Dott.ssa Roberta Pacifici Reparto Farmacodipendenza, Tossicodipendenza e Doping Istituto Superiore di Sanità

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1 Dott.ssa Roberta Pacifici Reparto Farmacodipendenza, Tossicodipendenza e Doping Istituto Superiore di Sanità

2 L ANALISI DELLE SOSTANZE D ABUSO NELLE MATRICI BIOLOGICHE Tossicologia Clinica Tossicologia Forense Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

3 Analisi finalizzate alla TOSSICOLOGIA CLINICA Diagnosi, trattamento tossicodipendenti afferenti alle strutture pubbliche e private TOSSICOLOGIA FORENSE Analisi per scopi amministrativi o medico-legali: Commissioni medico-legali: disabilità alla guida. Prefettura: verifica trattamenti alternativi alle sanzioni previste dal DPR 309/1990. Determinazione requisiti psicofisici per il rilascio del porto d armi (GU 304/1991). Forze d ordine: accertamento stato ebbrezza o assunzione sostanze stupefacenti nella guida (L. 214/2003 ART ). Enti pubblici e/o privati: accertamenti sui lavoratori le cui mansioni comportano rischi per la sicurezza, l incolumità e la salute di terzi (Provv.18/09/2008, G.U. n.236) ). Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

4 OBIETTIVI TOSSICOLOGIA CLINICA ARRIVARE ALLA GIUSTA DIAGNOSI (INTOSSICAZIONE O NO, TOSSICODIPENDENZA O NO) TRATTARE IL PAZIENTE IN MANIERA CORRETTA SALVARE IL PAZIENTE PREVENIRE LA RECIDIVA TOSSICOLOGIA FORENSE FORNIRE ALLA MAGISTRATURA TUTTI GLI ELEMENTI PER UN GIUSTO GIUDIZIO

5 CONSEGUENZE DEGLI ERRORI ANALITICI TOSSICOLOGIA CLINICA DIAGNOSI SBAGLIATA ERRATO INTERVENTO TERAPEUTICO (nessuno, sbagliato, troppo breve, troppo lungo, etc.) UN CASO CLINICO PUO DIVENTARE UN CASO FORENSE TOSSICOLOGIA FORENSE CONSEGUENZE GIUDIZIARIE SIA PER LAUTORE DEL REATO SIA PER LA PARTE LESA INDAGINI SUCCESSIVE FALSATE RIPERCUSSIONI SUL RAPPORTO/AMBIENTE DI LAVORO

6 ANALISI DI SCREENING TECNICHE IMMUNOCHIMICHE Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

7 METODI IMMUNOCHIMICI SENSIBILITA E SPECIFICITA sono funzione dell anticorpo utilizzato: POLICLONALE MONOCLONALE Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

8 CUT - OFF E un valore di riferimento espresso in concentrazione, al di sopra del quale il risultato di un test analitico è giudicato positivo e al di sotto del quale il test è giudicato negativo Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

9 CRITERI DI SCELTA DEL CUT-OFF CRITERIO ANALITICO CUT-OFF = primo calibratore positivo CRITERIO AMMINISTRATIVO CUT-OFF primo calibratore positivo Il valore scelto deve permettere la conferma cromatografica del risultato CUT-OFF uguale stessa regione, paese, UE Per evitare disparità di trattamento all utente dovuta alle diverse specifiche della metodica. Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

10 Le positività alle analisi di screening devono essere sempre confermate

11 ANALISI DI CONFERMA Le analisi di conferma servono a verificare che non ci siano falsi positivi a causa della non specificità dei test iniziali identificare i singoli analiti avere la sensibilità uguale o maggiore al valore soglia dei test iniziali essere quantitative DEVONO basarsi su principi fisici e chimici diversi da quelli dei test iniziali Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

12 ANALISI DI CONFERMA TECNICHE CROMATOGRAFICHE GC/MS LC/MS Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

13 Matrici biologiche Urine Capelli Sangue Saliva

14 FINALITÀ DIAGNOSTICA

15 PERCHE UTILIZZARE MATRICI NON CONVENZIONALI NELLE ANALISI FARMACOTOSSICOLOGICHE? Per incrementare il tempo di determinazione Dopo somministrazione ed in funzione delle caratteristiche farmacocinetiche una droga e/i suoi metaboliti possono essere rilevati in: Sangue Sudore h h Saliva Urina Capelli h giorni mesi

16 FINALITÀ DIAGNOSTICHE Attualità d uso e sostanze illecite Matrice biologica SANGUE - SALIVA

17 LE GHIANDOLE SALIVARI Ghiandola parotidea; 2. ghiandola sottolinguale; 3. ghiandola sottomandibolare

18 COMPOSIZIONE DELLA SALIVA Parametri Saliva Plasma Volume Velocità di produzione ml/day 0.6 ( ) ml/min ph 6.7( ) % of body weight Acqua [%] 98 ( ) 91.5 (90-93) Proteine totali [g/100 ml] 0.3 ( ) 7.3 (6-8) Albumina [g/100 ml] 4.5 (4-5) Mucina [g/100 ml] 0.27 ( ) Aminoacidi [mg/100 ml] Elettroliti [mmol/l] Potassio Sodio Calcio Fosfato Cloro Colesterolo [mg/100 ml] 7.5 (3-15) Sostanza secca [g/l] 6 (3.8) 80

19 ANALISI DELLE DROGHE NELLA SALIVA VANTAGGI: IL CAMPIONE DI SALIVA SI RACCOGLIE CON FACILITA IL MONITORAGGIO DELLA CONCENTRAZIONE DELLA DROGA NELLA SALIVA E IMPORTANTE IN SPECIAL MODO NELLE SITUAZIONI IN CUI E NECESSARIO OTTENERE IL CAMPIONE BIOLOGICO SENZA METTERE A DISAGIO IL PAZIENTE O METTERLO A RISHIO DI INFEZIONE L ATTIVITA FARMACOLOGICA DIPENDE DALLA FRAZIONE LIBERA DEL FARMACO NEL PLASMA: QUESTA FRAZIONE E NORMALMENTE ESCRETA DALLE GHIANDOLE SALIVARI NELLA SALIVA

20 ANALISI DELLE DROGHE NELLA SALIVA SVANTAGGI: VOLUME RACCOLTO LIMITATO, A MENO CHE NON SIA STIMOLATA LA SALIVAZIONE; LA CONTAMINAZIONE ORALE DIPENDE DALLA MODALITA DI ASSUNZIONE (FUMO, INGESTIONE ORALE) LA MODALITA DI RACCOLTA DEL CAMPIONE PUO INFLUENZARE LA CONCENTRAZIONE SALIVARE DELLA DROGA COME RISULTATO DI UNA VARIAZIONE DEL ph e DEL FLUSSO SALIVARE

21 Farmacocinetica dell MDMA in saliva conc. (mg/l) conc. (mg/l) conc. (mg/l) conc. (mg/l) saliva plasma saliva MDA Time (h) plasma saliva plasma Time (h) Curva delle concentrazioni plasmatiche e salivari di MDMA ed MDA in funzione del tempo (dose: 100 mg MDMA)

22 Rapporto S/P ed influenza del ph della saliva salivary ph S/P ratio S/P ratio Rapporto S/P nelle 24 h dopo somministrazione di MDMA Time (h) salivary ph I cambi di ph salivare spiegano Il valore elevato dei rapporti * Time (h) Profilo del ph salivare nelle condizioni di trattamento placebo MDMA

23 No. of cases No. of cases Test On-site per la determinazione dell MDMA nella saliva negative cases positive cases Test sulla saliva raccolta direttamente sulla lingua A causa dell elevato numero di falsi negativi Time (h) negative cases positive cases Test su 2 ml di saliva applicati direttamente sul test in laboratorio Miglioramento dei risultati Time (h)

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25 PROVENIENZA (%) DEI 18 LABORATORI CHE HANNO PARTECIPATO NEL ALL ORAVEQ

26 Nell ultimo esercizioo effettuato (febbraio 2011), sono stati inviati 3 campioni (S8, S9, S10) ai 18 Laboratori partecipanti. S8 era un campione BIANCO S9 conteneva COCAINA (20 ng/ml), BENZOILECGONINA (15 ng/mg) S3 conteneva THC (15 ng/ml)

27 Risultati parziali di 10 Laboratori S8 : campione BIANCO 1 FP a cocaina S9: COCAINA (20 ng/ml), 1 FN a benzoilecgonina range di conc. dei lab. Partecipanti ng/ml BENZOILECGONINA (15 ng/mg) range di conc. dei lab. Partecipanti ng/ml S10: THC (15 ng/ml) 2 FP a cocaina range di conc. dei lab. Partecipanti ng/ml

28 LE GHIANDOLE SUDORIPARE Il sudore è costituito essenzialmente da una soluzione salina diluita contenente diverse sostanze organiche ed inorganiche. La secrezione delle ghiandole è stimolata dal calore, dall assunzione di determinate sostanze, da stimoli ormonali e psichici.

29 COMPOSIZIONE DEL SUDORE Parametri Sudore Plasma Volume Fino a 5 L 4.3% del peso corporeo Velocità di produzione Fino a 3 L/h ph 5.8 (fino a 6.7 dopo esercizio fisico) 7.4 [%] 99 ( ) 91.5(90-93) Albumina [g/100 ml] (4-5) Gamma gloguline ++ Elettroliti [mmol/l] Potassio 4.7 ( ) Sodio 68 (30-110) Calcio Fosfato Cloro Prodotti di scarto Urea, acido lattico

30 ANALISI DELLE DROGHE NEL SUDORE

31 VANTAGGI: La raccolta del campione non è invasiva L analisi del sudore è in grado di fornire informazioni sia sul consumo recente di droga, che una stima di esposizione nel corso di un periodo più lungo (settimane), a seconda del dispositivo utilizzato per la raccolta; L adulterazione del campione è piuttosto difficile SVANTAGGI: ANALISI DELLE DROGHE NEL SUDORE Volume raccolto piuttosto limitato (da pochi µl in condizioni normali fino a 1-5 ml quando il sudore viene stimolato dall esercizio fisico); Difficile fornire un risultato quantitativo a causa del fatto che il volume di sudore raccolto non è misurabile

32 mean MDMA amount ng/patch MDMA E SUDORE Time (h) Concentrazione media in funzione del tempo di MDMA contenuta in cerotti applicati sul dorso di 9 volontari e rimossi a differenti intervalli di tempo

33 MDMA ng / patch Assorbimento di MDMA attraverso la cute % change ng /patch I volontari hanno mostrato una riduzione delle concentrazioni di MDMA a 10 h. Il fenomeno potrebbe essere legato ad un riassorbimento dell MDMA attraverso la pelle Volunteer Time(h) Uno studio pilota ha confermato questa ipotesi Vol.A 240 Vol.B Assorbimento attraverso la pelle di 200 ng di MDMA aggiunto a cerotti applicati sulla schiena di 2 volontari Time (h)

34 Nr of cases PERFORMANCE DELLE METODOLOGIE ANALITICHE ng MDMA/patch GC-MS IMMUNOASSAY Confronto delle curve cinetiche dell MDMA in funzione del tempo (immunochimico vs GC/MS) Time (h) negative cases positive cases Performance di un test on-site applicato per 10 sec nelle ascelle di 9 volontari ( somministrazione di 100 mg MDMA) Time (h)

35 FINALITÀ DIAGNOSTICHE Stato di assuntore cronico Matrice biologica URINA (prelievi seriati a sorpresa)

36 Tempi di permanenza delle sostanze nelle urine sostanza T. Min (ore) T. Max (giorni) Amfetamina Cannabinoidi 6-18 Consumatori occasionali: fino a 10 giorni Consumatori cronici: anche 30 giorni Metaboliti cocaina Metadone Metamfetamina MDMA (ecstasy) Oppiacei 2 2-3

37 FINALITÀ DIAGNOSTICHE Comportamenti pregressi di abuso Matrice biologica CAPELLI

38 INCORPORAZIONE DI DROGHE NEI CAPELLI DURANTE LA CRESCITA BULBO DEL PELO

39 CAPELLI: Correlazione crescita/assunzione, velocità di crescita media = 1 cm/mese. È possibile fare una datazione del consumo. ALTRE FORMAZIONI PILIFERE: Crescono più lentamente dei capelli ed hanno fase più lunga di quiescenza. Non è possibile fare una datazione del consumo

40 Matrici biologiche Capelli VANTAGGI: PRELIEVO NON INVASIVO POSSIBILITA DI RILEVARE L ASSUNZIONE DELLE SOSTANZE DOPO SETTIMANE O MESI SVANTAGGI: DIFFICILE INTERPRETAZIONE DEL DATO ANALITICO INTERFERENZE: * USO DI PARTICOLARI DETERGENTI * TINTURE PER CAPELLI NON ESISTONO PROCEDURE STANDARDIZZATE PER: * PRELIEVO DELLA MATRICE * ESTRAZIONE DELLA MATRICE Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

41 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Proposta di linee guida per l analisi di farmaci e sostanze d abuso nei capelli Simona Pichini, Alessandro Palmeri, Manuela Pellegrini, Piergiorgio Zuccaro e Roberta Pacifici Laboratorio di Biochimica Clinica ISSN Rapporti ISTISAN 99/24

42 PRINCIPALI FATTORI DI VARIABILITA LEGATI ALLA NATURA DELLA MATRICE CHERATINICA I meccanismi di incorporazione della droga dentro i capelli; La natura del legame della droga con la matrice cheratinica; Lo stato solido e la disomogeneità del capello; La velocità di crescita dei capelli; La pigmentazione dei capelli; Il trattamento cosmetico dei capelli; L esposizione in vivo dei capelli a contaminazioni esterne.

43 EFFETTO DELLA PIGMENTAZIONE DEI CAPELLI SULLA INCORPORAZIONE DELLA DROGA CAPELLI BIANCHI CAPELLI PIGMENTATI Conc. Droga nei BIANCHI Conc. Droga nei PIGMENTATI = M 0,70 CI SONO GRANDI DIFFERENZE TRA SOGGETTI PER LA STESSA SOSTANZA, MENTRE IL RAPPORTO E SIMILE PER DIFFERENTI SOSTANZE NELLO STESSO SOGGETTO Da: M. Rothe et al. Forensic Sci Int 1997

44 EFFETTO DEL TRATTAMENTO COSMETICO DEI CAPELLI SULLE ANALISI DELLE DROGHE DECOLORAZIONE TINTURA PERMANENTE I prodotti usati sono delle basi forti che possono alterare/danneggiare la struttura del capello IL RISULTATO PUÒ ESSERE: perdita della droga incorporata nella matrice cheratinica (falso negativo) più facile incorporazione della droga in condizioni di contaminazione ambientale (falso positivo) Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

45 PROCEDURE ANALITICHE PER LA DETERMINAZIONE DELLE SOSTANZE D ABUSO NEI CAPELLI Prelievo dei capelli Decontaminazione del campione Trattamento meccanico del campione Digestione Estrazione Analisi Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

46 SCELTA DELLE METODICHE IMMUNOCHIMICHE Scelta del test immunochimico in funzione della specificità per la sostanza presente nella matrice cheratinica.

47 SOSTANZE D ABUSO E METABOLITI PRESENTI IN URINA E CAPELLI SOSTANZA URINE CAPELLI Ecstasy HMMA MDMA MDMA MDMA Cocaina BZE Cocaina Cocaina BZE Eroina M-glucuronide MAM M M H Metadone EDDP Metadone EMDP EDDP Metadone THC TH-COOH THC THC Nicotina Cotinina Nicotina Nicotina Cotinina

48 VALIDAZIONE DELLA METODICA IMMUNOCHIMICA PER L ANALISI IN MATRICE CHERATINICA Verifica della linearità della curva di taratura in matrice cheratinica (effetto matrice); Verifica della sensibilità (percentuale di veri positivi); Verifica della specificità (percentuale di falsi positivi); Costruzione curva ROC (relative operating curve). Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

49 ANALISI DI CONFERMA GC/MS LC/MS Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

50 PRESENTAZIONE DEI DATI Il risultato finale delle analisi va espresso in: mg di xenobiotico / mg di capelli Accanto al risultato quantitativo andrà sempre espressa la lunghezza in cm del segmento analizzato e la sua distanza dalla base del cuoio capelluto. Istituto Superiore di Sanità Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

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52 PROVENIENZA (%) DEI 41 LABORATORI CHE HANNO PARTECIPATO NEL ALL HAIRVEQ 62% 33% 5%

53 N FALSI POSITIVI E FALSI NEGATIVI: ANNI S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 ID CAMPIONE FALSI POSITIVI FALSI NEGATIVI

54 % DI RISPOSTE FALSI POSITIVI: CAMPIONI BIANCHI S3 S7 S10 S18 S21 S22 S24 S26 ID CAMPIONE

55 Analisi dell MDMA nei capelli (II) MDMA conc. ng/mg Subject n Tablets/month MDMA nei diversi segmenti di capelli di un consumatore come funzione delle dosi consumate mensilmente (riportate in una agenda) I problemi nel ricordare le dosi assunte nell ultimo anno potrebbero spiegare la mancanza di correlazione tra concentrazioni di MDMA nei segmenti distali e le dosi dichiarate

56 ACCERTAMENTO TOSSICOLOGICO- ANALITICO DI LIVELLO CONCENTRAZIONE SOGLIA (CUT-OFF) NEI TEST SU MATRICE PILIFERA Classe di sostanza MATRICE CHERATINICA Provv. 18/09/2008 Lunghezza : 5 cm (4-6 mesi) Peso : 200 mg Modalità di prelievo : 2 aliquote (A e B) Alternativa : peli pubici 200 mg OPPIACEI METABOLITI (morfina, codeina, 6- monoacetilmorfina) Concentrazione ng/mg COCAINA E METABOLITI 0,2 0,05 (benzoilecgonina) CANNABINOIDI METABOLITI 0,1 AMFETAMINA/METAMFETAMINA 0,2 MDMA-MDA-MDEA 0,2 METADONE 0,2 BUPRENORFINA 0,05 0,2

57 CRITICITA ANALISI DELLA MATRICE CHERATINICA NEGLI ACCERTAMENTI DI SECONDO LIVELLO G.U /10/08 Deve essere premesso che l analisi del previsto campione di capelli (della lunghezza definita di 5 cm) fornisce indicazioni circa l esposizione cronica o ripetuta del soggetto a sostanze stupefacenti o psicotrope in un periodo di circa 4, 6 mesi antecedentemente il prelievo. Al fine di dimostrare un uso cronico di droghe attraverso l analisi del capello è necessaria UN ANALISI SEGMENTALE DEL CAMPIONE (per esempio, capelli della lunghezza di 5 cm devono essere suddivisi in almeno tre frammenti che devono dare risultati analitici sovrapponibili). L analisi di un unico segmento, anche se riferito a diversi mesi (come appunto 5 o più centimetri), non da certezza di un uso ripetuto, ma può anche indicare un uso singolo di droghe o per un periodo di tempo molto limitato. Stramesi C, Polla M, Vignali C, et al. Forensic Sci Int 2008; 176: 34-7 Henderson L, Harkey MR, Zhou C, et al. J Anal Toxicol 1996; 20 :1-12

58 Per Partecipare Ai Programmi ORALVEQ ed HAIRVEQ Contattare il Reparto Farmacodipendenza Tossicodipenza e Doping Dell Istituto Superiore di Sanità Tel Fax osservatorio.fad@iss.it