Raccomandazioni per la standardizzazione: esperienza sul campo

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1 III Sessione Elettroforesi capillare nella standardizzazione di HbA1c e HbA2 Raccomandazioni per la standardizzazione: esperienza sul campo Gabriella Passerini Servizio i di Medicina i di Laboratorio Ospedale San Raffaele - Milano

2 Struttura Emoglobina Etero-tetramero tetramero costituito da 2 catene proteiche α e 2 catene proteiche non-α Ogni catena globinica lega un gruppo prostetico eme (protoporfirina IX) con un atomo di Fe in stato ferroso Catene α composte da 141 aminoacidi (cromosoma 16) Catene non-α composte da 146 aminoacidi (cromosoma 11)

3 Struttura Hb ed emoglobinopatie Hb Bologna St. Orsola Hb E Effetto della sostituzione di un singolo aminoacido (mutazioni di un singolo nucleotide) diversa carica totale Instabilità diversa affinità per O2

4 Assetto emoglobinico Nell adulto sano sono evidenziabili tre frazioni emoglobiniche, HbA (α2,β2) pari al 97-98%, HbA2 (α2,δ2) pari al 2-3%, HbF (α2,γ2) <1% Relazione tra livelli di HbA2 e talassemia

5 HbA glicata nei soggetti diabetici Nel 1968 il Dr. Samuel Rahbar riportava the elevated level of a rare, fast-moving glycated fraction of hemoglobin in patients with diabetes. In starch gel electrophoresis with tris- EDTA-borate buffer ph 8.1, the additional fraction moves a little faster than HbA and slower than Hb J (Iran). Rahbar S. An abnormal hemoglobin in red cells of diabetics. Clin Chim Acta 1968;22(2): In agar gel electrophoresis with 0.05M citrate buffer ph 6.2 this fraction moves in front of HbA to the cathode in the same position as HbF Rahbar S. Studies of an unusual Hemoglobin in patients with diabetes mellitus Biochem Biophys Res Commun 1969;36(5)

6 Eterogeneità molecolare di HbA Studi cromatografici dimostrano la presenza di 3-5 sottotipi di HbA frutto di modifiche post-traduzionali. HbA1c nei soggetti diabetici rappresenta il 7,5-10,6 % dell Hb totale, nei soggetti sani il 4-6%

7 Glicazione non enzimatica di HbA La reazione e non enzimatica si svolge in due fasi, la prima reversibile, la seconda irreversibile La reazione è funzione della concentrazione plasmatica di glucosio. L entità di Hb glicata rispecchia la media dei livelli glicemici del soggetto nel lungo periodo (vita media eritrocitaria). Bunn HF, et al. Further identification of tha nature and linkage of the carbohydrate in hemoglobin A1c. Biochem Biophys Res Commun 1975;67:103-9

8 Siti di glicazione di HbA I siti potenziali di glicazione di HbA includono i residui N-terminali e i gruppi ε-amminici liberi dei residui di lisina delle catene α e β. Nell'HbA1c circail60% del glucosio è legato alle valine N- terminali delle catene β. Altri residui di glucosio possono legarsi alle valine N-terminali delle catene α ed alle lisine β17 ed β66. Bunn HF, et al. Further identification of tha nature and linkage of the carbohydrate in hemoglobin A1c. Biochem Biophys Res Commun 1975;67:103-9

9 Metodi analitici in routine Dal 1977 la misura dell HbA1 entra nella routine dei laboratori clinici. Vengono sviluppati sistemi HPLC per la misura di HbA1c. La comparabilità dei dati analitici i viene migliorata dall uso di calibratori e controlli liofilizzati forniti dai produttori dei diversi sistemi diagnostici. Kilpatrick ES, et al. Diabet Med 1997;14:819-31

10 Metodi analitici separativi per differenza di carica Si basano su differenze molecolari tra Hb glicate e non glicate. Elettroforesi, cromatografia a scambio ionico, HPLC, sfruttano le differenze di carica delle Hb per ottenere una separazione in diverse frazioni, e una quantificazione i relativa rapportata t all Hb totale. t + HbA HbA1 + HbF HbA1 - Possibili interferenze Varianti Hb Elevate concentrazioni di Hb F Hb carbamilata

11 Metodi analitici separativi per affinità Cromatografia di affinità al boronato: si basa su differenze strutturali tra Hb glicate e non glicate Nella colonna cromatografica l acido amminofenilboronico lega in modo specifico il glucosio dell Hb glicata. L Hb non glicata viene eluita da un solvente a bassa forza ionica, la frazione glicata viene eluita da un solvente ad elevata forza ionica. Si determina la concentrazione relativa della Hb glicata totale. Il metodo non risente dell interferenza di elevate concentrazioni di Hb F

12 Metodi analitici immunologici Si basano sulla diversa specificità antigenica di Hb glicate e non glicate. Ab monoclonli o policlonali legano specificamente gli ultimi 6-4 aminoacidi N- terminali della catena β-globinica. Le misure eseguite su piattaforme immunoturbidimetriche determinano direttamente la concentrazione di HbA1c Possibili interferenze Varianti Hb (HbS e HbC) Ipertrigliceridemia Iperbilirubinemia

13 Metodi analitici enzimatici Si basano sulla reazione dell enzima fructosil-valina-ossidasi (FVO) con il suo substrato, la valina glicata prodotta per digestione enzimatica delle catene β di HbA1c. La reazione enzimatica produce perossido d idrogeno che reagendo specificamente con un cromogeno, consente la quantificazione dell analita. Si misura direttamente la concentrazione di HbA1c.

14 Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) 1440 pazienti affetti da diabete di tipo 1 monitorati in 10 anni. Si dimostra una stretta correlazione tra livello del controllo glicemico e rischio e progressione delle complicazioni vascolari croniche della malattia. Si definiscono traguardi terapeutici specifici in funzione delle misure di HbA1c The DCCT Research Group The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. NEJM 1993;329:977-86

15 : United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) Conferma in una popolazione di 5102 soggetti affetti da diabete di tipo 2, monitorata per 20 anni, le evidenze conclusive del DCCT : il controllo intensivo della glicemia comporta una diminuzione di rischio di complicanze a lungo termine il traguardo terapeutico DCCT / UKPDS è HbA1c < 7% HbA1c >8% è indicativa di scarso controllo glicemico UKPDS Group. Lancet. 1998;352:

16 National Glycohemoglobin Standardization Program Si costituisce nel 1996 per implementare il progetto di standardizzazione dell American Association for Clinical Chemistry (AACC) Standards Committee, esteso nel 1993 Obiettivi: creare una rete di laboratori di riferimento per standardizzare e calibrare i sistemi analitici commerciali di HbA1c, riferendoli al metodo HPLC con colonna a scambio ionico BioRex 70, impiegato nello studio DCCT I livelli decisionali di HbA1c raccomandati dall American Diabetes Association (ADA), basati su gli studi clinici DCCT/UKPDS si applicano solo ai metodi certificati NGSP Intervallo di riferimento (non diabetico) 4-6% Obiettivo terapeutico <7,0%

17 : IFCC WG HbA 1C Definire l analita HbA1c (β N-1-deossifruttosil-emoglobina) Implementare metodi di riferimento altamente specifici per l analita (HPLC+MS, HPLC+CE) Caratterizzare e produrre materiali di riferimento altamente purificati, primari e secondari Organizzare una rete internazionale di laboratori di riferimento per la comparazione dei metodi e l assegnazione di valori di riferimento a calibratori e controlli J Int Fed Clin Chem 1996:9(62-4):66-7

18 Standardizzazione IFCC di HbA1c Produzione di esapeptidi N- terminali glicati e non glicati delle catene globiniche β per digestione proteolitica mediante endoproteasi. Separazione e quantificazione dei peptidi con metodi di riferimento IFCC Confronto tra dati del metodo IFCC e quelli dei metodi standardizzati d a nazionali (NGSP). Elaborazione delle equazioni di conversione dei risultati ottenuti con i diversi sistemi (Master Equation) NGSP HbA1c (%) = (IFCC HbA1c (mmol/mol) l)

19 Correlazione IFCC vs NGSP Le misure ottenute con i due metodi hanno una correlazione lineare; questo permette la conversione dei dati analitici e clinici da un sistema all altro. I valori prodotti con il metodo IFCC, espressi in %, sono inferiori dell 1,3-2,0% rispetto a quelli ottenuti con il metodo NGSP a causa della diversa specificità analitica dei due metodi.

20 2007: Documento di Consenso IFCC/ IDF/EASD/ADA La standardizzazione d a dell HbA1c deve e essere e implementata su scala mondiale, unitamente al sistema di riferimento e al modo di refertazione Il sistema di riferimento IFCC è l unico valido per implementare la standardizzazione della misura I risultati dell HbA1c devono essere riportati in unità IFCC (mmol/mol) e in unità derivate allineate al NGSP (%) Un valore di glicemia media stimata potrà essere riportato come aggiunta interpretativa al referto di HbA1c I traguardi glicemici che appariranno nelle linee guida dovranno riportare le unità IFCC, le unità derivate NGSP e la glicemia i media stimata t Consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin A1c measurement. Diabetes Care 2007;30:

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22 Effetti della standardizzazione I dati della VEQ dell American College of Pathologists (CAP) documentano (media ± 2ds) il miglioramento della qualità analitica dei sistemi di misura di HbA1c e la riduzione della variabilità analitica inter- laboratori conseguente alla standardizzazione di i NGSP e IFCC Int J Med Sci. 2012; 9(8):

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24 Errore totale relativo per HbA1c Goodall I et al. Desirable performance standards for HbA1c analysis - precision, accuracy and standardisation. Clin Chem Lab Med 2007;45:

25 2010: HbA1c per la diagnosi di diabete Limiti dell analisi di HbA1c: diabete tipo 1 in rapida evoluzione, gravidanza, emoglobinopatie, malaria, anemia, recente trasfusione, splenectomia, uremia, marcata iperbilirubinemia, marcata ipertrigliceridemia, marcata leucocitosi, alcolismo Diab Care 33:S13, 2010

26 Studio DETECT -2: HbA1c livello decisionale per la diagnosi soggetti affetti da diabete di tipo 2, appartenenti a diversi gruppi etnici (americani, asiatici, africani, europei) Livello decisionale per la diagnosi di diabete 48 mmol/mol (6,5%)

27 Capillarys 2 Flex Piercing Sistema automatico multicapillare utilizza metodi analitici per la determinazione di HbA1c e del profilo Hb Miscelazione per inversione dei campioni di sangue intero in EDTA in provetta primaria tappata, preparazione degli emolisati Identificazione diretta dei campioni, iniezione idrodinamica all estremità anodica dei capillari Analisi simultanea di 8 campioni in buffer a ph 9.4, alla temperatura costante di 34 C, alla tensione costante di 9400 V Rilevazione spettrofotometrica delle frazioni a 415 nm Quantificazione relativa delle frazioni Hb

28 Principio di Separazione ANODO Iniezione Catodo - Anodo + Emolisato CATODO Detector λ 415 nm Flusso EEO Gruppi silanolici ionizzati Cariche negative fisse Cariche positive mobili nel tampone Campo Elettrico Migrazione La differenza di potenziale erogata genera un flusso elettroendosmotico che trascina le Hb dall anodo verso il catodo, a cui si somma o sottrae la forza del campo elettrico DO C+ N A- tempo

29 Capillarys 2 Flex Piercing: assetto Hb Imprecisione analitica intraserie Imprecisione analitica interserie

30 Valutazione Capillarys vs Variant II: HbA2 Sono stati analizzati sui due sistemi Bias = -0,02 002(± 02) 0,2) analitici 205 campioni. La retta di IC 95% da -0,35 a 0,31 regressione è stata calcolata escludendo i campioni con varianti Hb (n=197)

31 Valutazione Capillarys vs Variant II: HbF Correlazione delle misure di HbF di 157 campioni ematici: valori di HbF<1% misurati in HPLC non sono rilevati in CZE La sensibilità analitica per HbF dei due sistemi i è stata t valutata t analizzando diluizioni scalari di sangue di cordone

32 Hb Camperdown EF ph alcalino HbA+ HbCamperdown HbA2 EF ph acido HbA HbCamperdo wn HbA1 β104 Arg Ser

33 Hb E Eterozigote EF ph alcalino EF ph acido HbA HbE+A2 HbA HbA+HbE HbA1+HbE1 HbA HbA1

34 Capillarys 2 Flex Piercing: HbA1c Other HbA: prodotti di degradazione e di ossidazione dell Hb e altre forme glicate: Hb legata a glucosio-6-fosfato, a fruttosio 1.6-bifosfato o a piruvato HbA1c = [HbA1c Area / (HbA1c Area + HbA0 Area)] La calibrazione si effettua con calibratori a due livelli di concentrazione tracciabili al sistema di riferimento IFCC

35 Correlazione Capillarys vs Variant II: HbA1c Sono stati esclusi i campioni con varianti emoglobiniche. I due metodi hanno dimostrato una correlazione altamente significativa Bias = (± 1,91) mmol/mol IC 95% (-4,0 3,5)

36 Possibili interferenze: varianti Hb

37 Dati analitici storici - Calibrazioni Calibrazione molto stabile, eseguita ad ogni cambio di lotto del tampone

38 Factors that Interfere with HbA1c Test Results Updated 9/2014

39 CQI Livello Alto

40 CQI Livello Basso

41 Imprecisione interserie dei singoli capillari Capillari Periodo totale n= MEDIA 30,4 31,3 30,6 31,3 30,9 31,3 31,0 31,4 MEDIA 30,9 DS 0,58 0,84 0,86 1,18 0,89 0,77 0,86 0,65 DS 0,90 CV 1,92 2,69 2,81 3,77 2,88 2,45 2,79 2,09 CV 2,90 Analisi dei controlli di livello basso ripetute in 20 sedute analitiche Analisi dei controlli di livello basso, ripetute in 20 sedute analitiche consecutive dal 12/6/2014 al 6/7/2014. Si considera separatamente l imprecisione interserie degli 8 capillari.

42 VEQ REGIONALE HbA1c

43 VEQ REGIONALE Hb A2

44 Capillarys vs campioni certificati NGSP Per gentile concessione della Drssa Anna Bias = (±1,51) mmol/mol Carobene e del Dr Mosè Barbaro. IC 95% (-3,42 2,29)

45 Soggetto talassemico HbF

46 Interferenza: variante Hb comigra con HbF

47 Interferenza: variante Hb comigra con HbA

48 Interferenza: variante Hb comigra con HbA

49 Interferenza: variante Hb comigra con HbA

50 HbS HbC HbE Hb Lepore

51 Conclusioni Le prestazioni del sistema analitico Capillarys Flex Piercing per la determinazione di HbA1c e dei profili Hb sono molto soddisfacenti in termini di imprecisione e di accuratezza. Il sistema s analitico a ha un ottimo o potere e risolutivo o e permette e e di separare e quantificare le più comuni varianti Hb La misura di HbA1c è accurata in presenza delle più comuni varianti Hb che non comigrano con HbA. Il metodo analitico per HbA1c, allineato al sistema di riferimento Il metodo analitico per HbA1c, allineato al sistema di riferimento IFCC consente di raggiungere i traguardi analitici indicati dalle più recenti linee guida internazionali.