STUDIO DELLA GENETICA E MORFOMETRIA DELLA TROTA MARMORATA DEL FIUME ADDA IN PROVINCIA DI CREMONA

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1 COLLABORAZIONE SCIENTIFICA TRA DIPERTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI, EPIDEMIOLOGIA ED ECOLOGIA FACOLTA DI MEDICINA VETERINARIA UNIVERSITA DI TORINO E PROVINCIA DI CREMONA SETTORE AGRICOLTURA, CACCIA E PESCA STUDIO DELLA GENETICA E MORFOMETRIA DELLA TROTA MARMORATA DEL FIUME ADDA IN PROVINCIA DI CREMONA SUGGERIMENTI GESTIONALI FINALIZZATI ALLA CONSERVAZIONE DEL CEPPO ORIGINARIO DI Salmo trutta marmoratus RELAZIONE FINALE PROF. GILBERTO FORNERIS RESPONSABILI SCIENTIFICI DOTT. ALVISE N. LUCARDA

2 INTRODUZIONE Nell ambito degli studi condotti dal nostro gruppo di ricerca finalizzati alla conservazione e al recupero delle popolazioni ittiche autoctone, lo studio del fenomeno di ibridazione tra la trota autoctona, la trota marmorata, e la trota introdotta a scopo di pesca nelle acque dolci (ceppi di trota fario di varia origine) è quello di maggior importanza sia dal punto di vista conservazionistico che gestionale per gli Enti pubblici a cui è affidata la gestione delle acque pubbliche e dell attività di pesca dilettantistica. Proprio in questo contesto si è inserita la collaborazione scientifica tra la provincia di Cremona, settore Agricoltura, Caccia e pesca e il Dipartimento di Produzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia dell Università di Torino, intesa a fornire un contributo agli studi condotti dal gruppo di ricerca con un riguardo particolare alle problematiche legate alle aree di competenza della Provincia di Cremona. I risultati degli studi che sono di seguito riportati pertanto, hanno utilizzato i dati raccolti nell ambito della presente collaborazione scientifica ma sono stati ottenuti mediante confronto con dati pregressi raccolti nelle medesime aree geografiche e mediante confronto con un database costruito in un decennio di studi estesi su tutto l areale della trota marmorata. I risultati, vengono forniti in forma interpretata sia per il fatto che vengono utilizzati approcci di studio diversi opportunamente interpretati (morfometria, analisi d immagine e analisi genetiche) sia perché possano essere comprensibili e utilizzabili con maggior profitto nella stesura di piani di salvaguardia delle specie autoctone dagli Enti che devono pianificare la gestione della fauna ittica territoriale e la pesca dilettantistica. 2

3 OBIETTIVI Gli obiettivi della presente collaborazione possono essere così riassunti: 1) raccolta di campioni di tessuto per le analisi genetiche e di immagine della trota marmorata e dell ibrido del bacino dell Adda in provincia di Cremona per analisi morfometriche e analisi genetiche finalizzate all aggiornamento dei database a disposizione dei ricercatori. 2) valutazione dello stato del fenomeno di ibridazione tra la trota marmorata e la trota fario in soggetti marmoratus fenotipicamente più puri. 3) individuazione di ceppi di trota marmorata immessi da altri bacini o di ceppi di trota marmorata allevata 4) valutazione dell evoluzione nel tempo e della tendenza del fenomeno di ibridazione tra la trota marmorata e la trota fario e della presenza di ceppi di trota marmorata non originari del bacini dell Adda. 5) interpretazione dei dati morfometrici e genetici in modo integrato e formulazione di suggerimenti gestionali finalizzati alla protezione, al recupero e all incremento numerico delle popolazioni originali di trota marmorata nel bacino del fiume Adda in provincia di Cremona 3

4 MATERIALI E METODI A) modalità di raccolta dei campioni I primi campionamenti di trota marmorata nel fiume Adda sono stati effettuati nel 1997 in periodo riproduttivo, con la raccolta di 20 campioni di tessuto e delle immagini dei soggetti campionati. Nel 2000 sono stati messi a nostra disposizione altri campioni di tessuto raccolti da trota marmorata e ibrido nel fiume Adda ed in sistemi afferenti in Lombardia. Nel corso del presente studio sono stati eseguiti campionamenti in data 29/09/2003 sul fiume Adda in località Spino d Adda e in data 11/10/2003 sul canale Vacchelli. Questi campionamenti sono stati effettuati in modalità qualitativa, senza analizzare un campione rappresentativo anche degli altri fenotipi ibridi tra la trota fario e la trota marmorata catturati durante le sessioni di campionamento. L obiettivo principale è stato dunque quello di ottenere un idea della composizione della popolazione di trota marmorata nella provincia di Cremona per effettuare un confronto con le popolazioni di trota marmorata degli altri corsi d acqua lungo tutto l areale distributivo della specie, oltre che effettuare un confronto con le situazioni rilevate nelle stesse aree durante campionamenti effettuati negli anni precedenti allo scopo di valutare le tendenze. Questo problema è infatti molto importante in quanto sin dai primi studi eseguiti su tutto l areale distributivo della trota marmorata, erano emerse due problematiche parallele: la prima quella dell ibridazione con la trota fario di immissione, la seconda, quella di mescolamento con ceppi di trota marmorata tra bacini diversi. L azione di immissione e spostamenti di trote da un bacino all altro da parte dell uomo, ha rivelato sin dalle prime analisi eseguite qualche anno fa, la presenza di un quadro distributivo delle popolazioni di trota endemica alquanto complesso e di non immediata comprensione se interpretato solo sulla base di considerazioni di tipo zoogeografico. Oltre alle evidenze analitiche, esistono numerose documentazioni comprovanti il fatto che la trota marmorata nei diversi stadi di 4

5 sviluppo (uova, larve, avannotti e adulti) è stata scambiata tra diversi bacini anche geograficamente molto lontani. Quest ultimo problema, da alcuni ittiologi sottovalutato in quanto viene posta l attenzione esclusivamente a livello di specie (o meglio semispecie nel caso della trota marmorata) non tiene sufficientemente conto del fatto che la conservazione della biodiversità a livello di specie nella fauna ittica delle acque dolci è garantita quasi esclusivamente dalla conservazione delle differenze esistenti tra popolazioni distinte che abitano bacini distinti. Lo spostamento di trota marmorata tra bacini differenti più o meno vicini, determina tre fenomeni concomitanti: a) la diffusione di genotipi introgressi nel caso si tratti di popolazioni contaminate con genotipi di trota fario; b) l omogeneizzazione tra le popolazioni di trota marmorata che naturalmente nel corso degli anni, a causa dell isolamento geografico, hanno accumulato differenze sia a livello genetico che morfometrico; c) l addomesticazione di una specie selvatica nel caso di immissione di trota marmorata prodotta negli allevamenti che utilizzano tecniche produttive derivate dalla troticoltura tradizionale, con l uso di mangimi e vasche ad elevate densità. Dal punto di vista della biodiversità, esistono fondati motivi per pensare che questi tre fenomeni associati alle problematiche di tipo ambientali che affliggono i corsi d acqua padani ed alpini, rappresentano una insidia per la conservazione della trota marmorata selvatica e pongono le basi affinché in futuro la presenza di trota endemica nelle acque dei fiumi possa essere solo quella di popolazioni artefatte dall uomo e non capaci di automantenersi, poco adattate all ambiente naturale e maggiormente sensibili alle malattie delle trote di ceppo allevato. Diverse esperienze in campo faunistico e anche ittiologico connesse a problematiche di tipo conservazionistico, hanno dimostrato negli anni che quella sopra esposta non rappresenta la strategia percorribile sia per i risultati che produce e sia per i costi necessari per sostenerla. La presente collaborazione scientifica invece è stata voluta dai partners per fornire indicazioni utili alla definizione di un percorso gestionale diverso, 5

6 finalizzato alla messa a punto di metodi non invasivi ed efficaci per fornire supporto alle popolazioni selvatiche di trota marmorata in modo da preservare la selvaticità della specie limitando l ibridazione con la trota fario e mantenendo la specificità della popolazione selvatica originaria della trota marmorata del fiume Adda. In ultima analisi, dalla presente collaborazione si vogliono ottenere indicazioni utili per la definizione di un percorso gestionale che faccia uso dell incubatoio di valle come struttura per il supporto delle popolazioni endemiche naturali, conservando la semispecie, la specifica identità a livello di popolazione e anche i caratteri di selvaticità della specie. Al momento in cui si esegue uno studio è possibile ottenere un quadro che costituisce una "foto istantanea" della situazione presente, mentre l'evoluzione del quadro è desumibile solo dal confronto di "foto istantanee" eseguite in tempi successivi. Diviene quindi possibile stimare gli effetti a livello genetico e nella struttura delle popolazioni introgresse, degli interventi che hanno prodotto perturbazioni rispetto agli effetti che si ipotizza dovrebbero essere sulla base di un decorso evolutivo di popolazioni naturali. Per popolazioni naturali si intendono quelle sottoposte a differenziamento genetico determinato da isolamento parziale per distanza geografica, secondo le teorie esposte da Wright quasi un secolo fa. Con gli strumenti genetici questo è praticamente possibile studiando le tracce di introgressione genetica presente nei genotipi degli individui delle popolazioni residue, sia a livello mitocondriale che nucleare. Studi eseguiti a distanza di alcuni anni, consentono di stimare l'effetto determinato dall'intervento dell'uomo, e se questi interventi sono conosciuti, consentono di stimare le potenzialità omeostatiche delle popolazioni selvatiche e dei corsi d'acqua che li ospitano. Uno sforzo di campionamento ed investigativo prodotto in queste direzioni va inevitabilmente a scapito di una raccolta di informazioni più dettagliate sulla struttura e dinamica delle popolazioni nei singoli tratti di corso d acqua, approccio di studio che richiede un preciso e specifico sforzo di campionamento, oggettivamente non sempre compatibile con la realizzazione di studi che hanno come obiettivo principale la definizione di una panoramica generale e l applicazione in tempi brevi dei 6

7 risultati degli studi nella pianificazione gestionale con finalità conservazionistiche. Tuttavia queste informazioni risultano poco utili se non si conosce prima in modo sufficientemente chiaro il grado di differenza esistente tra le popolazioni di trota marmorata dei diversi bacini, il grado e le modalità di introgressione genetica da parte di genotipi estranei ed in ultima analisi se non si riesce ad identificare quali sono i ceppi di trota autoctoni che devono essere considerati come unità distinte da conservare. Sono queste infatti le unità sulle quali vanno definiti in modo strategico i piani indipendenti di recupero, salvaguardia e ricostituzione. Questi sono gli obiettivi primari dello studio che abbiamo condotto e che giustificano le modalità con cui sono stati condotti campionamenti ed analisi di laboratorio. Durante le operazioni di campionamento, le trote sono state catturate mediante pesca elettrica, subito anestetizzate in loco e in alcuni casi sono stati rilevati i dati ponderali. Sull animale steso sul fianco ed anestetizzato è stata effettuata una classificazione preliminare su base fenotipica basata fondamentalmente su tre parametri: 1) - cromatismo e disposizione delle macchie della livrea laterale: si valutano la presenza o assenza di macchie tondeggianti circondate da areola chiara tipicamente presenti nella trota fario di origine nord atlantica introdotta nelle nostre acque per la pesca dilettantistica. Tali macchie sono talora presenti anche negli individui che derivano dall incrocio di trota marmorata con i ceppi di trota fario allevati. Viene inoltre valutata la distribuzione delle macchie tondeggianti, sovente di colore rosso o nero, che se presenti lungo la linea laterale e/o equidistanti con disposizione quasi geometrica (disposti cioè su rette e diagonali immaginarie lungo il corpo dell animale) rappresentano un carattere distintivo tipico della trota fario di allevamento proveniente dalle regioni nord europee. Se questi sono presenti anche nei soggetti di fenotipo intermedio tra la trota fario e la marmorata, sono certamente indicativi di un soggetto derivato dell incrocio tra le due semispecie. Viene inoltre valutata la marmoreggiatura della livrea non tanto in 7

8 senso cromatico, cioè se molto o poco contrastata con il colore di fondo o se tendente al rosa-rosso invece che al marrone-verde, ma piuttosto considerando la continuità della marmoreggiatura con riguardo alla trama. Nei soggetti di maggiore purezza la trama è piuttosto complessa e non il risultato di una semplice fusione delle macchie come tipicamente presente nei soggetti a fenotipo intermedio comunemente definiti ibridi. L osservazione viene quindi estesa dall area prossima all opercolo fino alla regione della coda, valutando sia la continuità che la copertura della marmoreggiatura rispetto all intera superficie laterale del corpo. E molto importante puntualizzare il fatto che la percezione visiva delle macchie è chiaramente più agevole in soggetti di taglia maggiore rispetto ai soggetti giovani pertanto è proprio su quest ultimi che è necessario porre la massima cura nel rilevare sia la presenza di macchie isolate quanto la continuità delle marmoreggiature che talora possono essere intraviste solamente ruotando l animale in posizione tale che i riflessi della luce sulla pelle non impediscano di percepirne le trame cromatiche meno contrastate. Sovente infatti la livrea chiara o poco contrastata non aiuta a cogliere i particolari oggetto di valutazione, pertanto l analisi visiva deve essere effettuata in condizioni di luminosità ed incidenza della luce opportune, magari sottoponendo ad un riesame lo stesso individuo dopo che è stato mantenuto per alcuni minuti in un contenitore scuro e in assenza di luce. Nei giovani individui anche la forma e la disposizione delle macchie parr aiuta nella classificazione fenotipica ed è un buon parametro di valutazione. Quando presenti e ben osservabili le macchie parr si presentano piuttosto ampie e tondeggianti, a contorno definito ed equidistanti in unica fila lungo la linea laterale nei ceppi di allevamento e nord atlantici di trota fario. Si presentano invece con rotture di continuità e di dimensioni minori, disposte in duplice riga alternata o a macchia di leopardo nelle trote di ceppo autoctono quali la marmorata e la fario di ceppo mediterraneo che popola le acque dei bacini orientali francesi. In un esperimento di ibridazione geneticamente controllata abbiamo osservato come spesso la disposizione delle macchie parr nei soggetti che derivano dall incrocio tra fario e marmorata si presenti con un 8

9 pattern intermedio, talora doppio o quasi chimerico con macchie singole ampie e in unica fila nella porzione anteriore del corpo ma di dimensione minore e disposte in duplice riga alternata nella porzione posteriore (o viceversa). Dai nostri esperimenti e dalle nostre osservazioni, la trama sul dorso delle trote dei corsi d acqua alpini non risulta essere un fedele parametro di valutazione preliminare fenotipica, come non lo sono le macchie di diverso colore presente sulla pinna dorsale e la presenza di macchie pre opercolari. Classificazione fenotipica preliminare su base visiva La classificazione preliminare da effettuarsi sul campo, da noi elaborata per i diversi fenotipi che si riscontrano negli studi delle popolazioni di trota marmorata soggette al fenomeno di incrocio con i ceppi immessi di trota fario, si basa su di una doppia codifica che utilizza le diverse classi di seguito illustrate: - MM: livrea che presenta marmoreggiatura molto articolata, continua anche se poco contrastata e tendente a colori come il rosa o il grigioverde indistintamente. Spesso è una marmoreggiatura che si continua nell opercolo. Assoluta assenza di macchie rosse e nere tondeggianti circondate da areola chiara. Nei giovani presenza di macchie parr di piccole dimensioni, frammentate e disposte in duplice o triplice fila alternate specie nella parte posteriore-ventrale. -MI: livrea che presenta marmoreggiatura evidente anche se poco contrastata e tendente a colori come il rosa o il grigioverde indistintamente a seconda del bacino d origine, con qualche discontinuità rappresentata da macchie che presentano fusioni incomplete. Assoluta assenza di macchie rosse e nere tondeggianti circondate da areola chiara. Nei giovani, presenza di macchie parr di piccole dimensioni, meno frammentate e disposte in duplice fila, alternate specie nella parte posteriore-ventrale. - II: livrea che presenta marmoreggiatura anche se poco contrastata e tendente a colori come il rosa o il grigioverde, con diffuse discontinuità rappresentate da macchie che presentano fusioni incomplete. Presenza di un 9

10 numero limitato di macchie rosse e nere tondeggianti non circondate da areola chiara. Nei giovani presenza di parr con macchie singole ampie e in unica fila ma anche di dimensione minore e disposte in duplice riga alternata. - IF: livrea che presenta marmoreggiatura solo accennata con discontinuità prevalente e caratterizzata da macchie che presentano solo qualche accenno di fusione o qualche fusione parziale. Presenza di macchie rosse e nere tondeggianti anche circondate da areola chiara. Nei giovani, presenza di macchie parr singole e ampie tipiche della trota di allevamento di ceppo nord atlantico. In questo gruppo vengono classificati anche tutti quei fenotipi fario che non presentano ne i caratteri tipici della fario di allevamento, ne quelli tipici della fario di ceppo mediterraneo, ne quelli della fario di ambiente lacustre. - FF: livrea laterale tipica della trota fario dei paesi nord europei presente nelle pescicolture e sovente utilizzata per immissioni di trota nei corsi d acqua sottoposti ad overfishing. Presenza di macchie rosse e/o nere tondeggianti circondate da areola chiara, principalmente disposte lungo la linea laterale ma sovente disposte ai nodi di una griglia immaginaria a celle triangolari sulla livrea laterale. Nei giovani presenza di sole parr con macchie singole, piuttosto ampie ed in unica fila. - ML; IL; LF e LL: tipologie fenotipiche che accompagnano ai caratteri tipici della marmorata (ML), del fenotipo intermedio (IL) e della fario (LF) rispettivamente, una scarsa colorazione della livrea determinata dall ambiente lacustre (da cui la L ), con caratteristico sfondo chiaro, macchie molto poco o per nulla contrastate, riflessi argentei e macchie parr quasi per nulla evidenti. Alcuni di questi fenotipi sono stati rinvenuti, classificati ed analizzato sotto il profilo sia morfologico che genetico, in prossimità di bacini sia naturali che artificiali di diversi fiumi dell arco alpino. 2) - cromatismo e disposizione delle macchie dell opercolo branchiale: Spesso la livrea laterale, le cui manifestazioni cromatiche sono comunque molto influenzate dalle condizioni ormonali e di stress dell animale, può presentare ematomi da contrazione violenta del corpo a causa 10

11 dell elettropesca o talmente poco contrastata da far risultare complicata una corretta valutazione. Dimensioni dell animale, intensità e incidenza della luce, traumi da cattura con elettropesca e maneggiamento, sbalzi termici e di luminosità possono condizionare la corretta valutazione preliminare fenotipica in modo molto importante e soprattutto in modo soggettivo. Nel corso di diversi anni di studio, abbiamo osservato e verificato mediante test appositi, come invece la regione dell opercolo sia molto meno influenzata dalle suddette condizioni e presenti caratteri cromatici costantemente leggibili e valutabili. Per contro, l area disponibile è limitata e diventa più complicata la valutazione nei soggetti di taglia minore nei quali la valutazione deve essere eseguita con particolare perizia e ricerca del particolare. Le classi di assegnazione preliminare fenotipica sono le medesime descritte per la livrea (MM, MI, II, IF, FF) anche se i caratteri da valutare sono principalmente il grado di fusione delle macchie (richiede massima cura la valutazione nei soggetti giovani) il loro numero, la disposizione e la continuità delle macchie sulla livrea. Nei soggetti più puri di marmoratus, le macchie sono ben fuse e la trama della marmoreggiatura sembra continuare dalla livrea laterale. Nelle giovani marmoratine possono anche presentarsi come macchie solo parzialmente fuse ma generalmente raggruppate in un area dell opercolo. Sono comunque generalmente in numero basso. Diversamente, nelle fario non si osserva fusione delle macchie che si presentano nella maggior parte dei casi anche piuttosto distanziate tra di loro, a contorno ben definito e di forma più tondeggiante. Le classi MI, II, IF, presentano via via le situazioni intermedie osservabili tra le due tipologie sopra descritte e una dettagliata descrizione richiede l ausilio di supporto video. 3) - caratteri meristici (qualora valutabili da un esame visivo esterno). I nostri studi sulla meristica condotti negli anni scorsi hanno dimostrato la validità e l affidabilità dei caratteri meristici come strumento di distinzione tra la trota fario e la marmorata quando vengono combinati tra loro in una funzione polinomiale (modello discriminante). Purtroppo i caratteri meristici non risultano applicabili in modo estensivo negli studi di popolazioni sottoposte 11

12 ad azione di tutela in quanto necessitano del sacrificio dell animale per essere valutati (conteggi meristici). Tuttavia, un paio di caratteri che sono risultati essere altamente discriminanti tra le due semispecie e anche nella definizione dei fenotipi intermedi, possono essere oggetto di valutazione visiva da parte di un ittiologo che sia in possesso di buona conoscenza e di un occhio molto allenato. Nelle nostre classificazioni infatti, soprattutto nei casi di dubbia attribuzione, si è fatto uso della valutazione dei caratteri meristici che vengono stimati come una variabile categorica e non mediante conteggio. Questo rappresenta un ausilio importante nella valutazione complessiva dell individuo che viene effettuata sulla base del cromatismo di livrea e dell opercolo branchiale. Previa pulizia dal muco all interno della bocca, si può effettuare un esame visivo della disposizione dei denti sull osso vomere localizzato sul palato dell animale. Nella procedura corretta, la rigorosa valutazione andrebbe fatta sull osso scarnificato in quanto lo spesso strato di pelle del palato consente di rilevare solamente la parte terminale del dente e ne nasconde la posizione della base di inserzione sull osso vomere, cioè proprio il carattere che è da valutare con cura. Tuttavia in buona parte dei casi, un occhio esperto può valutare se la disposizione dell inserzione dei denti è in unica fila come nella trota marmorata oppure doppia fila come è caratteristico invece nella trota fario. Analogamente, mediante ispezione attraverso la bocca è possibile effettuare il conteggio del numero di branchiospine presenti nella prima arcata branchiale, sia nel semiarco superiore che in quello inferiore. Anche questo carattere viene utilizzato come ausiliario nel caso di classificazioni dubbie. E evidente che la capacità di apprezzare e valutare i caratteri meristici si riduce considerevolmente quando i soggetti da classificare sono giovani o di piccola taglia, pertanto anche questo criterio di valutazione va sapientemente gestito con l esperienza di numerose osservazioni effettuate con scrupolosità ed elevato senso critico, seguite da test ed elaborazioni dei dati tesi a valutare se esistono delle sistematicità d errore nella raccolta del dato sia qualitativo che quantitativo. 12

13 Dalla duplice valutazione della livrea e dell opercolo, coadiuvate qualora possibile dalla valutazione dei caratteri meristici apprezzabili all esame visivo, per ciascun individuo è stata effettuata l attribuzione ad una delle seguenti classi fenotipiche che derivano dalla combinazione delle due valutazioni principali della livrea e dell opercolo: - M M M M : individuo che porta tutti i caratteri cromatici esclusivi di trota marmorata; marmoratus (vedi Atlante); - M M M I: individuo che presenta minime discontinuità del pattern sull opercolo o sulla livrea; marmoratus-simil marmoratus (vedi Atlante); - M I M I: individuo che presenta minime discontinuità della marmoreggiatura sia sulla livrea che sull opercolo simil marmoratus (vedi Atlante); - M I I I: individuo che presenta minime discontinuità della marmoreggiatura sulla livrea o sull opercolo ma con discontinuità più pronunciate in una delle due parti. Assenza di macchie tondeggianti con areola chiara. simil marmoratus-ibrido (vedi Atlante); - I I I I: individuo che presenta prevalentemente macchie isolate ma con accenni alla fusione. Possono essere presenti anche macchie tondeggianti ma non areolate, specie lungo la linea laterale ibrido (vedi Atlante); - I I I F: individuo che presenta prevalentemente macchie isolate ma con accenni alla fusione. Possono essere presenti anche macchie tondeggianti, solo poche delle quali possono presentare una areolatura chiara. 13

14 L opercolo non presenta che il minimo accenno alla fusione delle macchie che però si presentano vicine. ibrido-simil fario (vedi Atlante); - I F I F: individuo che presenta prevalentemente macchie isolate quasi senza accenno alla fusione. Possono essere presenti anche macchie tondeggianti, diverse delle quali possono presentare una areolatura chiara. L opercolo non presenta accenno di fusione delle macchie che si presentano anche piuttosto distanziate tra loro. In questa categoria possono essere classificati anche quei fenotipi di trota fario che presentano molte macchie di piccole dimensioni. simil fario (vedi Atlante); - I F F F: fenotipo prevalentemente di tipo atlantico con macchie rosse e nere tondeggianti areolate che non si presentano disposte sui nodi di un ipotetico reticolo a celle triangolari. In questa categoria possono essere classificati anche quei fenotipi di trota fario che presentano molte macchie di piccole dimensioni frammiste a quelle classiche tondeggianti del ceppo atlantico. Sovente si tratta di trote di immissione prodotte da incroci operati negli allevamenti tra individui selvatici di trota fario e riproduttori di ceppo atlantico. simil fario-fario (vedi Atlante) - F F F F: fenotipo classico di trota fario di ceppo nord atlantico con presenza di macchie tonde areolate disposte lungo la linea laterale dell animale e secondo una disposizione quasi geometricamente ordinata. fario (vedi Atlante); - X L X L: possibili combinazioni di M ed F nel caso di fenotipi lacustri. Il protocollo di classificazione fenotipica su base visiva sopra descritto è ormai consolidato in diversi anni di studio e sperimentazione. Il protocollo è già 14

15 utilizzato da diversi operatori del settore che si occupano in modo più o meno diretto dei problemi conservazionistici della trota marmorata a livello locale, dal responsabile dell incubatoio di valle che esegue le fecondazioni artificiali nell ambito delle campagne ittiogeniche, al funzionario Provinciale del Servizio Pesca e i suoi tecnici consulenti, alle guardie Forestali e della Pesca. Anche in provincia di Cremona quindi proponiamo l utilizzo allargato del presente metodo di classificazione fenotipica in modo che gli operatori possano uniformarsi con i colleghi delle altre Regioni in cui è diffusa la trota marmorata, utilizzando un linguaggio comune. Gli specialisti del Dipartimento di Produzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia sono a disposizione per illustrare il metodo in corsi teorico-pratici per operatori del settore e guardia pesca, ai quali viene insegnata l applicazione finalizzata alla selezione fenotipica dei riproduttori da attuarsi nei piani di riproduzione artificiale negli incubatoi di valle e negli impianti. Nel corso di diversi anni di studio abbiamo potuto constatare come le differenze nei criteri di classificazione tra i tecnici di diversi Enti pubblici anche confinanti, siano talvolta molto rilevanti e tali da non consentire l'analisi in un database comune dei dati raccolti nel corso dei monitoraggi. Questo aspetto invece è di importanza fondamentale se si considera che la maggior parte dei fiumi attraversano nel loro percorso numerose Province e che è fondamentale poter trattare insieme, almeno a livello di uno stesso bacino, i dati ottenuti nei campionamenti e nei monitoraggi della fauna ittica. Per le medesime ragioni, anche i dati delle catture registrati nei tesserini dei pescatori sportivi diventano non confrontabili. Da questo si capisce quindi quanto sia importante che anche i tecnici che operano nella Regione Lombardia, nelle diverse Province e nelle riserve di pesca locale, utilizzino una classificazione fenotipica riferita al protocollo comune che è divenuto lo standard comunicativo nell ambito degli studi e degli interventi finalizzati alla conservazione della trota marmorata e dell ibrido fenotipico con la trota fario. In sede di elaborazione dei dati genetici e morfometrici ottenuti, le diverse tipologie morfologiche vengono studiate sia separatamente che in diverse combinazioni di raggruppamenti per verificare di volta in volta la 15

16 corrispondenza fra dati genetici, morfometrici e classificazione fenotipica. Per quanto riguarda la parte analitica questo rappresenta la fase preliminare di studio della struttura dei dati, che verifica l adeguatezza dei dati raccolti prima di accedere alla parte di elaborazione vera e propria e l applicazione dei modelli statistici. Le analisi statistiche che vengono applicate sono piuttosto complesse e la lunga e particolareggiata descrizione è sicuramente fuori sede in questo contesto. In estrema sintesi si tratta di test statistici multipli che prevedono il confronto a coppie dei dati morfometrici, cromatici e genetici delle diverse categorie fenotipiche, tra i diversi siti di campionamento e tra i diversi bacini. Di conseguenza, l'interpretazione dei risultati che si ottengono è piuttosto complessa e talora deve essere articolata per punti distinti quando non è consentita una interpretazione univoca dei risultati analitici, fornendo ipotesi più o meno diverse; Tutte le informazioni parziali ottenute devono essere interpretate insieme per consentire di giungere ad una formulazione di sintesi che viene tradotta in una forma di facile comprensione anche ai non specialisti. In diversi casi l'informazione giunge dai confronti effettuati a più riprese sul database analizzato a diversi gradi di suddivisione, basata inizialmente solo sulla classificazione fenotipica visiva iniziale. In fasi successive di analisi, vengono effettuate le analisi partendo da una suddivisione basata solo sui dati genetici e poi sui soli dati morfometrici. Maggiore è la corrispondenza tra i risultati ottenuti nelle diverse metodologie di suddivisione dei campioni e maggiore risulta essere l'affidabilità dell'informazione che si ottiene. Negli studi e nelle sperimentazioni di ibridazione geneticamente controllata è infatti emerso che quando non vi sono perturbazioni determinate dalle immissioni, nelle popolazioni selvatiche l'informazione fenotipica e quella genetica sono fortemente correlate ed è consentito giungere a gradi di approfondimento analitico maggiore. Per semplificare l'esposizione dei risultati ottenuti e delle considerazioni che da questi vengono tratti, si può anche fare riferimento ad una suddivisione su base fenotipica visiva semplificata, costituita da 4 gruppi così costituiti: M M marmoratus classi M M M M, M M M I; M I fenotipi intermedi simil-marmoratus classi M I M I, M I I I; 16

17 I F fenotipi intermedi simil-fario classi I I I I, I I I F, I F I F; F F fario e simil-fario classi I F F F e F F F F B) Analisi d immagine e morfometria Nel corso dei campionamenti è stata eseguita una ripresa video (sequenza di alcuni secondi in formato digitale ad alta definizione) dalla quale in laboratorio fotografico è stata tratta un istantanea dell animale sul fianco sinistro in corretta posizione del corpo. Contestualmente è stata eseguita la ripresa della livrea, del cromatismo e della disposizione delle macchie, sia sul fianco dell animale che sull opercolo in particolare, dalle cui sequenze sono state estrapolate delle immagini su cui sono state eseguite le analisi cromatiche per ogni individuo. Il fatto di dover lavorare necessariamente sul campo in condizioni di luminosità molto variabili e non controllabili, consente di ottenere delle istantanee che presentano invariabilmente in alcune zone dell immagine difetti di esposizione ma soprattutto alcuni riflessi che sulla superficie umida e rifrangente della pelle del pesce, produce sia aberrazioni cromatiche che aree di sovra e/o sotto esposizione. Sebbene la tecnologia di analisi d immagine sia molto evoluta negli ultimi tempi e molto si sia lavorato a livello tecnico per mettere a punto un buon metodo di analisi del cromatismo della livrea, i risultati che si ottengono al personal computer vengono mediati con la valutazione preliminare della livrea effettuata sul campo, secondo il protocollo di classificazione descritto sopra. Se l immagine è di buona qualità, la corrispondenza tra metodo analitico al PC e valutazione visiva sul campo coincidono oltre il 90 % quando l'operatore che ha effettuato la classificazione visiva dispone di un bagaglio di esperienza notevole nel riconoscimento dell intera gamma di fenotipi esistenti tra la livrea marmoratus e la livrea fario, soprattutto quando si ha a che fare con soggetti preadulti e giovani. Non sempre tuttavia è possibile ottenere riprese ed immagini di ottima qualità cromatica in quanto le condizioni di luminosità sul campo possono essere molto variabili, pertanto per uniformare il dato ottenuto si procede ad un calcolo della 17

18 media tra i risultati ottenuti dalle analisi cromatiche e le valutazioni dell ittiologo al momento del campionamento. Dall immagine dell animale intero sul fianco in postura corretta vengono invece tratte le informazioni sulla forma del corpo dell individuo che trasformata in dato quantitativo viene utilizzato nelle analisi statistiche morfometriche. Operativamente nel dettaglio si procede nelle modalità seguenti: Dalla sequenza video viene estratta un immagine in posizione corretta che viene successivamente elaborata al Personal Computer per ottimizzarne i contrasti e la risoluzione al video. Il nostro metodo prevede per lo studio della forma la conversione dell immagine di interpolazione dei frames video in una immagine a numero elevato di tonalità di grigio, meglio gestibile nelle successive fasi di analisi di immagine. Successivamente, viene sovrapposta all immagine del pesce, una costruzione geometrica studiata appositamente per la morfometria della trota che consente di individuare sul corpo dell animale una serie di punti notevoli che vengono denominati landmark. Questi sono principalmente localizzati nelle parti del corpo sorrette da struttura scheletrica mentre vengono tralasciate le parti molli del corpo come ad esempio l addome che a seconda della pienezza dello stomaco può presentare un profilo molto diverso. Particolare riguardo viene posto nella descrizione dell area del capo, pertanto in questa parte sono posizionati la maggior parte dei landmark. Questo è motivato dal fatto che sin dai nostri primi studi si è potuto dimostrare che le maggiori differenze tra la forma del corpo della trota fario e la marmorata si localizzano proprio nella regione del capo; Questo nella trota marmorata si presenta generalmente più grande rispetto al resto del corpo al contrario della trota fario. La trota marmorata presenta inoltre una forma del corpo più allungata ed affusolata con un opercolo branchiale di dimensioni maggiori. Interessante poi è che gli individui intermedi similmarmoratus e simil-fario presentano profili intermedi a quelli tipici delle due semispecie di provenienza (genitori), pertanto per mezzo di un approccio di calcolo adeguato è possibile utilizzare l informazione contenuta sulla forma del corpo per avere indicazioni, in termini statistici, sul grado di ibridazione di ogni 18

19 soggetto e quindi attribuirlo ad un determinato gruppo fenotipico, riconducibile poi a quelli definibili su base visiva. Quanto sopra è stato verificato in diversi piani sperimentali condotti sia su popolazioni naturali che su popolazioni appositamente ibridate in ambiente naturale sotto controllo genetico. L archivio, sia quello delle immagini originali a colori che di quelle elaborate e di quelle comprensive di costruzione geometrica, è gestito con l uso di database multirelazionali. Mediante software dedicati vengono digitalizzati i punti notevoli sull immagine e ricavate le coordinate cartesiane dei singoli landmark. La forma del corpo dell animale viene quindi sintetizzata in una serie di 24 landmarks disposti su di un piano cartesiano e individuati per mezzo di coordinate X e Y. Mediante software di analisi dedicati, la nuvola di punti viene scalata, standardizzata, ruotata e traslata in modo che tutti gli animali possano essere confrontati. In una fase preliminare tutti gli animali campionati sono stati suddivisi in 4 classi di lunghezza per evitare di confrontare animali con forme del corpo differenti dovute solamente a diverse proporzioni tra le parti del corpo come nel caso di soggetti di taglia diversa. Questo si è reso necessario per il fatto che le trote presentano una modalità di accrescimento allometrico, cioè nel corso dello sviluppo presentano parti del corpo che si accrescono in modo diverso rispetto ad altre. L effetto è facilmente intuibile se si pensa per esempio di ingrandire 5 volte l immagine di una trotella di lunghezza 100 mm portandola a 500 mm: ebbene se si confronta la forma del corpo di questa immagine con quella di un soggetto adulto di effettivi 500 mm appare evidente che le dimensioni del capo e dell occhio, solo per citare le parti più evidenti, sono sproporzionate rispetto al resto del corpo di un individuo normale. Le classi di lunghezza in cui sono stati suddivisi tutti gli animali campionati, create in intervalli 100 mm sono le seguenti: classe 0 fino a 99 mm di lunghezza alla forca; classe 1 da 100 mm fino a 199 mm di lunghezza alla forca; classe 2 da 200 mm fino a 299 mm di lunghezza alla forca; 19

20 classe 3 da 300 mm fino a 399 mm di lunghezza alla forca; classe 4 superiore a 399 mm di lunghezza alla forca; L informazione morfometrica, unita a quella desunta dall analisi cromatica della livrea laterale e a quella ricavata dalle analisi genetiche sia sul DNA mitocondriale che nucleare, costituiscono i set di dati base che vengono utilizzati nel modello di calcolo integrato che classifica ogni singolo individuo (Individual Hybridisation Score) e fornisce una stima delle probabilità che quel individuo appartenga ad una determinato campione piuttosto che ad un altro tra un pool di campioni candidati. Se il campione raccolto viene ritenuto rappresentativo della popolazione da cui è stato tratto, allora l Hybridisation Score medio del campione può essere utilizzato come il paramento di confronto tra le diverse popolazioni di un corso d acqua o di un tratto di esso. Per tali ragioni in studi come questo risulta indispensabile disporre di un database molto esteso, al quale possono essere applicate routine analitiche diverse. I dati fenotipici e quelli molecolari vengono integrati e posti a confronto multiplo, applicando le opportune statistiche, che disponendo di database estesi, possono essere in grado di mettere in evidenza la presenza di fenomeni anomali. Un esempio può essere il caso delle transfaunazioni che producono popolazioni miste da cui si possono trarre dei campioni costituiti da individui di ceppi diversi mescolati (aspetto genetico), o ancora situazioni in cui si raccolgono in fiume campioni di popolazioni parzialmente ricostituite con pesci cresciuti in vasche di allevamento (aspetto morfologico). Quando vengono riconosciuti casi del genere, è necessario ridefinire il campione escludendo i soggetti riconosciuti estranei, e quindi il procedimento di analisi dei dati viene applicato sia sul campione iniziale che su quello rimaneggiato, traendo informazioni dalle differenze che risultano nei confronti con gli altri gruppi in analisi. C) Selezione qualitativa degli individui e prelievo dei campioni biologici 20

21 Durante i campionamenti sul campo, da ogni individuo anestetizzato è stato effettuato il prelievo di un pezzo di pinna anale che è stato posto in soluzione conservante fino all arrivo in laboratorio dove vengono eseguite le analisi genetiche sia sul DNA mitocondriale che sul DNA nucleare. Successivamente gli animali sono stati posti in capienti vasche ossigenate per il recupero dall anestesia prima di essere rilasciati nel punto di cattura. Per ogni sito di campionamento è stata redatta una scheda indicante le principali caratteristiche idrologiche ed ambientali e l elenco con numerazione progressiva degli animali campionati, con la relativa valutazione fenotipica preliminare e il peso. Il campione viene registrato nel database multirelazionale con data e località di campionamento, dati biometrici raccolti sul campo, classificazione fenotipica preliminare, codice alfanumerico di marcatura con PIT tag, sesso, maturità sessuale e note eventuali. La lunghezza dell animale viene ricavata in modo indiretto con un calibro digitale durante l elaborazione dell immagine per la morfometria, mediante un riferimento dimensionale costituito da uno sfondo centimetrato posizionato sul piano di appoggio su cui viene adagiato l animale per la ripresa video. In ogni sito di campionamento sono stati raccolti individui di fenotipo marmoratus, fenotipi che presentano segni di ibridazione con la trota fario, i fenotipi lacustri supposti autoctoni qualora rinvenuti in zone prossime a sistemi lentici, e alcuni individui di trota fario (sia di ceppo moderno di allevamento che di altro fenotipo descritto come quello maggiormente presente fino ad un trentennio fa: in alcuni casi questi presentano profilo genetico molto diverso). Questi servono come base di confronto soprattutto nell interpretazione dei risultati che si ottengono dalle analisi condotte specificatamente per indagare sul fenomeno dell'ibridazione a livello locale. Partendo dall assunzione che gli individui ibridi portano nel loro genoma componenti genetiche derivate da un genitore fario o ibrido-fario, occorre conoscere quali sono queste componenti alloctone che possono essere rinvenute nei genotipi dei soggetti che presentano morfotipo intermedio. Conoscendo il genotipo degli individui non introgressi è possibile stimare la 21

22 quantità di genotipo non autoctono presente nel pool genico della popolazione selvatica che ha avuto ibridazione con la trota di immissione. Dal punto di vista pratico (lavoro svolto sul campo) durante i campionamenti di tipo prevalentemente qualitativo si è proceduto ad una preliminare selezione visiva del materiale catturato con l elettrostorditore. In una fase successiva, ad animale posto in capienti vasche di contenimento è stata effettuata una seconda selezione finalizzata, quando possibile, ad ottenere un campione sufficientemente vario e comprendente animali di differenti dimensioni, oltre che rappresentativo dell intero spettro di combinazioni cromatiche della livrea presente in quel sito. Questa è una caratteristica peculiare della specie Salmo trutta soprattutto nelle popolazioni in cui sono presenti un numero considerevole di individui ibridi di 2+n generazioni, con variegati fenotipi intermedi tra marmorata e fario. PIT tags La tecnica di applicazione impiegata è quella maggiormente conservativa dell integrità fisica dell animale selvatico a scapito di una massimizzazione nella ritenzione del tags; questa prevede l applicazione a livello della parete addominale. Questa scelta è determinata dal fatto che gli animali vengono rilasciati nei tratti canalizzati in un ambiente molto vicino a quello naturale dal punto di vista dell'alimentazione e della struttura della popolazione; Altre tecniche di marcatura come le applicazioni intramuscolari risultano maggiormente invasive per la trota selvatica e in diversi casi si è osservato che non contribuiscono alla conservazione di un buono stato di salute dei riproduttori oltre ad avere ripercussioni sulla fitness dell'individuo. L applicazione del microchip tra i tessuti della parete addominale non determina reazioni iperplastiche ed infiammatorie come nel muscolo ma per contro si espone al pericolo di perdita del microchip da parte delle femmine soprattutto in periodo riproduttivo, quando vengono sottoposte a manipolazione per il rilascio delle uova in incubatoio, la cosiddetta spremitura. Studi pluriennali eseguiti su popolazioni naturali hanno consentito di stimare una incidenza di perdita del microchip nelle femmine 22

23 dell ordine del 9.97% per evento riproduttivo, in individui con lunghezza alla forca compresa tra 250 e 360 mm.. Nei maschi marcati (FL compresa tre 200 e 310 mm), la perdita o la rottura e malfunzionamento del microchip è stata stimata invece dell 1,89%, con un aumento negli ultimi anni dovuto alla commercializzazione di transponders di minore qualità. In compenso non sono mai state notate malformazioni e formazioni fibrose a livello del muscolo che determinano posture innaturali e che possono influenzare negativamente le capacità natatorie, quindi la fitness dell animale in ambiente naturale. Questi effetti differiti nel tempo sono invece riscontrabili quando si utilizzano marcature a livello intramuscolare. Nella nostra esperienza infine, le marcature sottocutanee sono quelle in cui abbiamo stimato la minor ritenzione del microchip, soprattutto nei soggetti medio-piccoli ma anche nelle femmine e nei maschi indistintamente; per questo motivo nei salmonidi non ne facciamo più uso. D) Analisi genetiche di laboratorio I campioni di tessuto raccolti e mantenuti in soluzione conservante, vengono utilizzati per estrarre il DNA, operazione preliminare a qualsiasi analisi genetica sull acido nucleico. Si tratta in sostanza di procedimenti analitici multistep che operano la distruzione del tessuto e la lisi cellulare, quindi l allontanamento della frazione proteica per ottenere una soluzione da cui il DNA possa essere separato e possa essere conservato quanto più possibile integro e per lungo tempo. Vengono utilizzati diversi metodi di estrazione a seconda della qualità del campione raccolto, la quantità di tessuto disponibile, la presenza di inquinanti ed il tipo di analisi genetica da eseguire. Le metodiche impiegate sono quelle del Solting out, mediante utilizzo combinato di soluzioni di Fenolo-Cloroformio, mediante resine a scambio ionico, mediante kit specifici e mediante kit di separazione su colonna. Il campione di ogni singolo individuo è stato sottoposto almeno a due procedimenti analitici paralleli: 23

24 Il primo che riguarda analisi sul DNA mitocondriale, in cui il DNA estratto è stato utilizzato in amplificazione ciclica in vitro mediante polimerasi (PCR) per mezzo di primers specifici disegnati sulla sequenza del DNA mitocondriale di trota. Il prodotto di amplificazione è stato quindi utilizzato per corse elettroforetiche su acrilamide in ambiente non denaturante per la separazione dei singoli strand e la visualizzazione del polimorfismo. Questo è stato ottenuto mediante la tecnica dell SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) in apparati termostatati a temperatura variabile. La visualizzazione è stata effettuata mediante colorazione argentica (Silver Staining) e l identificazione dell aplotipo è stata effettuata al PC (analisi d immagine) mediante confronto con marcatori interni a sequenza nota. Ogni campione è stato processato indipendentemente almeno due volte e il dato è stato inserito nel database quando risultava coincidente. Alcuni campioni, scelti secondo due distinte modalità, una random e l altra arbitraria, sono stati quindi sottoposti ad analisi di sequenza per conferma. I risultati ottenuti dall analisi del DNA mitocondriale esteso a tutte le popolazioni ha mostrato anche in studi precedenti un quadro piuttosto omogeneo e un differenziamento molto ridotto, pertanto non informativo sulla presenza di differenziamento genetico tra le diverse popolazioni dei diversi bacini. Il dato mitocondriale pertanto, oltre a essere stato utilizzato nel modello integrato di valutazione del grado di ibridazione degli individui (IHS), fornisce un informazione dapprima indicativa e successivamente complementare nella comprensione della dinamica del fenomeno dell ibridazione nei diversi distretti studiati, e in particolare consente una stima indicativa dei tempi a cui si deve far risalire l introgressione di genotipi alloctoni nelle popolazioni originarie. Quando infatti gli individui che presentano segni di introgressione genetica a livello nucleare ed un fenotipo intermedio (simil-fario o simil-marmoratus) e presentano anche una netta prevalenza di mitotipo marmoratus, significa che ci si trova di fronte ad un evento di ibridazione piuttosto recente, in cui maschi di ceppo alloctono introdotto si sono riprodotti con femmine di marmoratus autoctone. La trasmissione dell informazione mitocondriale infatti è di tipo matrilineare, pertanto quando la quasi totalità dei fenotipi intermedi presenta il 24

25 mitotipo marmoratus, significa che la madre apparteneva a quel ceppo genetico. A parità di età, i maschi presenti negli stock di immissione arrivano a riprodursi prima delle femmine e presentano notoriamente un periodo di fertilità molto più esteso nell arco dell anno, pertanto saranno i primi che entreranno in competizione riproduttiva con gli adulti della popolazione originaria di marmoratus, fecondando alcune femmine. Il risultato sarà quello di ottenere degli individui fenotipicamente intermedi, con DNA nucleare misto tra i due ceppi ma con DNA mitocondriale marmoratus proveniente dalla madre. Quando invece i fenotipi intermedi non presentano questa prevalenza di aplotipo marmoratus può significare che anche le femmine di trota fario introdotte si sono riprodotte con i maschi di trota marmorata e pertanto l inizio di un cospicuo fenomeno di ibridazione deve essere fatto risalire almeno a qualche generazione precedente. Una precisa raccolta di dati storici relativi alle immissioni o transfaunazioni può aiutare molto a interpretare i dati che emergono dalle analisi genetiche, soprattutto per il fatto che molto spesso gli incroci tra i ceppi selvatici e quelli di allevamento sono stati fatti proprio dagli allevatori assecondando le richieste di mercato che predilige materiale ittico con maggiori caratteristiche di selvaticità e con livrea più vicina a quella di marmoratus, caratteristiche molto ambite dai pescatori dilettanti. Il DNA estratto è stato inoltre utilizzato per l amplificazione di sequenze di DNA genomico altamente ripetitivo (STRs = short tandem repeats), marcatori conosciuti con il nome di microsatellite. Studi precedenti di genetica di popolazione su Salmo trutta hanno permesso di individuare e selezionare i loci che sono maggiormente informativi a seconda della scala geografica che si intende studiare. Esistono infatti loci ad elevato polimorfismo che si prestano maggiormente a studi a livello microgeografico, in quanto possono mettere in evidenza anche fenomeni di isolamento genetico limitato tra regioni geograficamente molto vicine. L elevato polimorfismo di questi loci però si espone al problema dell isomorfismo elettroforetico, che non consente di distinguere alleli elettromorficamente identici ma differenti per ascendenza, falsando il calcolo delle distanze genetiche dovute all isolamento riproduttivo. A 25