Lo screening dell aplotiplo nella diagnosi della celiachia

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1 Martedì 7 giugno 2011 Lo screening dell aplotiplo nella diagnosi della celiachia Dott.ssa Lucia Terzuoli Dipartimento di Medicina Interna, Scienze Endocrino-Metaboliche e Biochimica Università degli Studi di Siena

2 CELIACHIA malattia multifattoriale Fattori ambientali Fattori genetici glutine HLA Altri geni Nelle malattie complesse i test genetici sono predittivi o di suscettibilità NON DIAGNOSTICO

3 Il complesso HLA (Human Leukocyte Antigen) Antigeni di istocompatibilità (trapianti) Complesso maggiore di Istocompatibilità (MHC) DP DQ DR Espresse su: Cellule B APC Macrofagi Espresse su: tutte le cellule nucleate Glicoproteine di membrana espresse come eterodimeri (catena α 34 Kda, catena β 29 Kda. Polimorfismo della tasca amminoacidica che determina diversa affinità ai vari peptidi antigenici.)

4 La regione HLA è la più densa di geni e la più polimorfica di tutto il genoma Esiste una probabilità su decine di milioni che vi sia un altro individuo con le stesse nostre caratteristiche HLA L estrema variabilità dei geni HLA garantisce maggiore resistenza agli agenti patogeni.

5 HLA HLADQ-B1 HLADQ-B1*02 HLADQ-B1*02:01 HLADQ-B1*02:03 La regione HLA e il prefisso per un gene HLA Un locus HLA specifico Un gruppo di alleli che codificano l antigene DQ Uno specifico allele HLA HLADQ-B1*02:04 HLADQ-B1*02:01:01 Un singolo allele Allele forme alternative di uno stesso gene Aplotipo combinazioni di alleli di loci vicini viene trasmesso su uno stesso cromosoma Genotipo Corredo genetico di un individuo DRB1*04:01 DRB1*04:01 DRB1*04:01 DRB1*03:01 DQB1*03:02 DQB1*03:02 DQB1*02:01

6 Nomenclatura HLA Tipizzazione sierologica Si identificano gli antigeni Sono relativamente pochi La nomenclatura è relativamente complessa Tipizzazione genica Si identificano i geni Sono molti La nomenclatura è esageratamente complessa

7 HLA II alleli con nomi ufficiali 1198

8 90% dei pazienti celiaci Eterodimero DQ2 HLA-DQA1*05/DQB1*02 10% dei pazienti celiaci Eterodimero DQ8 HLA-DQA1*03/DQB1*03:02

9

10 Bassissimo rischio DQB1* DQA1* DQB1* DQA1* DQ2 cis DQ2 trans DQ8 A rischio DQB1* DQA1* DQB1* DQA1* DQB1* DQA1* Alto rischio DQB1* DQA1* DQB1* DQA1*

11 Alleli HLA: DQA1*.,*.; DQB1* ;*. Presenza dell eterodimero DQ2 (DQA1*05, DQB1*02) Stato DQB1*02 omozigote: presente, assente, non determinato Presenza della sola catena beta del dimero DQ2 (DQB1*02) Presenza dell eterodimero DQ8 (DQA1*03, DQB1*03:02) La presenza di almeno una di tali condizioni è indicativa di suscettibilità alla celiachia e non implica lo sviluppo della malattia, la cui diagnosi deve essere verificata con test sierologici e biopsia intestinale. Assenza degli alleli HLA a rischio di celiachia Tale condizione rende altamente improbabile la comparsa della celiachia

12 Protocollo per la Diagnosi ed il Follow-up della Celiachia Ministero della Salute (legge 123/05) TEST DI I LIVELLO ANTICORPI ANTI ttg UMANA IgA (IgG nei deficit di IgA); EmA come test di conferma da eseguirsi in centri di riferimento nei casi dubbi AGA da ricercarsi solo nei bambini con età < 2 anni BIOPSIA DUODENALE Classificazione di Marsh, modificata da Oberhuber, da inquadrare nel contesto clinico, anticorpale e genetico. TEST DI II LIVELLO: HLA (dopo anticorpi e/o biopsia non diagnostici) Test eseguito per escludere celiachia Negatività DQ2/DQ8 bassissima probabilità di celiachia Positività DQ2 o DQ8 predisposizione alla malattia

13 Raccomandazioni per l esecuzione del test HLA Proposta congiunta Associazione Italiana Celiachia (AIC) Associazione Italiana Immunogenetica e Biologia dei Trapianti (AIBT) Società Italiana di Genetica Umana (SIGU) In caso di incertezza anticorpi e/o biopsia dubbio e discrepanti In soggetti appartenenti a categorie a rischio Familiari di primo grado degli affetti per decidere se continuare il follow-up in caso di sierologia negativa

14 EMA IgA positivo Diagnosi praticamente certa di MC SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgA positivi IgA normali EMA IgA EMA IgA negativo Ripetere a distanza di qualche mese SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgG positivi e AGA IgG positivi DQ2/DQ8 positivo SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-ttg IgA, IgA totali sieriche, AGA IgA e AGA IgG Anticorpi anti-ttg IgG e AGA IgG Anticorpi anti-ttg IgG positivi o AGA IgG positivi DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale NO biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgG negativi e AGA IgG negativi Anticorpi anti-ttg IgA negativi, AGA IgA e AGA IgG negativi IgA normali Quadro clinico associabile celiachia Ripetere i marcatori sierologici anche più di una volta, fino all età di 5 anni. PROCEDURA DIAGNOSTICA IN SOGGETTI CON MANIFESTAZIONI CLINICHE ED ETA INFERIORE A 5 ANNI PROCEDURA DIAGNOSTICA IN SOGGETTI CON MANIFESTAZIONI CLINICHE ED ETA SUPERIORE A 5 ANNI Anticorpi anti-ttg IgA e IgA totali sieriche Anticorpi anti-ttg IgA positivi IgA normali Anticorpi anti-ttg IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-ttg IgA negativi IgA normali EMA IgA Anticorpi anti-ttg IgG e AGA IgG Elevata probabilità di NO MC Anticorpi anti-ttg IgG positivi e AGA IgG positivi Anticorpi anti-ttg IgG negativi e AGA IgG negativi EMA IgA positivo EMA IgA negativo Diagnosi praticamente certa di MC Ripetere a distanza di qualche mese SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgG positivi o AGA IgG positivi NO biopsia duodenale HLA RICERCA ALLELI DQ2/DQ8 SI biopsia duodenale HLA DQ2/DQ8 positivo DQ2/DQ8 negativo SI biopsia duodenale NO biopsia duodenale

15 L'estrazione del DNA, l'amplificazione, la deposizione dell'amplificato sulle membrane di reazione, l'ibridazione e la relativa rivelazione, la lettura dell'avvenuta reazione costituiscono passaggi delicati e relativamente lunghi. Un'esecuzione non ottimale di uno di essi può compromettere definitivamente il risultato della tipizzazione. Operatore esperto. Laboratori accreditati dalla Federazione Europea di Immunogenetica (EFI) Laboratori di Genetica Medica Laboratori con documentata esperienza nel campo della Biologia Molecolare Il costo della tipizzazione è alto.

16 Limitato a Operatore laboratori esperto specializzati Tempo di esecuzione lungo Difficoltà di interpretazione dei risultati Costo molto elevato Celiac Gene Screen: identifica la suscettibilità, escludendo il 70% della populazione generale, che non svilupperà CD. Il limite di questo test è di non dicriminare l aplotipo DQ2 e DQ8. Celiac Gene Typing: identifica gli alleli associati con CD.

17 Reagenti pronti all uso Stabilità 1 anno Trasporto a temperatura ambiente Temperatura di stoccaggio +4 C Velocità esecuzione Estrazione DNA non purificato, ma altamente ottimizzato per amplificazione. Stessa procedura di estrazione per i due kit. Lettura

18 Estrazione e lisi DNA pungidito cartina Buffer di estrazione pronto all uso 200 µl sangue raccolto in provette con EDTA DNA 10 µl Tempo = 1 minuto

19 Preparazione PCR Cera per PCR pronta all uso 30 µl 26 µl lisato 20 µl Taq Mix 18 µl Taq Mix + 2 µl lisato Primer mix Primer mix. 12 provette da 0,2 ml contenenti i primer/sonde liofili. + = Agitare molto bene

20 Amplificazione Attivazione Tempo = 2h

21 Lettura dei risultati Lettore di fluorescenza BioRun

22 Screen Interpretazione automatica dei risultati Typing Tempo = 1 min

23 Dott. Elio Tonutti, Immunopatologia e Allergologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Udine P.za S.Maria della Misericordia 15, Udine in collaborazione con la Clinica Pediatrica della stessa Azienda Dott.ssa Maria Teresa Trevisan e Dott.ssa Alicia Benedetti, UOA di Laboratorio, Ospedale G. Fracastoro, Via della Circonvallazione, Verona BioDiagene S.r.l. Via Aquileia Palermo

24 74 campioni Celiac Gene Screen Concordanza 100% Celiac Gene Typing Precedente tipizzazione (kit Eurospital) Concordanza 100%

25 21 campioni Celiac Gene Screen/Celiac Gene Typing Concordanza 100% DR3-DQ2 eterozigote DR3-DQ2 eterozigote DR3-DQ2 eterozigote Non suscettibili Celiaco DR3-DQ2 eterozigote DR3-DQ2 omozigote

26 Un risultato DQ2/DQ8 negativo permette l eliminazione di periodici controlli clinici e sierologici e tranquillizza pazienti e familiari.

27 Scopo Determinare se la tipizzazione HLA possa ridurre i costi, grazie all eliminazione di continui controlli periodici in pazienti a rischio, eliminando i pazienti risultati negativi. Colonna verde: costo attuale Colonna rossa: costo pari alla metà Colonna blu: costo pari ad un quarto

28 Limitato a Operatore laboratori esperto specializzati Tempo di esecuzione lungo Facilità e velocità esecuzione. Estrazione veloce DNA, non purificato ma altamente ottimizzato per amplificazione. Tutto pronto uso. Kit CE IVD marcato CE0318 (Dichiarazione CE di conformità. Sistema di garanzia di qualità totale) Difficoltà di interpretazione dei risultati Lo strumento in automatico da la risposta. Bassa risoluzione per identificare i gruppi allelici, meno DQB1*03 media risoluzione. Costo molto elevato Screen: 96 pazienti - 20 euro singolo test Typing: 8 pazienti - 55 euro singolo test

29 EMA IgA positivo Diagnosi praticamente certa di MC SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgA positivi IgA normali EMA IgA EMA IgA negativo Ripetere a distanza di qualche mese Anticorpi anti-ttg IgG positivi e AGA IgG positivi SI biopsia duodenale DQ2/DQ8 positivo SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-ttg IgA, IgA totali sieriche, AGA IgA e AGA IgG Anticorpi anti-ttg IgG e AGA IgG Anticorpi anti-ttg IgG positivi o AGA IgG positivi DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale NO biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgG negativi e AGA IgG negativi Anticorpi anti-ttg IgA negativi, AGA IgA e AGA IgG negativi IgA normali Quadro clinico associabile celiachia Ripetere i marcatori sierologici anche più di una volta, fino all età di 5 anni. Ministero della Salute (legge 123/05) TEST DI II LIVELLO: HLA In caso di incertezza anticorpi e/o biopsia dubbio e discrepanti In soggetti appartenenti a categorie a rischio Familiari di primo grado degli affetti per decidere se continuare il follow-up in caso di sierologia negativa Anticorpi anti-ttg IgA e IgA totali sieriche Anticorpi anti-ttg IgA positivi IgA normali Anticorpi anti-ttg IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-ttg IgA negativi IgA normali EMA IgA Anticorpi anti-ttg IgG e AGA IgG Elevata probabilità di NO MC EMA IgA positivo EMA IgA negativo Anticorpi anti-ttg IgG positivi e AGA IgG positivi Anticorpi anti-ttg IgG negativi e AGA IgG negativi Diagnosi praticamente certa di MC Ripetere a distanza di qualche mese SI biopsia duodenale Anticorpi anti-ttg IgG positivi o AGA IgG positivi NO biopsia duodenale RICERCA ALLELI DQ2/DQ8 SCREENING DELL APLOTIPO TEST I LIVELLO SI biopsia duodenale DQ2/DQ8 positivo SI biopsia duodenale H L A DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale

30 Grazie per l attenzione

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