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9 Farmaci= 415 euro Droghe screening= 415 euro Droghe screening + conferma= 680 euro

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11 Farmaci= euro Droghe = euro

12 Le VEQ della Lombardia così come quelle della Sicilia sono organizzate dall AOU di Careggi

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15 HAIRVEQ Il Reparto farmacodipendenze,tossicodipendenze e Doping dell Istituto Superiore di Sanità (ISS) ha organizzato, a partire dal gennaio 2002 un programma di VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITA sull analisi delle sostanze d abuso nei capelli: l HAIRVEQ. Tale programma, fino all anno 2005 è stato organizzato in collaborazione con l Institut Municipal d Investigaciò Mèdica (IMIM) di Barcellona (Spagna) mentre successivamente con il solo intervento dei coordinatori italiani

16 PROVENIENZA (%) DEI LABORATORI CHE PARTECIPANO ALL HAIRVEQ % 33% 5% 69% 22% 9%

17 HAIRVEQ: numero invio, anno e contenuto analitico dei campioni incogniti INVIO ANNO CAMPIONI S1 (6-MAM, MOR, CO D, MTD, COC, BEG, COCAETILENE) S2 (6-MAM, MOR, COD, MET, COC, BEG) S3 (CAMPIONE BIANCO) S4 (6-MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) S5 (MDMA, MDA, COC, BEG) S6=S1 (6MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) S7 (CAMPIONE BIANCO) S8 (6MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) (POLVERIZZATI) S9 (6MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) (FRAMMENTI) S10 (CAMPIONE BIANCO) S11 (MDMA, MDA) S12 (COC, BEG, THC, THC-COOH) S13 (6MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) S14 (CAMPIONE APERTO) S15 = S13 (6MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) S16 (6-MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG) S17 (6-MAM, MOR, COC, BEG, MDMA, MA, AMP) S18 (CAMPIONE BIANCO) S19 (6-MAM, MOR, COD, COC, BEG, MTD) S20 (6-MAM, MOR, COD, COC, BEG, EME) S21 (CAMPIONE BIANCO) S22 (CAMPIONE BIANCO) S23 (6-MAM, MOR, COC, BEG, MDMA) S24(CAMPIONE BIANCO) S25 (COC, BEG, MTD) S26 (CAMPIONE BIANCO) S27 (COC, BEG, MTD) S28 (6-MAM, MOR, COD, MTD, COC, BEG, EME) S29 (CAMPIONE BIANCO) S30 (CAMPIONE BIANCO) S31 (6-MAM, MOR, COC, BEG, MTD) S32 (COC, BEG, COCAETILENE, EME) S33 (CAMPIONE BIANCO)

18 HAIRVEQ: LE PERFORMANCE DEI LABORATORI (ANNI )

19 Numero dei FALSI POSITIVI e FALSI NEGATIVI per campione analizzato (anni ) N Workshop e SOP Nuovi laboratori 0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S31 S32 S33 ID CAMPIONE FALSI POSITIVI FALSI NEGATIVI * S14 era un campione aperto

20 Percentuale di FALSE POSITIVITA nei campioni bianchi nel corso degli anni % S3 S7 S10 S18 S21 S22 S24 S26 S29 S30 S33 ID CAMPIONE

21 VARIAZIONI NEL CONTENUTO DI OPPIACEI NEI CAMPIONI HAIRVEQ (ANNI ) ng/mg 6-MAM , ,9 65, ,84 6,7 6,6 4,9 10,3 0,5 2,03 0,9 5,67 1,41 0 S1 S2 S4 S6 S8 S9 S13 S16 S17 S19 S23 S28 S31 MORFINA ng/mg 60 55, ,68 2,6 2,3 3,6 4,7 0,9 0,92 2,34 0,3 0,41 0 S1 S2 S4 S6 S8 S9 S13 S16 S17 S19 S23 S28 S31 ng/mg CODEINA , ,4 2,4 2 0,88 1 0,4 0,4 0,9 0,9 0,46 0,58 0 S1 S2 S4 S6 S8 S9 S13 S16 S19 S28

22 VARIAZIONI NEL CONTENUTO DI COCAINA E BEG NEI CAMPIONI HAIRVEQ (ANNI ) COC (ng/mg) S1 S2 S4 S5 S6 S8 S12 S13 S16 S17 S19 S20 S23 S25 S27 S28 S31 S BEG(ng/mg) S1 S2 S4 S5 S6 S8 S12 S13 S16 S17 S19 S20 S23 S25 S27 S28 S31 S32

23 QUALI I MOTIVI DI RISULTATI INSODDISFACENTI?

24 CREDIAMO CHE LA PIÙ PROBABILE FONTE DI ERRORE RISIEDA NELLA VALIDAZIONE DELLA METODICA ANALITICA E NELLA VALUTAZIONE DEL RISULTATO : Uso corretto dello standard interno (diversi laboratori non usano uno standard interno); Corretta validazione del metodo (diversi laboratori dichiarano di non mettere in atto un efficiente validazione del metodo analitico); Uso di una curva di calibrazione con un campione bianco spiked con gli analiti sotto esame per il calcolo quantitativo (molti laboratori non danno informazioni sulla curva di calibrazione);

25 Stabilire un limite di quantificazione, che possa garantire il rispetto dei cut-off richiesti per l analisi dei capelli; Corretta valutazione del dato analitico (almeno 3 ioni caratteristici per l identificazione dell analita ed uno per la sua quantificazione); Utilizzo di un cut-off corretto (i laboratori utilizzano cut-off differenti, spesso difformi da quelli raccomandati dalla SoHT)

26 UTILIZZO DI UN CUT-OFF

27 Cut-off nei test su matrice pilifera CLASSE DI SOSTANZA CUT-OFF SOHT CUT-OFF legge mansioni a rischio(g.u.236 8/10/08) CUT-OFF GTFI OPPIACEI METABOLITI 0.2 ng/mg 0.2 ng/mg 0.2 ng/mg COCAINA e METABOLITI 0.2 ng/mg Cocaina 0.5 ng/mg 0.5 ng/mg BEG 0.05 ng/mg 0.05 ng/mg 0.05 ng/mg EME 0.05 ng/mg 0.05 ng/mg cocaetilene 0.05 ng/mg 0.05 ng/mg CANNABINOIDI METABOLITI 0.1 ng/mg THC 0.1 ng/mg 0.05 ng/mg THC-COOH 0.2 pg/mg 0.2 pg/mg METADONE 0.2 ng/mg 0.2 ng/mg 0.2ng/mg ANFETAMINA, METANFETAMINA 0.2 ng/mg 0.2 ng/mg 0.2ng/mg MDMA-MDA-MDEA MBDB BUPRENORFINA norbuprenorfina 0.2 ng/mg 0.2 ng/mg 0.2ng/mg 0.2ng/mg 0.05 ng/mg 0.05ng/mg 0.05ng/mg ETILGLUCURONIDE 30 pg/mg 30 pg/mg

28 UTILIZZO DI UN CUT-OFF CAMPIONE N.1 % NO % SI Eroina 25,0 75,0 6-MAM 37,5 62,5 Morfina 18,2 81,8 Codeina 25,0 75,0 Metadone 35,7 64,3 CAMPIONE N.32 % NO % SI Eroina 0 100% 6-MAM 0 100% Morfina 0 100% Codeina 0 100% Metadone 0 100%

29 CUT OFF OPPIACEI UTILIZZATI DAI LABORATORI Anno 2002: I invio Anno 2012: XVI invio 0,05 ng/mg 9,0% 0,1 ng/mg 36,3% 0,2 ng/mg 9,0% 300 ng/ml 9,0% NO 27,2% 0,1 ng/mg 3,2% 0,2 ng/mg 71,0% 0,3 ng/mg 3,2% 0,5 ng/mg 13,0% N.R. 9,6% N.R. 9,0%

30 HAIRVEQ: STATO DELL ARTE MIGLIORAMENTI nelle performance dei Laboratori partecipanti si sono ottenuti a seguito degli incontri periodicamente organizzati dai coordinatori del programma HAIRVEQ. Ad oggi, si è giunti ad una buona omogeneità nelle tecniche di preparazione, estrazione ed analisi del campione: DIGESTIONE : acida o tamponata (basica per i cannabinoidi) ESTRAZIONE: colonnina in fase solida ANALISI: GC/MS, LC/MS o LC/MS/MS A partire dal 2008, molti laboratori hanno iniziato ad utilizzare nello screening kit immunochimici dedicati all analisi delle droghe d abuso nella matrice cheratinica

31 2012: il caso THC Per l invio N. 17 del 2012, erano stati preparati 3 campioni di capelli: un bianco, un campione di poliassuntore di cocaina ed eroina e un campione di un consumatore (noto) di THC. Per tale ultimo campione i tre laboratori di riferimento avevano fornito i seguenti risultati: 0.4 ng/mg, 0.06 ng/mg, 0.07 ng/mg Dei 32 laboratori partecipanti all invio solo 20 avevano fornito un risultato per il THC 20 CAMPIONI 6 POSITIVI 14 FALSI NEGATIVO MEDIA 0.21 DV 0.23

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33 THC 35 RISULTATI (ng/mg) 4 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO 40 NEGATIVO 42 <0, NEGATIVO 56 NEGATIVO 65 NON RILEVATO 72 NEGATIVO NEGATIVO 75 <0,05 tracce 81 NEGATIVO NEGATIVO THC 35 RISULTATI (ng/mg) sotto cut-off 56 non rilevato sotto cut-off 84 sotto cut-off

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35 Una prima esercitazione pilota è partita nel 2007, con l invio di 3 campioni (S1, S2, S3) a 21 Laboratori partecipanti (17 europei e 4 americani). PROVENIENZA (%) DEI LABORATORI ITALIANI CHE PARTECIPANO ALL ORALVEQ 2007 N = 11 44% 31% 25% 2012 N = 18 56% 22% 22%

36 ORALVEQ: numero invio, anno e contenuto analitico dei campioni incogniti INVIO ANNO CAMPIONI S1 (CAMPIONE BIANCO) S2 (6-MAM, MOR, COC, BEG) S3 (MDMA, MDA) S4 (6-MAM, COC, MDMA, THC, THC-COOH)+ buffer Cozart S5 (6-MAM, COC, MDMA, THC, THC-COOH) + buffer Intercept S6 (CAMPIONE BIANCO) S7 ((6MAM, MOR, COC, BEG, MDMA) S8 (THC) S9 (COC, BEG) S10 (CAMPIONE BIANCO) S11 (CAMPIONE BIANCO) S12 (MOR, COD) S13 (MDMA, MDA)

37 N Numero dei FALSI POSITIVI e FALSI NEGATIVI per campione analizzato (anni ) FALSI POSITIVI FALSI NEGATIVI S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S ID CAMPIONE

38 % Percentuale di FALSE POSITIVITA nei campioni bianchi nel corso degli anni S1 S6 S10 S11 ID CAMPIONE

39 % Percentuale di FALSE POSITIVITA nei campioni spiked nel corso degli anni S2 S3 S4 S5 S7 S8 S12 S13 ID CAMPIONE 2012

40 CREDIAMO CHE LA PIÙ PROBABILE FONTE DI ERRORE RISIEDA NELLA VALIDAZIONE DELLA METODICA ANALITICA E NELLA VALUTAZIONE DEL RISULTATO : Corretta validazione del metodo; Corretta valutazione del dato analitico (almeno 3 ioni caratteristici per l identificazione dell analita ed uno per la sua quantificazione); Utilizzo di un cut-off corretto, comune e condiviso

41 Cut-off nei test di screening e di conferma nella saliva CLASSE DI SOSTANZE screening (ng/ml) (GTFI) conferma (ng/ml) (GTFI) screening (ng/ml) (L.G. europee) conferma (ng/ml) (L.G. europee) OPPIACEI (morfina libera) Morfina Codeina acetilmorfina Metadone o metaboliti COCAINA metabolita (benzoilecgonina) Cocaina Benzoilecgonina (BEG) AMFETAMINA E CONGENERI Amfetamina metamfetamina ,4-METILENDIOSSIMETAMFETAMINA E CONGENERI 50 MDMA MDA MDEA MBDB CANNABINOIDI THC

42 DIMINUZIONE DELLE CONCENTRAZIONI DEGLI ANALITI ng/ml ng/ml ng/ml S2 S4 S MAM S2 S5 S7 S8 800 MDMA COCA S3 S4 S7 S13 ng/ml ng/ml MORFINA S2 S7 S12 28 BEG 9 14 S2 S7 S8 240 S4 THC 12 S8

43 RISULTATI DEL VI INVIO (CAMPIONI 11-13): ANNO 2012 QUESTO ESERCIZIO DI QUALITÀ NELL ANALISI DELLE SOSTANZE D ABUSO IN SALIVA HA DATO RISULTATI MOLTO SODDISFACENTI. Nel campione 11 (campione bianco) non abbiamo ricevuto nessun risultato falso positivo e riteniamo ciò un ottima prova dei Laboratori partecipanti. Nel Campione 12 abbiamo avuto solo 1 falso positivo al THC Nessun falso positivo per il campione 13. Inoltre, non ci sono stati risultati falsi negativi sebbene sia nel campione 12 che nel 13 abbiamo volutamente aggiunto quantità di sostanze con concentrazione molto vicina ai cut-off delle principali linee guida internazionali. In particolare, nel campione 12 abbiamo simulato l assunzione di uno sciroppo alla codeina in presenza di una piccola quantità di morfina. I LABORATORI PARTECIPANTI HANNO SEMPRE BEN INTERPRETATO IL CONTENUTO DI QUESTO CAMPIONE.

44 MOLTE REGIONI HANNO RESO OBBLIGATORIA, PER I LABORATORI CHE EFFETTUANO ANALISI PER LA RICERCA DI SOSTANZE D ABUSO SU MATRICE CHERATINICA, LA PARTECIPAZIONE A PROGRAMMI DI VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITA. LA REGIONE LAZIO, CON LA DGR 556 DEL 04/12/2010 HA AFFIDATO ALL ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA, IL PROGETTO MONITORAGGIO E MIGLIORAMENTO DELLA QUALITA DEI LABORATORI DI TOSSICOLOGIA IN AMBITO REGIONALE (Suppl.Ordinario n.2 al BUR n.2 del 14/01/2011)

45 ORALVEQ: STATO DELL ARTE I laboratori che in Italia effettuano analisi per la ricerca delle sostanze d abuso nella saliva sono POCHI e con un CARICO DI LAVORO IMPORTANTE. Per questo, le performance analitiche sono generalmente elevate La maggior parte di questi laboratori (>50%) esegue test di screening con kit immunochimici specifici per la matrice salivare e conferme utilizzando apparecchiature quali la GC/MS o la LC/MS.

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47 FINE Grazie per l attenzione!