Probiotici: profili di sicurezza. Lorenzo Morelli Istituto di Microbiologia UCSC, Piacenza, Italy

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Leonardo Carlini
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1 Probiotici: profili di sicurezza Lorenzo Morelli Istituto di Microbiologia UCSC, Piacenza, Italy

2 In questa presentazione: Definizioni di sicurezza batterica Il caso dei probiotici Antibiotico-resistenza

3 Sicurezza: definizioni 1.Pericolo (hazard): la presenza di una potenziale causa di danno (hazard: The way in which an object or a situation may cause harm) 2.Esposizione al pericolo (durata e modalità del contatto) 3.Rischio: la probabilità che il pericolo (hazard) da potenziale diventi reale

The way in which an object or a situation may cause harm) 2.

4 Sicurezza batterica: Divisione in gruppo di rischio 1.Scarsa possibilità di causare malattie nell uomo 2.Possono causare malattie nell uomo ma con bassa capacità epidemica; sono presenti efficaci mezzi di profilassi e terapia.

5 Sicurezza batterica: Divisione in gruppo di rischio 3. Possono causare malattie nell uomo ma con bassa capacità epidemica; sono presenti efficaci mezzi di profilassi e terapia. 4. Possono causare malattie nell uomo ma con bassa capacità epidemica; NON sono presenti efficaci mezzi di profilassi e terapia.

presenti efficaci mezzi di profilassi e terapia. 4.

6 Sicurezza batterica: Alcuni esempi: 1. E.Coli K12, lattobacilli e batteri con lunga storia d uso sicuro nella catena alimentare, Saccharomyces cerevisiae 2. Streptococcus sp., Legionella sp., Clostridium tetani, Salmonella, 3. Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis Yersinia pestis

catena alimentare, Saccharomyces cerevisiae 2. Streptococcus sp.

7 Lunga storia d uso sicuro: 1. In USA :GRAS (non ha nessun valore nella UE) 2. UE: definizione di QPS (Qualificato Presuntivamente Sicuro) uso INTERNO di EFSA (ma anche lista di riferimento per i produttori)

8 Lunga storia d uso sicuro nella UE:

9 Taxonomic groups: Identificazione tassonomica Classificazione è il raggruppare gli organismi in gruppi tassonomici (taxa) sulla basi delle similarità. Nomenclatura è l asssegnazione di un nome tassonomico secondo le regole internazionali. (IUMS) determina che un batterio appertiene ad un gruppo tassonomico (genere, specie).

Nomenclatura è l asssegnazione di un nome tassonomico secondo le regole

10 IDENTIFICAZIONE DELLA SPECIE Sau 3A Hinf I GEL ANALYSIS OF AMPLIFIED AND RESTRICTED DNA ENCODING FOR 16S RNA (ARDRA - L. rhamnosus) (Ventura et al,2000)

11 Ma non basta identificare la specie In vitro and in vivo results clearly established that there are significant differences among strains of the same species; these differences dramatically affect their probiotic performances. Since 1979 (Gorbach-Goldin patent) these differences have been used to select bacteria to be patented and to be deeply characterised. Molecular biology allowed to type each single strain and to monitor its fate after ingestion.

Since 1979 (Gorbach-Goldin patent) these differences have been used to select bacteria to be patented and to be

12 Definiamo i probiotici

13 IDENTIFICAZIONE DEL CEPPO

14 IDENTIFICAZIONE DEL CEPPO

15 Sicurezza I batteri probiotici vengono generalmente selezionati fra le specie batteriche di cui si ha una lunga storia d uso sicuro, MA: 1. La lunga storia d uso sicuro non esiste per una serie di situazioni patologiche (uso clinico) 2. Esistono al contrario evidenze che in alcune situazioni patologiche un non corretto uso di probiotici possa essere dannoso 3. Si deve poi considerare il rischio non diretto: ad es. il trasferimento di antibiotico resistenze da non patogeni (probiotici) a patogeni

Esistono al contrario evidenze che in alcune situazioni patologiche un non corretto uso di probiotici possa essere dannoso 3.

16 Un esempio relativo ai probiotici: Hazard: la presenza di un potenziale danno: produzione di acido D-lattico Esposizione al pericolo: soggetti con Sindrome Intestino Corto Rischio: probabilità di un over-growth e D- acidosi

Esposizione al pericolo: soggetti con Sindrome

17 Sicurezza

18 Safety Considerations (FAO,2001) Antimicrobial resistance profiles of probiotics There is concern over the use in foods of probiotic bacteria that contain specific drug resistance genes. Bacteria, which contain transmissible drug resistance genes, should not be used in foods. Currently, no standardized phenotypic methods are available which are internationally recognized for lactobacilli and bifidobacteria (nonpathogens). The Consultation recognizes the need for the development of standardized assays for the determination of drug insensitivity or resistance profiles in lactobacilli and bifidobacteria.

Currently, no standardized phenotypic methods are available which are internationally recognized for lactobacilli and bifidobacteria (nonpathogens).

19 ASSESSING ANTIBIOTIC RESISTANCE IN LACTIC ACID BACTERIA: THE ACE-ART PROJECT www-aceart.net The Sixth Framework Programme

20 Collezione di ceppi Lactococcus lactis S. thermophilus Lactobacillus spp. Lb. acidophilus group Lb. casei /paracasei Lb. rhamnosus Bifidobacterium spp. B. adolescentis B. animalis/lactis Lb. brevis B. bifidum Lb. delbrueckii (lactis/bulg.) Lb. fermentum Lb. helveticus Lb. plantarum /pentosus Lb. reuteri Lb. sakei 721 B. breve B. longum B. pseudolongum B. thermophilum B. cat/pseudocat./angul.

brevis B. bifidum Lb. delbrueckii (lactis/bulg.) Lb. fermentum Lb. helveticus Lb.

21 Collezione di ceppi unknown <

22 Presenza di ceppi batterici con resistenza fenotipica significativamente diversa dalla popolazione batterica della stessa specie Resistenza acquisita?

23 J.Food Protect, 2007 Feb;70(2):412-8.

24 DNA microarray : la prova genetica

25 PCR per la conferma (tets) =ladder 100bp 2=E2 3=E13 4=E14 5=E15 6=E17 7=E18 8=ladder 100bp NAME tets-1 tets-2 SEQUENCE 5- GGAGTACAGTCACAAACTCG -3' 5'-GGATATAAGGAGCAACTTTG -3' Product SIZE 335 bp REFERENCE RIKILT

Dall hazard al risk: la localizzazione Il sito di localizzazione sul genoma batterico del gene di resistenza ha un grande impatto sulla trasferibilità del

26 Dall hazard al risk: la localizzazione Il sito di localizzazione sul genoma batterico del gene di resistenza ha un grande impatto sulla trasferibilità del gene stesso M1 M M1= ladder λ 100 ng M2= ladder supercoiled 1=B3 2=D*T 3= 2 4=S

27 Da hazard a risk Il trasferimento genetico orizzontale

28 In vivo J Appl Bacteriol Nov;65(5): In vivo transfer of pam beta 1 from Lactobacillus reuteri to Enterococcus faecalis. Morelli L, Sarra PG, Bottazzi V. Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza, Italy. Trials were conducted to determine the in vivo transferability of plasmidmediated antibiotic resistance between two strains of enteric Grampositive bacteria. Germ-free mice were associated with the donor Lactobacillus reuteri DSM strain, carrying the broad host range pam beta 1 plasmid, and with the Enterococcus faecalis JH2SS recipient strain. Analysis of faecal content of associated mice demonstrated that the in vivo transfer of this plasmid did occur and that frequencies of conjugation were affected by the presence of subtherapeutic levels of antibiotic in the diet.

29 Probiotici ad uso zootecnico

30 EFSA GUIDELINES (per probiotici ad uso zootecnico) ACCETTATI DISCUSSI CASO PER CASO;

31 E per i probiotici ad uso umano? Responsabiltà del produttore Responsabilità del prescrittore Linee guida Ministero Salute Linee Guida FAO/OMS

32 E per i probiotici ad uso umano? The outcome of the EU PROSAFE project was to recommend that all future probiotics should not contain known antibiotic resistance traits and currently the European Food Safety Authority qualified presumption of safety proposals seem to be following this recommendation

33 GRAZIE PER L ATTENZIONE

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