Cosa si intende per CELLULA STAMINALE. stato altamente indifferenziato (morfologia - caratteristiche antigeniche)

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1 Cosa si intende per CELLULA STAMINALE stato altamente indifferenziato (morfologia - caratteristiche antigeniche) capacità illimitata di autorinnovamento per l intera vita dell organismo multipotenzialità proliferazione lenta (quiescenza) Inner cell mass Embryonic STEM CELL Somatic STEM CELL

2 ESISTONO VERE CELLULE STAMINALI nel SNC adulto? METODI STUDI in vitro = espianto di tessuto in cui è stata riscontrata neurogenesi e coltura di cellule dissociate STUDI in vivo = marcatura delle cellule e studio del lineage/utilizzo di antimitotici (cytosine-β-d-arabinofuranoside, AraC) in dosi sub-letali SVZ primi anni 90 Reynolds and Weiss striato in vitro Morshead and van der Kooy SVZ astrociti neurone SERUM-FREE MEDIUM + FATTORI DI CRESCITA (EGF/FGF-2) PROLIFERAZIONE INDUZIONE DIFFERENZIAMENTO Questo risultato non è una prova definitiva dell esistenza di NSC potrebbe trattarsi di una popolazione eterogenea di progenitori COMMITTED. oligodendrocita

3 Con questo esperimento si dimostra che da 1 unica cellula si ottengono i tre stipiti cellulari del SNC STEM CELLS!! Le cellule sono piastrate ad una densità tale da garantire 1 cellula/piastra NEURONI ASTROCITI OLIGODENDROCITI progenitore cellula staminale

4 Quale è la potenzialità? in vitro MULTIPOTENTIALITY SELF-RENEWING QUIESCENCE Le NSC dell adulto hanno caratteristiche simili alle NCS presenti nel SNC in sviluppo? Esistono diversi tipi di cellule staminali nel SNC? Cosa induce una cellula staminale o un progenitore a scegliere un destino es. gliale vs. neuronale? Le c. staminali o i progenitori delle aree neurogenetiche del SNC sono in grado di dare origine a neuroni diversi da quelli che producono normalmente?

5 Le NCS fetali ed adulte rispondono in modo simile a fattori di crescita, tuttavia è stato dimostrato che NSC espiantate in momenti diversi dello sviluppo e da diverse regioni del SNC reagiscono in modo diverso agli stessi fattori di crescita... Le NSC dell adulto hanno caratteristiche simili alle NSC presenti nel SNC in sviluppo? Esistono diversi tipi di cellule staminali nel SNC? Cosa induce una cellula staminale o un progenitore a scegliere un destino es. gliale o neuronale? Le c. staminali o i progenitori delle aree neurogenetiche del SNC sono in grado di dare origine a neuroni diversi da quelli che producono normalmente?

6 AREE NEUROGENICHE SVZ e Ippocampo AREE NON NEUROGENICHE Cellule multipotenti possono essere isolate da regioni del SNC (ES. IL MIDOLLO SPINALE E LA PARETE DEL III E IV VENTRICOLO) che non presentano neurogenesi in vivo. QUESTI RISULTATI FANNO IPOTIZZARE CHE NEL SNC DI ANIMALI ADULTI ESISTANO: -VERE C. STAMINALI = caratteristiche delle aree in cui persiste la neurogenesi -C. STAMINALI POTENZIALI che solo in presenza di particolari stimoli si trasformano in VERE C. STAMINALI Le NSC dell adulto hanno caratteristiche simili alle NSC presenti nel SNC in sviluppo? Esistono diversi tipi di c. staminali nel SNC? Cosa induce una cellula staminale o un progenitore a scegliere un destino es. gliale o neuronale? Le c. staminali o i progenitori delle aree neurogenetiche del SNC sono in grado di dare origine a neuroni diversi da quelli che producono normalmente?

7 programma genetico intrinseco stimoli ambientali STUDI in vitro: potenziali attributi di una cellula staminale in vivo LA CELLULA SARA IN GRADO DI DIFFERENZIARSI IN TUTTI I TIPI CELLULARI OTTENUTI in vitro? Esperimenti di trapianto di cellule 3 variabili: L origine delle c. trapiantate il sito in cui avviene il trapianto (area specifica del SNC) il momento dello sviluppo in cui avviene il trapianto (SNC embrionale, postnatale, adulto) Trapianti di cellule 1. ESPIANTO DI TESSUTO (embrionale, postnatale o adulto) 2. (ESPANSIONE IN VITRO CON FATTORI DI CRESCITA) 3. MARCATURA DELLE CELLULE CHE VERRANNO TRAPIANTATE 4. TRAPIANTO (in specifiche regioni del SNC di animali a diverso stadio di sviluppo e in animali adulti) 5. ANALISI DEL DESTINO DELLE CELLULE TRAPIANTATE: - localizzazione (homing) - fenotipo (markers) - integrazione (circuiti)

8 I RISULTATI OTTENUTI, PUR CON UNA GRANDE ETEROGENEITA DI RISPOSTA, SEMBRANO INDICARE L IMPORTANZA DETERMINANTE DEI FATTORI AMBIENTALI SULLA SCELTA DEL FENOTIPO FINALE 1. omotopico IPPOCAMPO ADULTO espianto trapianto espansione in vitro Produzione di fenotipo atteso: NEURONI E GLIA 2. eterotopico IPPOCAMPO ADULTO espianto espansione in vitro trapianto SVZ Acquisizione caratteristiche tipiche delle c. locali: MIGRAZIONE FENOTIPO

9 LE STESSE NSC TRAPIANTATE IN AREE NON NEUROGENICHE (cervelletto, striato) DELL ANIMALE ADULTO NON DANNO ORIGINE A NEURONI E SI DIFFERENZIANO IN CELLULE GLIALI Se si modifica l ambiente si osserva neurogenesi anche in aree non normalmente neurogenetiche (Alvarez-Buylla et al BMP-noggin nello striato). I fattori ambientali sono importanti in relazione alla capacità delle cellule di RICEVERLI ed ELABORARLI Potenzialità intrinseche donatore SUCCESSO DEL TRAPIANTO sopravvivenza acquisizione di un fenotipo specifico integrazione funzionale Proprietà ambiente ricevente

10 CAMBIAMENTO D IDENTITA La potenzialià delle cellule staminali somatiche è più ampia del previsto Geni che regolano alcune fasi della genesi e committment neurale nel sistema nervoso centrale Controllo della neurogenesi, proliferazione, uscita dal ciclo... stadi embrionali Geni proneurali precoci: Mash1, Ngn2, Sox Geni proliferativi Vax1, Emx2, Dlx2 Geni per uscire dal ciclo Vax1, Vax2 Geni del committment neuronale NeuroD, Dlx5, Dlx6 Geni per iniziare migrazione e differenziamento Ebf2 Geni del primo differenziamento neuronale NeuroD, NeuroM, NeuN, β3-tubulina, neurofilamenti Geni per il differenziamento gliale CoR bhlh ) Homeogenes HLH + ZF Controllo del destino differenziativo... Stadi embrionali Geni Dlx, Vax Gene ER81 (committment interneuroni olfattivi) ( Gene Islet1 (committment neuroni di proiezione dello striato) Controllo della nicchia neurogenica... Stadi post-natali Geni Noggin (committment neuronale) ( Bmp (committment gliale) Geni Notch-Delta Geni precoci Dlx, Emx... Fattori Trascrizionali Molti studi basati sui fenotipi di topi knock-out

11 Additional Reading Soria et al. (2004) Defective neurogenesis in the absence of Vax1. J. Neurosci 24: Garcia-Dominguez et al. (2003) Ebf is required for neuronal differentiation and cell cycle exit. Development 130: 6013 Galli et al. (2002) Emx2 regulates proliferation of adult stem cells. Development 129: 1633 Perera et al (2003) Defective neurogenesis in the absence of Dlx5. Mol Cell Neurosci 25: Yun et al. (2002) Mash1, Dlx and Notch function in differentiation of progenitor cells. Development 129: 5029 Nieto et al (2001) bhlh genes controls neuronal progenotors. Neuron 29: 401 Stuhmer et al (2002) Dlx genes induce GAD expression. Development 129: 245 Il destino dei neuroblasti generati nella VZ embrionale è stabilito da un complesso pattern di espressione genica

12 Ricapitolare gli eventi neurogenici utilizzando il modello delle colture di neurosfere Da SVZ adulta Parmar et al. (2003) Mol. Cell. Neurosci. 24: 741 Ricapitolare gli eventi neurogenici utilizzando il modello delle colture di neurosfere In vivo EGF bfgf In vitro Precursori precoci Cellule che formano neurosfere EGF bfgf Progenitori dello striato Progenitori olfattivi Neuroni proiezione striatali DLX GABA DARPP-32 Interneuroni BO DLX GABA ER81 Interneuroni del tipo BO DLX GABA ER81 Astrociti Oligodendrociti

13 Expression of Dlx5 in E12.5 mouse embryo Dlx5-/- Dlx5+/- VZ-SVZ GE OB Expression of Dlx genes at E14.5 LGE MGE X-gal anti-dll From basal brain neurospheres + bfgf -serum, 7 days Immunostaining neurotubulin GFAP Defective neuronal differentiation in NPCs from Dlx5-/- P0 brains. Single cell suspensions derived from neurospheres of normal (A) and mutant (B) mice were replated in differentiating medium. Cultures were stained with antibodies that recognize population-specific markers (neurotubulin for neurons, GFAP for astrocytes). Cultures of neonatal Dlx5-/- NPCs generated a much lower number of neurotubulin-positive neurons

14 Grafting di neuroblasti in colture organotipiche Cx EG BO?? 48 h 1. Migrazione tangenziale 2. Migrazione radiale Frammento di GE laterale OB Host WT Donor EGFP+ cells Regolazione globale della genesi e committment neurale nel sistema nervoso centrale Controllo della neurogenesi, proliferazione, uscita dal ciclo Geni proneurali precoci: Mash1, Ngn2, Sox Geni proliferativi Vax1, Emx2, Dlx2 Geni per uscire dal ciclo Vax1, Vax2 Geni del committment neuronale NeuroD, Dlx5, Dlx6 Geni per iniziare migrazione e differenziamento Ebf2 Geni del primo differenziamento neuronale NeuroD, NeuN, β3-tubulina, neurofilamenti Geni per il differenziamento gliale CoR Controllo del destino differenziativo... Stadi embrionali Geni Dlx, Vax Gene ER81 (committment interneuroni olfattivi) ( Gene Islet1 (committment neuroni proiezione dello striato) Controllo della nicchia neurogenica... Stadi post-natali Geni Noggin (committment neuronale) ( Bmp (committment gliale) Geni Notch-Delta Geni proneurali Dlx, Emx... cell-autonomous bfgf EGF BMP-Noggin Nurr Delta-Notch Fgf8 Shh TGF-alfa Wnt-Frz non cell-autonomous epigenetic modifications cell fate determination

15 Transcription Profiling per definire in termini biologici il concetto di stemness Ramalho-Santos al. (2002) Science 298: 597 Ivanova N.B. et al. (2002) Science 298: 601 Transcription Profiling per definire in termini biologici il concetto di stemness Hematopoietic SC-enriched Embryonic SC-enriched Ramalho-Santos al. (2002) Science 298: 597 Ivanova N.B. et al. (2002) Science 298: 601 Neural SC-enriched

16 L azione del segnale Nogo, di derivazione gliale, nell allungamento assonale Kim et al. (2003) Neuron 38: 187 Limiti nell uso delle cellule fetali per i trapianti problemi di tipo etico (uso di materiale da feti abortiti) purezza e vitalità delle cellule cellule postmitotiche, difficili da espandere e da conservare (la preparazione del tessuto donatore e l intervento chirurgico devono essere sincronizzati) La ricerca sulle NSC ha aperto nuove possibilità.

17 Approfondimenti Vescovi, R. Galli e A. Gritti. (2001) Le risorse delle cellule staminali somatiche. Le Scienze n.392 Rossi & Cattaneo (2002) Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews/Neuroscience 3: Galli R., Gritti A., Bonfanti L. e Vescovi AL. (2003) Neural stem cells-an overview. Circulation Research Alvarez-Buylla & Lim. (2004) Maintaining the germinal nihes in the adult brain. Neuron 41: Conover & Allen (2002) The subventricular zone: molecular and cellulare development. Cell Mol Life Sci. 59: 2128