Ca r at t e r i z z a z i o n e t e c n o l o g i c a d e i c e p p i d i b at t e r i l at t i c i

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1 Capitolo II Ca r at t e r i z z a z i o n e t e c n o l o g i c a d e i c e p p i d i b at t e r i l at t i c i i s o l at i d a i m p a s t i a c i d i p e r l a p r o d u z i o n e d e l Co r n e t t o, u n pane trdizionale della Basilicata (Sud Italia ) Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione del pane Cornetto di Matera, sono stati identificati mediante SDS-PAGE delle proteine intracellulari totali e testati per la capacità acidificante, attività antimicrobica e produzione di esopolisaccaridi (EPS). Il 55% degli isolati apparteneva alla specie Lactobacillus plantarum, il 15% e il 13% alle specie Leuconostoc mesenteroides e Lb. curvatus, rispettivamente. Cinque ceppi di Lb. paraplantarum, due di Weissella cibaria e uno di Lb. pentosus sono stati ugualmente isolati tra la microflora lattica. Diversi ceppi di Lb. plantarum e Leuc. mesenteroides presentavano un elevata capacità acidificante. L attività antimicrobica è stata testata nei confronti di cinque ceppi indicatori. Le specie avevano diversi profili di inibizione e in alcuni casi l attività antimicrobica era ceppo-specifica. Lb. plantarum aveva il più ampio spettro di inibizione, mentre gli isolati di W. cibaria e Leuc. mesenteroides non mostravano alcuna attività antimicrobica. Nessun ceppo aveva attività antimicrobica nei confronti di Bacillus cereus. L attività inibitoria di cinque ceppi era probabilmente dovuta alla produzione di batteriocine. Gli isolati di Lb. curvatus non erano in grado di produrre EPS in substrato solido, mentre tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e W. cibaria producevano destrano dal saccarosio. Alcuni ceppi di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum producevano EPS da diversi zuccheri in substrato solido. La produzione in substrato liquido era differente a seconda della specie. Diversi ceppi di Lb. plantarum hanno mostrato la più alta produzione di EPS nei substrati contenenti glucosio e maltosio come fonte di carbonio, altri avevano una buona produzione in tutti i terreni Introduzione La fermentazione degli impasti acidi è importante nella produzione di pane perché contribuisce al sapore e alla consistenza del prodotto finito. Gli impasti acidi sono una miscela di farina di frumento o segale e acqua, fermentato da un associazione di batteri lattici e lieviti, la cui composizione 39

2 dipende dalla tecnologia applicata per la sua produzione (e Gänzle Vogel 2002; Vogel et al., 1999). Le differenze nella farina, negli ingredienti e nella tecnologia possono influenzare la composizione microbica dell impasto e le caratteristiche dei prodotti da forno (Corsetti et al., 2001). I batteri lattici svolgono un ruolo importante nella fermentazione acida (Foschino et al. 1999; Gobbetti, 1998). Le specie omofermentanti sono importanti per la produzione di pane con mollica porosa e contribuiscono alla qualità sensoriale, mentre quelle eterofermentanti, con i loro prodotti metabolici, influenzano il sapore e promuovono la lievitazione del impasto (Rocha e Malcata 1999). In Italia più di 200 tipi di pani tradizionali sono stati recentemente classificati dall Istituto Nazionale di Sociologia Rurale (Insor, 2000). Gli impasti acidi sono utilizzati in oltre il 30% dei prodotti da forno, alcuni dei quali provengono da una tradizione molto antica e si differenziano per il tipo di farina, ingredienti, tecnologia e shelf-life (De Vuyst e Neysens, 2005). Il Cornetto è pane un tradizionale, prodotto nelle piccole panetterie di Matera (Basilicata, Italia meridionale), che recentemente ha ottenuto la denominazione IGP da parte della Comunità Europea (decreto 9/6/2007, Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea n. 239, 11/10/2004). Secondo lo standard IGP, questo pane è prodotto utilizzando farina di grano duro, NaCl (2% w/w), acqua e madre acida come agente lievitante. Se necessario, del lievito compresso (max 1% w/w) può essere aggiunto per rinforzare il processo di lievitazione. Gli impasti acidi utilizzati per la produzione del Cornetto sono quelli di tipo Ib (De Vuyst e Neysens, 2005): la fermentazione è effettuata a temperatura ambiente (20-30 C), con un ph finale pari 4, ed è caratterizzata da continui rinfreschi giornalieri per mantenere la microflora in uno stato attivo. L obiettivo di questo studio è stato l identificazione e la caratterizzazione tecnologica dei batteri lattici isolati da impasti acidi per la produzione del Cornetto, al fine di selezionare ceppi con proprietà tecnologiche interessanti e rilevanti per la produzione di pane Materiali e metodi Ceppi e condizioni di coltura Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione del Cornetto di Matera e identificati precedentemente con test fenotipici (Ricciardi et al., 2002), sono stati utilizzati in questo studio. I ceppi sono stati 40

3 mantenuti come colture liofilizzate in latte (11% w/v) contenente lattosio (40 g/l) e acido ascorbico (20 g/l) nella collezione dei microrganismi del Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università della Basilicata (Potenza, Italia) e propagate in MRS liquido a 30 C. Lactobacillus paracasei DSM4905, Lb. plantarum DSM20174, Micrococcus flavus DSM1790 (ottenuti da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkülturen, Braunschweig, Germania), Listeria innocua BL86/26 (ottenuto dalla Collezione National Dairy Products Research Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irlanda) e Bacillus cereus ATCC9139 (ottenuto da American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, Stati Uniti d America) sono stati utilizzati come indicatori per testare l attività antimicrobica (vedi sotto). Lb. paracasei DSM4905 e Lb. plantarum DSM20174 sono stati coltivati in MRS liquido a 30 C per 16 ore, mentre M. flavus DSM1790, L. innocua BL86/26 e B. cereus ATCC9139 sono stati coltivati in Tryptone Soy Broth (Oxoid) con 0,6% (w/v ) di estratto di lievito (Oxoid) (TSBYE) a 30 C per 16 ore Identificazione mediante SDS-PAGE delle proteine cellulari totali I ceppi di batteri lattici sono stati identificati mediante SDS-PAGE delle proteine cellulari totali, come descritto da Ricciardi et al. (2005). I ceppi isolati dagli impasti e i ceppi di riferimento sono statai coltivati in APT liquido. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione (12000 xg, 5 min), lavate due volte in tampone Tris/HCl 50 mmol/l, ph 8, e risospese in 150 μl dello stesso tampone contenente 2 mg di lisozima/ml (Sigma). Delle biglie di vetro (0,15 a 0,212 mm di diametro, Sigma) sono state aggiunte e la sospensione cellulare è stata agitata su vortex ad alta velocità per 3 min. Le sospensioni cellulari sono state incubate a 37 C per 1 ora e sottoposte a tre cicli di sonicazione (10 min per ogni trattamento, potenza 10%; Sonorex Super 10P, Bandelin, Berlino). Dopo l incubazione, le biglie di vetro e i frammenti di cellule sono stati rimossi mediante centrifugazione (12000 xg, 5 min) e i surnatanti sono stati utilizzati per l SDS-PAGE. La concentrazione delle proteine nei lisati cellulari è stata determinata utilizzando il metodo Bradford (Bradford, 1976). Le corse elettroforetiche sono state realizzate utilizzando un apparato MiniProtean III (Bio-Rad Laboratories) e dei gel contenenti una concentrazione di acrilamide/bis al 10% w/v (Piraino et al., 2002). Undici campioni (contenenti da 5-10 μg di 41

4 proteine) e due standard molecolari (Sigma) sono stati applicati a ciascuna gel. I gel sono stati corsi con un intensità di 20 ma per 3 ore utilizzando un unità Power Pack 3000 (Bio-Rad). Le immagini dei gel sono state acquisite mediante scanner, salvate nel software Diversity Database TM (Bio-Rad Laboratories Ltd, Watford, Herts, Regno Unito) ed elaborate per l identificazione delle bande. I dati ottenuti dal software Diversity Database TM sono stati importati nel software Microsoft Excel TM (Microsoft Corporation, 2003) per un ulteriore elaborazione Caratterizzazione tecnologica degli isolati Capacità acidificante Le culture cellulari in SDB modificato (Kline e Sugihara, 1971) sono state ottenute inoculando (1% v/v) e incubando per 16 ore a 30 C il substrato SDB con le colture congelate. Dopo l incubazione, le culture cellulari sono state standardizzate ad una densità ottica a 650 nm (DO 650 ) pari a 1 ed utilizzate per inoculare (5% v/v) tubi sterili contenenti SDB liquido. Il ph è stato misurato dopo 6 e 24 ore e la sua diminuzione ( ph) è stata calcolata, per ogni tempo di incubazione, come la differenza tra i valori al tempo t=0 ore ed i valori ai tempi successivi Attività antimicrobica La capacità inibitoria contro Lb. paracasei DSM4905, Lb. plantarum DSM20174, M. flavus DSM1790, L. innocua BL86/26 e B. cereus ATCC9139 è stata testata utilizzando il metodo descritto da Parente et al. (2001). Lb. paracasei DSM4905 e Lb. plantarum DSM20174 sono stati propagati su MRS agar modificato (MRS liquido tamponato a ph 6,5 contenente acido morfolin propanosulfonico 0,1 mol/l, Sigma, e Agar 0,6% w/v, Oxoid), mentre L. innocua BL86/26, M. flavus DSM1790 e B. cereus ATCC9139 su TSBYE con 0,6% w/v di agar. Il diametro delle zone di inibizione è stato misurato utilizzando un calibro. I ceppi con una zona di inibizione con diametro > 10 mm avevano attività antimicrobica. Per valutare se l inibizione era dovuta alla presenza di batteriocine, il test è stato ripetuto in presenza di 5 μl di tripsina (Sigma), chimotripsina (Sigma) o pronase (Boehringer). Le soluzioni sono state preparate sciogliendo 0,2% (w/v) di enzima in una soluzione di tampone Tris 50 mmol/l (ph 7,5) contenente CaCl 2 5 mmol/l, filtrata con un filtro Millex-GV (Millipore spa, Milano, Italia). Sulle piastre è

5 stato inserito un controllo negativo costituito da tampone sterile senza enzimi e l assenza della zona di inibizione enzimatica era la prova della presenza delle batteriocine Produzione di EPS I ceppi di batteri lattici sono stati testati per la produzione di esopolisaccaridi (EPS) su piastre di MRS agar contenenti il 2% (w/v) di glucosio (MRS) o di maltosio (mmrs) o il 5% (w/v) di saccarosio (smrs) come fonti di carbonio. Le piastre sono state incubate a 30 C per 48 ore e i ceppi che producevano colonie viscose erano produttori di EPS. I ceppi produttori di EPS in substrato solido sono stati selezionati per la produzione di EPS in substrato liquido, testata utilizzando il metodo capillari dei capillari da ematocrito come descritto da Ricciardi et al. (1997). La concentrazione di EPS in substrato liquido (MRS, mmrs, smrs) è stata misurata utilizzando il metodo Dubois, dopo la rimozione dei carboidrati semplici attraverso cromatografia liquida ad esclusione molecolare (Ricciardi et al., 1998). Otto ceppi di Lb. plantarum e/o Lb. paraplantarum, con una concentrazione di EPS > 50 mg/l, sono stati utilizzati per un ulteriore esperimento di mmrs liquido in cui è stata misurata la concentrazione di EPS (metodo Dubois) e la viscosità del substrato con un viscosimetro digitale (Brookfield DV-I +; Brookfield Ingegneria Laboratories, Stoughton, MA, USA) dotato di una girante S21C ad una velocità di 100 giri/min a 10 C Analisi statistica L analisi statistica delle proteine identificate mediante SDS-PAGE è stata effettuata utilizzando una trasformazione logaritmica del peso molecolare (log kda), come descritto da Piraino et al. (2002). Le analisi sono state effettuate nel range tra 10 kda e 126 kda, individuando 23 classi di proteine. La cluster analysis gerarchica (UPGMA) è stata effettuata utilizzando una distanza Gamma. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software Systat 10 per Windows (SPSS, Chicago, IL, Stati Uniti d America) Reagenti e substrati Dove non specificato tutti i reagenti sono stati ottenuti dalla Sigma-Aldrich (Milan, Italy), mentre i terreni di crescita e gli ingredienti sono stati ottenuti dalla Oxoid (Basingstoke, Hampshire,UK). 43

6 3. Risultati e discussione Identificazione dei batteri lattici isolati da impasti acidi Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione del Cornetto di Matera, identificati precedentemente con test fenotipici (Ricciardi et al., 2002), sono stati scelti a caso tra 407 isolati e la loro identificazione è stata confermata attraverso SDS-PAGE delle proteine cellulari totali. La correlazione tra i ceppi di riferimento e i ceppi isolati dagli impasti è mostrata in Figura 1. Figura 1. Dendrogramma della distanza (gamma) tra i ceppi di batteri lattici isolati dal Cornetto di Matera. 44

7 La classificazione ha generato otto gruppi ad una distanza arbitraria di 0,24. La maggior parte dei ceppi identificati appartenevano alle specie eterofermentanti facoltative Lactobacillus paraplantarum (gruppo 2), Lb. plantarum (gruppo 3), Lb. pentosus (gruppo 4) e Lb. curvatus (gruppo 6). Ceppi appartenenti alle specie eterofermentanti obbligate Leuconostoc mesenteroides e Weissella cibaria sono stati ugualmente identificati (gruppi 1 e 5, rispettivamente). I ceppi della specie Leuc. mesenteroides non sono stati identificati a livello di sottospecie, poichè i pattern SDS-PAGE delle sottospecie Leuc. mesenteroides spp. mesenteroides e Leuc. mesenteroides spp. cremoris erano molto simili tra di loro. La percentuale di ceppi eterofermentanti obbligati e facoltativi è risultata inferiore a quella riscontrata in altri impasti acidi italiani (Corsetti et al., 2001; Gobbetti et al., 1994) in cui Lb. sanfranciscensis, in associazione con Lb. plantarum o con Lb. alimentarius, era la specie dominante. Una simile composizione, sia in termini di percentuale di ceppi eterofermentanti obbligati e facoltativi che di specie associate, è stata trovata negli impasti acidi utilizzati per la produzione del pane di Altamura, in cui l 88% degli isolati appartenevano alle specie Lb. plantarum, Lb. casei e Lb. paracasei e il 12% a Lb. brevis e Leuc. mesenteroides (Ricciardi et al., 2005). Uno studio sulla popolazione microbica di impasti acidi tradizionali siciliani ha recentemente confermato che i ceppi di Lb. plantarum hanno una grande rilevanza: tra il 45 isolati di batteri lattici, 17 sono stati identificati come Lb. sanfranciscensis, 14 come Lb. plantarum, 4 come Lb. kimchii/lb. alimentarius e 3 come Lb. casei (Randazzo et al., 2005). Alte percentuali di specie omofermentanti (Lb. plantarum e Lb. pentosus; dal 68% nel pane Carasau al 98% nel pane Moddizzosu) sono state trovate negli impasti acidi utilizzati per la produzione di alcuni pani tipici della Sardegna (Catzeddu et al., 2005). In questo studio sulla diversità delle comunità di batteri lattici è stato dimostrato che le specie eterofermentanti non dominano la microflora degli impasti tradizionali sardi, ad eccezione di alcuni campioni derivanti da impasti per la produzione del pane Zichi. L identificazione dei ceppi di W. cibaria, ottenuta in questo studio, ha confermato i risultati ottenuti da De Vuyst et al. (2002). W. cibaria, una specie geneticamente affine a W. confusa (Bjorkroth et al., 2002), è stata isolata per la prima volta da impasti acidi greci preparati senza l aggiunta di lievito. Questa specie eterofermentante obbligata è stata, speso, trovata 45

8 in associazione con ceppi appartenenti a Lb. sanfranciscensis, Lb. brevis e Lb. paralimentarius. Ceppi di W. confusa, invece, sono stati recentemente isolati da farine biologiche e impasti acidi per la produzione di pani del Centro e Sud Italia, insieme a ceppi di Lb. sanfranciscensis, Lb. brevis, Lb. alimentarius, Lb. plantarum, Lb. farciminis e Lb. fructivorans (Corsetti et al., 2003). Anche se in percentuali e in associazioni diverse, le specie identificate in questo studio sono state isolate in impasti prodotti in altri paesi europei. Le associazione tra Lb. plantarum, Lb. brevis e Lb. fermentum, e tra Lb. acidophilus e Lb. plantarum dominano gli impasti di segale In Russia e in Finlandia, rispettivamente (De Vuyst e Neysens, 2005). Batteri lattici appartenenti alle spceie Lb. brevis e Lb. curvatus sono le specie più frequentemente isolati in impasti acidi portoghesi preparati con farina di mais (Rocha e Malcata, 1999). Caratterizzazione tecnologica dei batteri lattici Per selezionare ceppi da utilizzare come colture starter nella produzione del Cornetto di Matera, è stata effettuata una caratterizzazione tecnologica preliminare dei 41 isolati di batteri lattici. I ceppi sono stati caratterizzati sulla base della capacità acidificante, dell attività antimicrobica e della produzione di esopolisaccaridi (EPS). La Figura 2 mostra la distribuzione della capacità acidificante dei ceppi dopo 6 e 24 ore di incubazione a 30 C in substrato sintetico (box a e b, rispettivamente). La diminuzione del ph (ΔpH) variava da 0,1 a 1,1 unità dopo 6 ore e da 0,7 e 2,8 unità dopo 24 ore. Una elevata variabilità tra i ceppi delle specie Lb. curvatus e Leuc. mesenteroides è stata osservata dopo 6 e 24 ore. Al contrario, gli isolati appartenenti alla specie W. cibaria e al gruppo Lb. plantarum (che comprende le specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb. pentosus) hanno mostrato una simile diminuzione di ph. I ceppi di W. cibaria e alcuni di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum avevano la più alta capacità acidificante dopo 6 ore di incubazione, mentre i ceppi della specie Lb. curvatus presentavano i più bassi valori della diminuzione di ph. Al termine dell incubazione, la maggior parte dei ceppi appartenenti al gruppo Lb. plantarum e alcuni ceppi della specie Leuc. mesenteroides avevano i più alti livelli di capacità acidificante. L acidificazione dell impasto, a causa della produzione di acido lattico da ceppi omofermentanti e di acido lattico e acetico da ceppi eterofermentanti, 46

9 è un importante attività metabolica nella produzione di pane. La produzione di acidi organici durante la fermentazione consente di raggiungere un ph inferiore a 5, efficace nel prevenire il deterioramento noto come pane filante causata da ceppi di Bacillus spp., in particolare di Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (Pepe et al., 2003). L acido lattico e acetico prodotti durante la fermentazione hanno un piccolo effetto sul sapore del pane. Tuttavia, se combinati con l etanolo e altri prodotti di fermentazione, rafforzano la percezione dell aroma (Rock, 1996). In realtà, quando il rapporto tra lattato/acetato (quoziente di fermentazione, FQ) è nel range tra 2,0 e 2,7 viene percepito un piacevole odore del pane. La diminuzione del ph è importante anche per ottenere corrette proprietà reologiche e sensoriali nel pane (Rock, 1996). Figura 2. Grafici della distribuzione del decremento di ph dopo 6 ore (a) e 24 ore (b) tra i ceppi di batteri lattici isolati da impasti acidi utilizzati per la produzione del Cornetto di Matera. Lb. curvatus (Lbcu); Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. plantarum (Lbplgroup); Leuc. mesenteroides (Leme); W. cibaria (Wecb). (a) (b) L attività antimicrobica dei batteri lattici è stata testata contro ceppi che sono starter o contaminanti dei prodotti da forno. Nessuno ceppo di W. cibaria e Leuc. mesenteroides ha mostrato attività antimicrobica nei confronti dei ceppi indicatori. Gli isolati di Lb. curvatus non erano in grado di inibire M. flavus DSM1790, mentre è stata trovata attività antilisteriale tra i ceppi appartenenti alle specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb. pentosus (dati non mostrati). La specie Lb. plantarum aveva il più ampio spettro di inibizione; alcuni ceppi, infatti, mostravano zone di inibizione contro 47

10 L. innocua e Lb. plantarum, altri contro M. flavus e Lb. paracasei. Tutti i ceppi avevano una bassa attività antagonista nei confronti di B. cereus. Per alcuni ceppi è stata trovata un attività inibitoria di natura proteica. La Tabella 1 mostra i risultati dei sei ceppi di batteri lattici con attività inibitoria di natura proteica (possibile produzione di batteriocine). La resistenza agli enzimi proteolitici è stata testata sui ceppi che hanno mostrato il più ampio spettro di inibizione. Ad eccezione di Lb. plantarum DBPZ1019, tutti i ceppi erano sensibili all azione dei tre enzimi proteolitici ed erano inibitori contro Lb. plantarum, mentre solo due ceppi (Lb. curvatus DBPZ1024 e Lb. plantarum DBPZ1019) hanno mostrato inibizione nei confronti di Bacillus cereus. Tabella 1. Attività antimicrobica dei batteri lattici isolati da impasti acidi utilizzati per la produzione del Cornetto di Matera Ceppi Indicatori a BC LI LBP LBPL MF Enzimi b Lb. curvatus DBPZ T, C, P Lb. pentosus DBPZ T, C, P Lb. plantarum DBPZ T, C, P Lb. plantarum DBPZ T, C, P Lb. plantarum DBPZ T, C, P Lb. plantarum DBPZ C -, nessuna zona di inibizione; +, diametro della zona di inibizione < 5 mm; + +, diametro della zona di inibizione tra 5 and 10 mm; + + +, diametro della zona di inibizione 10 mm. a BC, B. cereus ATCC9139; LI, L. innocua BL86/26; LBP, Lb. paracasei DSM4905; LBPL, Lb. plantarum DSM20174; MF, M. flavus DSM1790 b T, tripsina; C, chimotripsina; P, pronase Gli studi sulla produzione dei composti antimicrobici prodotti dai batteri lattici degli impasti acidi sono impartanti per ridurre la contaminazione microbica durante la fermentazione (Pepe et al., 2003; Corsetti et al., 1996) e per spiegare la competizione tra microflora lattica, al fine di selezionare ceppi competitivi (Torodov et al., 1999). Questo studio, in accordo con Corsetti et al. (1996), ha dimostrato che gli isolati erano in grado di inibire altri ceppi appartenenti al genere Lactobacillus, anche se i profili di inibizione erano ceppo-specifici Corsetti et al. (1996) hanno dimostrato la produzione di batteriocine da Lb. 48

11 sanfranciscensis C57. In un secondo lavoro, Corsetti et al. (2004) hanno confermato la presenza di batteriocine in due ceppi di Lb. plantarum e Lb. pentosus isolati da impasti acidi. Queste batteriocine erano caratterizzate da un limitato spettro di inibizione e non avevano efficacia nei confronti di Bacillus spp., Listeria innocua e lieviti. Settanni et al. (2005) hanno dimostrato la presenza di attività inibitoria nel ceppo Lc. lactis ssp. lactis M30 durante la fermentazione degli impasti acidi. La produzione di batteriocine nella specie Lb. plantarum è stata dimostrata da Todorov et al. (1999), che hanno isolato e ha caratterizzato la batteriocina plantaricina ST341 da Lb. plantarum ST31. Lb. amylovorus DCE 471, un ceppo importante negli impasti di segale di tipo II per la sua elevata e rapida capacità acidificante, è un produttore di batteriocine (amylovorina) durante la fermentazione (Messens et al., 2002). La Tabella 2 mostra i risultati dello screening dei ceppi per la produzione di EPS in substrato solido e liquido. I ceppi di Lb. curvatus non erano in grado di produrre EPS in substrato solido, mentre tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e W. cibaria producevano destrano da saccarosio. Alcuni ceppi di Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb. pentosus erano in grado di produrre EPS dai diversi zuccheri in substrato solido. Gli isolati di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum hanno mostrato la più alta produzione di EPS in substrato liquido contenente il maltosio come fonte di carbonio. Tuttavia, dei flussi relativamente elevati sono stati osservati nei ceppi di Lb. plantarum e in due ceppi di Lb. paraplantarum quando erano coltivati in MRS contenenti glucosio o di saccarosio. Al contrario, tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e W. cibaria avevano la più alta produzione di EPS in MRS liquido contenente saccarosio come fonte di carbonio. I risultati della produzione di EPS in substrato liquido (MRS contenente maltosio) sugli otto ceppi selezionati di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum sono riportati nella Tabella 3. La quantità di EPS prodotti da Lb. plantarum e Lb. paraplantarum variava da 140 a 297 mg/l. Il più alto valore di viscosità è stato osservato per il ceppo Lb. plantarum DBPZ1014. Tuttavia, la viscosità del substrato e la concentrazione di EPS non sono correlati. Infatti, quando Lb. plantarum DBPZ0998 o Lb. plantarum DBPZ1015 erano coltivati in mmrs liquido i valori di viscosità erano alti ma la produzione di EPS era molto bassa, al contrario, il substrato fermentato con Lb. paraplantarum DBPZ0997 aveva il più basso valore di viscosità ma la più alta concentrazione EPS. Gli EPS sintetizzati dai batteri lattici svolgono un ruolo importante nella produzione dei prodotti lattiero-caseari. Gli EPS possono, infatti, sostituire 49

12 Tabella 2. Screening per la produzione di for EPS in substrato liquido e solido Ceppi Substrati a Pick test MRS Pick test mmrs Pick test smrs Flusso b MRS Flusso b mmrs Flusso b smrs Lb.paraplantarum DBPZ Lb. paraplantarum DBPZ Lb. paraplantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Lb. plantarum DBPZ Leuc. mesenteroides DBPZ d Leuc. mesenteroides DBPZ d Leuc. mesenteroides DBPZ d Leuc. mesenteroides DBPZ d Leuc. mesenteroides DBPZ d Leuc. mesenteroides DBPZ d Leuc. mesenteroides DBPZ d W. cibaria DBPZ d W. cibaria DBPZ d , colonie viscose; d, colonie di destrano; -, nessuna colonia viscosa o di destrano a MRS, substrato con glucosio; mmrs, substrato con maltosio; smrs, substrato con saccarosio b rapporto tra il flusso del substrato fermentato e il flusso di controllo (massimo rapporto del flusso = 12) 50

13 Tabella 3. Produzione di EPS e viscosità nel substrato liquido Ceppi Substrato Viscosità a 100 rpm (cp) EPS (mg/l) Lb. paraplantarum DBPZ1013 mmrs Lb. paraplantarum DBPZ0997 mmrs Lb. plantarum DBPZ0987 mmrs Lb. plantarum DBPZ0988 mmrs Lb. plantarum DBPZ0992 mmrs Lb. plantarum DBPZ0998 mmrs Lb. plantarum DBPZ1015 mmrs Lb. plantarum DBPZ1014 mmrs gli idrocolloidi utilizzati per migliorare la tessitura, la viscosità, la struttura delle micelle di caseina, la sineresi e la stabilità dei formaggi (Duboc e Mollet 2001). Tuttavia, l importanza degli EPS nella produzione di pane non è stata ancora interamente descritta. Gli EPS prodotti durante la fermentazione sono potenzialmente in grado di influenzare le proprietà reologiche dell impasto e di conseguenza il volume, la tessitura e la conservazione del pane (Korakli et al., 2001). Recentemente, Korakli et al. (2003) hanno dimostrato che Lb. sanfranciscensis LTH2590 è in grado di produrre da saccarosio un tipo di levan-fruttano che influenza positivamente l impasto e la tessitura del pane, mentre Lb. reuteri LB121 produce glucano e levano dalla stessa fonte di zucchero (van Geel-Schutten et al., 1998). Gli EPS, inoltre, possono influenzare la flora intestinale, poichè i fruttani e i levani stimolano la crescita dei bifidobacteria (Thieking et al., 2003). Il presente studio ha dimostrato che alcuni ceppi di batteri lattici possono essere utilizzati come coltura starter per la produzione di pane, grazie alla loro capacità acidificante, attività antimicrobica e produzione di EPS. Tuttavia, queste proprietà tecnologiche, insieme ad altre attività del metabolismo microbico come la proteolisi, dovrebbe essere studiate in dettaglio per comprendere maggiormente il ruolo dei batteri lattici durante la fermentazione degli impasti acidi. 51

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