Ricercatore responsabile Dott. Massimiliano Paci Chirurgia Toracica Az. Ospedaliera Arcispedale Santa Maria Nuova Reggio Emilia 0522/296929
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1 Arcispedale S. Maria Nuova Protocollo di studio PCA01 Studio di fattibilità e validazione della quantificazione del DNA libero circolante ed analisi proteomica per individuazione di targets proteici intracellulari utilizzabili come markers diagnostici nel cancro del polmone Ricercatore responsabile Dott. Massimiliano Paci Chirurgia Toracica Az. Ospedaliera Arcispedale Santa Maria Nuova Reggio Emilia 0522/ Collaboratori Dott.ssa Laura Albertazzi Dott.ssa Enrica Bellesia Dott.ssa Fortuna Scamardella Laboratorio Chimico-clinico Dott.ssa Daniela Lasagni Dott. Roberto Baricchi Laboratorio di Immunoematologia e Trasfusionale Dott.ssa Maria Brini Patologia Clinica Dott. Salvatore De Franco Dott. Giorgio Sgarbi Chirurgia Toracica Az. Ospedaliera Arcispedale Santa Maria Nuova Reggio Emilia Coordinatore Prof. Renzo Lodi Coordinatore Dottorato di Ricerca in Fisiopatologia Chirurgica Cardio- Toracica Università degli STUDI DI Modena e Reggio Emilia
2 1. INTRODUZIONE Il cancro del polmone rappresenta oggi il maggior killer oncologico nuovi casi diagnosticati ogni anno in Italia al 90% dei quali questa malattia non lascia scampo. La chirurgia è l unico strumento terapeutico in grado di guarire questa malattia, ha però un grosso limite, la sua efficacia è inversamente proporzionale all evoluzione della malattia stessa. Il cancro del polmone è una malattia multifattoriale che riconosce nella cancerogenesi cause ambientali e cause genetiche (1). Il fumo rappresenta il responsabile storico tra le cause ambientali tanto che il cancro del polmone può essere considerato un tumore da tossicodipendenza mentre negli ultimi anni è emerso sempre più prepotentemente il ruolo dell inquinamento dell aria, recenti notizie di cronaca hanno evidenziato come passeggiare nei centri urbani delle maggiori città italiane produca un danno sulle vie aeree paragonabile a quello del fumo di 15 sigarette al giorno. Recenti studi di biologia cellulare e molecolare hanno permesso di stabilire che il processo di cancerogenesi polmonare è multifasico ed evolve in seguito all accumulo di lesioni genetiche somatiche multiple (10-20 diverse mutazioni) e sequenziali (2,3). Tali lesioni coinvolgono geni il cui prodotto controlla la proliferazione cellulare, la differenziazione e l apoptosi. Questi geni appartengono a due grandi categorie: gli oncogeni dominanti (regolatori positivi della crescita) e geni oncosoppressori (regolatori negativi della crescita) oltre che geni coinvolti nel controllo dell apoptosi (morte programmata cellulare). L amplificazione e/o alterata espressione di oncogeni e spesso istotipo-specifica: la famiglia degli oncogeni MYC e infatti amplificata nei carcinomi a piccole cellule, mentre i recettori per fattori di crescita Her2/neu e EGFR negli adenocarcinomi e nei carcinomi squamosi, rispettivamente. L inattivazione di geni oncosoppressori p53 e FHIT si riscontra invece con alta frequenza in tutti gli istotipi e l inattivazione di geni che controllano l entrata in ciclo della cellula, Rb e p16 INK4A, contraddistingue rispettivamente i microcitomi e i tumori non a piccole cellule. Inoltre altre alterazioni, più generali, consistono in complessi riarrangiamenti cromosomici, quali delezioni e traslocazioni non-reciproche, instabilità di microsatelliti (sequenze ripetute di DNA), sregolata attività telomerasica e neo-angiogenesi. Specifiche alterazioni genetiche possono essere riscontrate non solo nel tumore invasivo, ma anche negli stadi intermedi (metaplasia, displasia) e precoci della trasformazione quali la mucosa bronchiale morfologicamente sana di pazienti con tumore e anche di forti fumatori senza tumore. Fattori di rischio che identificano il tessuto bronchiale normale e pre-neoplastico a rischio di progressione maligna possono essere quindi definiti a livello molecolare (4). L identificazione e la caratterizzazione di alterazioni genetiche che accompagnano l insorgenza e la progressione di tumore polmonare possono pertanto rappresentare degli utili marcatori molecolari da utilizzare per la diagnosi precoce di cancro polmonare (5). I marcatori molecolari finora utilizzati sono le alterazioni di microsatelliti (LOH, MIN), l ipermetilazione genica e le mutazioni in specifici oncogeni (KRAS2) e geni oncosoppressori (p53). Recentemente è stata eseguita la messa a punto di test sensibili di quantificazione del DNA libero circolante nel plasma (6). Questo ha permesso di dimostrare che la quantificazione del DNA circolante tramite una raffinata metodica molecolare può rappresentare un utile strumento diagnostico per discriminare pazienti con tumore rispetto a individui sani e, potenzialmente, per identificare gli individui ad aumentato rischio di cancro quali i forti fumatori nelle fasi molto iniziali della malattia. Inoltre questo test può essere utilizzato come metodo non invasivo per identificare precocemente ripresa e metastasi tumorali durante il follow-up dei pazienti. Inoltre la recente introduzione del concetto di analisi proteomica (7) ha permesso il riconoscimento di strutture proteiche, come l endotelina (8) o la cheratina (9), ipotizzandone un loro coinvolgimento nel processo di cancerogenesi. Questo dato se confermato dallo studio potrebbe proposto sia come marker precoce per la diagnosi NSCLC sia per monitorare la riduzione o la progressione della malattia nel corso di follow-up dei pazienti. 2
3 2. OBIETTIVI DELLO STUDIO 2.1 Studio di fattibilità della quantificazione del DNA libero circolante e di proteine intracellulari tramite analisi proteomica in pazienti affetti da neoplasia polmonare. 2.2 Validazione della metodica di quantificazione del DNA libero circolante e di proteine intracellulari tramite analisi proteomica come markers diagnostici nel cancro del polmone. 2.3 Correlazione della quantità di DNA libero circolante e di proteine intracellulari tramite analisi proteomica con stadio patologico della malattia, istotipo e differenziazione. 2.4 Valutazione della cinetica del DNA libero circolante e di proteine intracellulari tramite analisi proteomica nei pazienti trattati chirurgicamente. 2.5 Correlazione del DNA libero circolante e di proteine intracellulari tramite analisi proteomica con la ripresa di malattia durante il follow-up. 3. MATERIALI E METODI pazienti/anno, per 3 anni, affetti da cancro polmonare non a piccole cellule controlli/anno, per 3 anni, sani controlli/anno, per 3 anni, affetti da bronchite cronica. 3.4 Prelievo unico di 7,5 ml di sangue da vena periferica dai pazienti con cancro del polmone prima dell intervento e dai controlli durante il ricovero o la donazione di sangue. 3.5 Prelievo di 7,5 ml di sangue dai pazienti affetti da cancro del polmone dopo l intervento, a 6 mesi, a 12 mesi, a 24 mesi, a 36 mesi. 3.6 Analisi del DNA circolante nel plasma con utilizzo di real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) per amplificazione dell human telomerase reverse transcriptase gene (htert) e ed analisi proteomica di proteine intracellulari come endotelina e cheratina. 3.7 Analisi statistica per valutare la capacità discriminante dei test dei pazienti affetti da cancro del polmone dai sani, e dagli affetti da bronchite cronica, della correlazione della quantificazione del DNA circolante e dell analisi proteomica di proteine intracellulari con stadio, istotipo e differenziazione, della cinetica del DNA circolante e delle proteine intracellulari dopo intervento, della correlazione della quantificazione del DNA circolante e dell analisi proteomica di proteine intracellulari con ripresa di malattia durante il followup. 4. SELEZIONE DEI PAZIENTI Pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule. Diagnosi istologica o citologica. Ricoverati in chirurgia toracica per trattamento primario chirurgico. 3
4 Compilazione del foglio informativo e consenso informato. Anamnesi positiva per pregressa neoplasia. Precedente chemio/radioterapia. Diagnosi istologica o citologia incerta. 5. SELEZIONE DEI CONTROLLI SANI Assenza di diagnosi pregressa di neoplasia. Correlazione con pazienti affetti da cancro del polmone per età, sesso ed abitudini tabagiche. Ricoverati in chirurgia toracica per patologia non neoplastica e/o donatori di sangue dell ospedale. Compilazione del foglio informativo e consenso informato. Diagnosi di tumore o malattia grave. 6. SELEZIONE DEI CONTROLLI AFFETTI DA BRONCHITE CRONICA Assenza di diagnosi pregressa di neoplasia. Diagnosi clinico/strumentale di bronchite cronica. Correlazione con pazienti affetti da cancro del polmone per età, sesso ed abitudini tabagiche. Compilazione del foglio informativo e consenso informato. Diagnosi di tumore o malattia grave diversa dalla bronchite cronica. 7. DISEGNO DELLO STUDIO Verranno reclutati tutti i pazienti che soddisfano i criteri soprariportati. L obiettivo è di reclutare 50 pazienti/anno affetti da cancro del polmone, 50 controlli/anno sani, 50 controlli/anno affetti da bronchite cronica. Il follow-up verrà effettuato con visita e prelievo nei pazienti affetti da cancro del polmone ed operati a 6 mesi, 12 mesi, 24 mesi e 36 mesi. Nei controlli a 12 mesi, 24 mesi e 36 mesi tramite comunicazione telefonica delle condizioni di salute. Nei pazienti sani o affetti da bronchite cronica in cui la quantificazione del DNA circolante e/o delle proteine cellulari risulteranno elevati verrà consigliata TC del torace e, se la TC del torace risulterà negativa, broncoscopia. Lo studio ha una durata prevista di 3 anni. 4
5 8. CONSENSO INFORMATO Ogni paziente verrà preventivamente informato mediante scheda informativa che si prefigge lo scopo di: a. Informare i pazienti ed i controlli dello scopo dello studio. b. Chiedere ai pazienti ed ai controlli di sottoporsi a prelievo di 7,5 ml di sangue. c. Informare i pazienti ed i controlli che tale prelievo verrà usato per scopi esclusivamente di ricerca. 9. BIBLIOGRAFIA 1. Fong KM, Sekido Y, Gazdar AF, Minna JD. Molecular biology of lung cancer: clinical implications. Thorax 2003; 58: Sanchez.Cespedes M. Dissecting the genetic alterations involved in lung carcinogenesis. Lung Cancer 2003; 40: Sozzi G, Oggioni M, Alasio L, Conte D, Tavecchio L, Pilotti S et al. Molecular changes track recurrence and progression of bronchial precancerous lesions. Lung Cancer 2002; 37: Brambilla C, Fievet F, Jeanmart M, de Fraipont F, Lantuejoul S, Frappat V et al. Early detection of lung cancer: role of biomarkers. Eur Respir J 2003; 21: Suppl. 39, 36s- 44s. 5. Sozzi G, Conte D, Leon ME, Cirincione R, Roz L, Ratcliffe C et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol 2003; 21: Sozzi G, Conte D, Mariani L, Lo Vullo S, Roz L, Lombardo C et al. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Canc Res 2001; 61: Griese M, Noss J, von Bredow C. Protein pattern of exhaled breath condensate and saliva. Proteomics 2002; Jun 2(6): Carpagnano GE, Foschino-Barbaro MP, Resta O, Gramiccioni E, Carpagnano F. Endothelin-1 is increased in the breath condensate of patients with non-small-cell lung cancer. Oncology 2004; 66(3): Gianazza E, Allegra L, Bucchioni E, Eberini I, Puglisi L, Blasi F, Terzano C, Wait R, Sirtori CR. Increased keratin content detected by proteomic analysis of exhaled breath condensate from healthy persons who smoke. Am J Med 2004; Jul 117(1):
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