DOSSIER SALMONELLA. Biolife COLTURA IDENTIFICAZIONE SIEROTIPIZZAZIONE. Biolife Italiana Srl Pagina 1 di 33

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1 DOSSIER SALMONELLA COLTURA IDENTIFICAZIONE SIEROTIPIZZAZIONE Biolife Biolife Italiana Srl Pagina 1 di 33

2 ALTRI DOSSIER DISPONIBILI DOSSIER IGIENE AMBIENTALE HACCP. DOSSIER YERSINIA Coltura, identificazione, e sierologia. DOSSIER LEGIONELLA - Coltura ed identificazione. DOSSIER LISTERIA - ALOA Coltura ed identificazione di L.monocytogenes. DOSSIER E.COLI O157 Coltura ed identificazione. DOSSIER ESAME DELLE ACQUE. DOSSIER ETEST. Richiedere i Dossier di Vostro interesse al nostro Servizio Tecnico-Commerciale. Biolife Italiana Srl Pagina 2 di 33

3 PRODOTTI PER SALMONELLA DESCRITTI NEL DOSSIER PRE-ARRICCHIMENTO BUFFERED PEPTONE WATER P/FL / ARRICCHIMENTO SELETTIVO MUELLER KAUFFMANN TETRAT. BROTH BASE P/PV / MUELLER KAUFFMANN TETRAT. BROTH BASE ISO P TRATHIONATE BROTH BASE P SELENITE CYSTINE BROTH P/PV / RAPPAPORT VASSILIADIS RVS BROTH P/PV / RAPPAPORT VASSILIADIS BROTH P/PV / SELENITE BROTH P/PV / FL ISOLAMENTO SELETTIVO BRILLIANT GREEN AGAR MOD. P/PS / HEKTOEN ENTERIC AGAR P/PS / FL SS AGAR P/PS / FL XLD AGAR P/PS / ISOLAMENTO SU TERRENO CROMOGENO CHROMOGENIC SALMONELLA AGAR BASE P SALMONELLA SELECTIVE SPLEMENT SLF CHROMOGENIC SALMONELLA AGAR PS CHROM.SALMONELLA AGAR+ HEA PS DETERMINAZIONE DEI CEPPI MOBILI MODIFIED SEMISOLID RAPPAPORT VASSILIADIS MEDIUM (MSRV) p SIIMPLE METHOD SALMONELLA (SMS) P SMS KIT P/SLF MODIFIED SEMISOLID SALMONELLA MEDIUM ACC. TO MAROSSI CANTONI P IDENTIFICAZIONE - SCREENING MUCAP TEST R IDENTIFICAZIONE CON ANTISIERI ANTISIERI ANTI SALMONELLA R vedi listino FL KIT P PS PV R SLF SLQ LEGENDA Terreno di coltura pronto all'uso in flacone, confezioni da 6 pezzi Insieme di reattivi per l'identificazione Terreno in polvere disponibile in confezioni da 100 g, 500 g, 5 Kg. Terreno di coltura pronto all'uso in piastra, confezione da 10 pezzi Terreno di coltura pronto all'uso in provetta, confezioni da 10 pezzi Reattivo singolo in flacone Supplemento per terreni di coltura in forma liofilizzata Supplemento per terreni di coltura in forma liquida Biolife Italiana S.r.l. Viale Monza 272, Milano. Tel. n Fax n biolife@masciabrunelli.it - Internet: Biolife Italiana Srl Pagina 3 di 33

4 INTRODUZIONE Al genere Salmonella appartengono bacilli Gram negativi, mobili, conformi alla definizione della famiglia delle Enterobacteriaceae. Correntemente si riconoscono 2 specie nel genere Salmonella: S.enterica, composta da 6 sottospecie (S.enterica subsp. enterica (subsp. I), S.enterica subsp. salamae (subsp.ii) S.enterica subsp. arizonae (subsp. IIIa) S.enterica subsp. diarizonae (subsp. IIIb) S.enterica subsp. houtenae (subsp.iv), S.enterica subsp. indica (subsp. VI)) e S.bongori. Nell uomo si isola di norma la subspecie I, mentre dagli animali a sangue caldo e dall ambiente sono di solito isolate le subspecie II, IIIa, IIIb, IV e VI e S. bongori. Il WHO Collaborative Centre for Reference and Research, designa i sierotipi appartenenti alla subspecie I con un nome riferito al luogo geografico del primo isolamento (Salmonella ser. Typhimurium o Salmonella Typhimurium). I sierotipi appartenenti alle altre subspecie sono designati con la formula antigenica seguita dal nome della subspecie (es. S-enterica subsp. salamae ser. 50:z:e,n,x). Attualmente si riconoscono 2435 sierotipi di salmonella. La maggior parte dei sierotipi, inclusa Salmonella ser. Typhi, appartengono alla subspecie 1 (1435 sierotipi). Significato clinico I ceppi di salmonella non tifoide provocano di norma un infezione intestinale con diarrea, febbre e dolori addominali che hanno una durata di circa 1 settimana. Salmonella è ubiquitaria negli animali e l infezione nell uomo è, di solito, legata all ingestione di alimenti di origine animale. La salmonellosi può essere anche trasmessa dal contatto diretto con gli animali, dall ingestione di alimenti di origine non-animale, dall acqua e occasionalmente dal contatto umano. La febbre tifoide è un problema clinico serio, frequente nei paesi in via di sviluppo, ma raro nei paesi sviluppati. La dose infettante è bassa (<10 3 ), il periodo d incubazione lungo (1-6 settimane); l uomo è l unica fonte dell infezione e può essere portatore sano.il contagio avviene attraverso il contatto inter-umano o con l ingestione di alimenti ed acqua contaminate da feci umane. Un quadro clinico simile alla febbre tifoide è provocato dai ceppi di Salmonella ser. Paratyphi A, Salmonella ser. Paratyphi B Salmonella ser. Paratyphi C. Isolamento L isolamento ottimale di Salmonella dalle feci si ottiene con un arricchimento selettivo seguito dalla semina su due terreni in piastra a selettività differente; dagli alimenti i migliori risultati si ottengono con un pre-arricchimento non selettivo, seguito dall arricchimento selettivo in 2 terreni liquidi, seguito dall isolamento su terreni n piastra. La norma ISO per la determinazione di salmonella negli alimenti è attualmente in revisione con una seriedi modifiche nela scelta dei terreni liquidi e di quelli solidi per consentire l isolamento anche di Salmonella ser. Typhi. Gli schemi d isolamento di Salmonella dalle feci e dagli alimenti sono riportati nelle tabelle 1 e 2. Screening Le procedure di screening delle colonie sospette includono test di agglutinazione al latice su card, agglutinazione su vetrino con antisieri O Gruppi A, B, C1, C2, D, E, test biochimici tradizionali (KIA, TSI), test biochimici rapidi (C 8 esterasi-mucap Test ) MUCAP Test è un Marchio registrato di Biolife Italiana. Identificazione: test biochimici Le colonie sospette coltivate sulle piastre d isolamento possono essere identificate con i test biochimici tradizionali in provetta o miniaturizzati nei kit del commercio. Le reazioni biochimiche impiegate per l identificazione delle specie e delle subspecie di salmonella sono: dulcitolo, lattosio, ONPG, salicina, sorbitolo, malnato, mucato, crescita in KCN, gelatina, L-(+) tartrato. Identificazione: sierotipizzazione Le salmonelle sono sierotipizzate in accordo ai loro antigeni O (somatici), Vi (capsulari) e H (flagellari). Le formule antigeniche delle salmonella sono elencate nello schema di Kauffann-White e sono espresse come segue: antigene(i) O, Vi (quando presente): antigene (i) H fase 1: antigene (i) H fase 2 (quando presente). Biolife Italiana Srl Pagina 4 di 33

5 Schema di lavoro per la determinazione di Salmonella spp. nelle feci 1 g di campione + 9 ml terreno liquido di trasporto (TRANSFEC) campione in terreno semisolido di trasporto (TRANSYSTEM) Semina in SELENITE BROTH O MUELLER KAUFFMANN BROTH O TETRATHIONATE BROTH O RAPPAPORT VASSILIAIDIS RVS BROTH Incubare a 37 C o 41,5 +/- 1 C per ore Seminare su XLD AGAR o HEA o SS AGAR Incubare a 37 +/- 1 C per ore Seminare su CHROMOGENIC SALMONELLA AGAR Incubare a 37 +/- 1 C per ore MUCAP TEST COLONIE TIPICHE COLONIE NON TIPICHE AGGLUTINAZIONE CON ANTISIERI AGGLUTINAZIONE CON ANTISIERI ELIMINARE LA PIASTRA Biolife Italiana Srl Pagina 5 di 33

6 Schema di lavoro per la determinazione di Salmonella spp (inclusa S.typhi) negli alimenti (schema modificato da ISO 6579) 25 g di campione ml BUFFERED PEPTONE WATER Incubare a C Per ore 0.1 ml di brodocoltura di pre-arricchimento + 10 ml di RAPPAPORT VASSILIAIDIS RVS BROTH Incubare a 41,5 +/- 1 C per 24 +/- 3 ore 1ml di brodocoltura di pre-arricchimento + 10 ml di MUELLER KAUFFMANN TETRATHIONATE BROTH ISO FORM.+ novobiocina Incubare a 37 +/- 1 C per 24 +/- 3 ore Seminare su XLD AGAR Incubare a 37 +/- 1 C per 24 +/- 3 ore Seminare su un secondo terreno a scelta del Laboratorio Chromogenic Salmonella Agar Incubare a 37 +/- 1 C per 24 +/- 3 ore MUCAP TEST COLONIE TIPICHE COLONIE NON TIPICHE AGGLUTINAZIONE CON ANTISIERI PROVE BIOCHIMICHE ELIMINARE LA PIASTRA Biolife Italiana Srl Pagina 6 di 33

7 PROCEDURA PER L ISOLAMENTO DI SALMONELLA DAGLI ALIMENTI (ISO 6579) ISO 6579 descrive la seguente tecnica d isolamento di Salmonella: PRE-ARRICCHIMENTO 1. Addizionare 25 g di campione a 225 ml di Buffered Peptone Water. Se la quantità di campione richiesta da specifiche norme è diversa da 25 g impiegare la necessaria quantità di Buffered Peptone Water per ottenere una diluizione 1/10 (m/v) del campione. Nel caso si debbano esaminare più aliquote da 25 g di un medesimo lotto di alimento è possibile eseguire un pool dei campioni (es. 10 aliquote da 25 g possono essere miscelate ed inoculate in 2,25 l di Buffered Peptone Water. In caso di prodotti a ph acido, assicurarsi che durante il prearricchimento il ph non scenda sotto 4.5; se necessario utilizzare Double-Buffered Peptone Water (Biolife REF D) 2. Incubare a 35 o 37 C per 18 ± 2 ore ARRICCHIMENTO SELETTIVO 3. Trasferire 0.1 ml di coltura in 10 ml di Rappaport Vassiliadis Soy Broth ed una seconda aliquota di coltura da 1 ml in 10 ml di Mueller Kauffmann Novobiocin Broth (MKTTn) 4. Incubare il terreno Rappaport Vassiliadis Soy Broth a 41,5 C ± 1 C per 24 h ± 3 h; incubare le provette di MKTTn a 37 C ± 1 for 24 h ± 3. ISOLAMENTO 5. Partendo dalle colture in Rappaport Vassiliadis Soy Broth inoculare con un ansa da 3 mm una piastra da 140 mm o 2 piastre da 90 mm di XLD Medium. Ripetere l operazione con un secondo terreno a scelta del laboratorio (es. Chromogenic Salmonella Agar che consente di determinare anche i ceppi di Salmonella lattosio positivi oltre che S.Typhi e S.Paratyphy). 6. Ripetere le semine come descritte al punto 5 con le colture ottenute in MKTTn. 7. Incubare le piastre a 35 o 37 C per ore ed osservare per la presenza di colonie tipiche. Se si osservano crescite scarse o nessuna crescita, reincubare le piastre per altre ore. CONFERMA 8. Sottoporre a conferma almeno 1 colonia sospetta per piastra. Se il test di conferma risultasse negativo ripetere il test di conferma con almeno 4 colonie. Purificare le colonie da sottoporre ai test di conferma su piastre di Nutrient Agar. Eseguire i seguenti test di conferma: TSI Agar, Urea Agar, L-Lysine Decarboxylase Medium, determinazione della of β- galactosidase, test VP, test indoleo. La conferma sierologica include la determinazione della presenze degli antigeni di Salmonella O-, Vi- e H con il test di agglutinazione su vetrino. TEST DI SCREENING PER SALMONELLA Quale test di screening per l identificazione presuntiva di Salmonella può essere usato MUCAP Test (cat ). Il Test MUCAP non è previsto nella norma ISO 6579 Biolife Italiana Srl Pagina 7 di 33

8 DESCRIZIONE DEI PRODOTTI BUFFERED PEPTONE WATER Terreno in polvere e pronto all uso in flacone, per il pre-arricchimento di Salmonella FORMULA TIPICA (g/l) Peptone 10.0 Sodio cloruro 5.0 Sodio fosfato bibasico 3.5 Potassio fosfato monobasico 1.5 PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 20 g in 1000 ml di acqua distillata fredda; riscaldare fino a completa soluzione, distribuire ed autoclavare a 121 C per 20 minuti. ph finale 7.0 ± 0.1. ph finale 7.0 ± 0.1. TERRENO IN FLACONE Il terreno in flacone è pronto per l uso. ph finale 7.0 ± 0.1. DESCRIZIONE Buffered Peptone Water è un terreno non selettivo preparato secondo la formulazione riportata in ISO 6579; è indicato per la fase di pre-arricchimento nelle procedure di isolamento delle salmonelle nei prodotti alimentari e nelle acque. Buffered Peptone Water è raccomandato da ISO 6579 nella norma di carattere generale per l isolamento di Salmonella e da numerose norme specifiche di prodotto. Il terreno è indicato anche dall O.M per il prearricchimento non selettivo di preparati pastorizzati a base d uovo. Buffered Peptone Water Biolife è preparato con un peptone di carne particolarmente ricco che consente il recupero ottimale di Salmonella anche quando presente in carica molto bassa. Il terreno è disponibile su richiesta con concentrazione doppia di fosfati (Double Buffered Peptone Water D) BIBLIOGRAFIA Anon. (1975) - Meat and meat products detection of Salmonella. International standard 150, (E) Geneve: International Organisation for Standardisation. ISO 6579: 2002 Microbiology of food and animal feed stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp. Harvey R.W.S. and Price T.H. (1977) J. App. Bact. 43, O.M.11/10178: Limiti di cariche microbiche tollerabili in determinate sostanze alimentari e bevande. Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana, n 346 del 13/12/78. CONFEZIONI Terreno in polvere Buffered Peptone Water, 100 g (5 l) Buffered Peptone Water, 500 g (25 l) Buffered Peptone Water, 5 kg (250 l) Terreno pronto all uso Buffered Peptone Water, 6 flaconi da 90 ml Buffered Peptone Water, 6 flaconi da 225 ml Biolife Italiana Srl Pagina 8 di 33

9 SELENITE BROTH Brodo d arricchimento selettivo per Salmonella, in polvere e pronto all uso in provetta e flacone FORMULA TIPICA (g/l) Triptone 5 Lattosio 4 Sodio fosfato bibasico 10 Sodio biselenito (NaHSeO 3 ) 4 PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 23 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa soluzione e distribuire in provette sterili; non eccedere nel riscaldamento e non autoclavare. Il terreno appare limpido ed incolore. ph finale 7.0 ± 0.1. TERRENO IN FLACONE Il terreno liquido è pronto per l'uso. ph finale 7.0 ± 0.1. DESCRIZIONE Selenite Broth è un terreno d arricchimento per i microrganismi appartenenti al genere Salmonella nelle feci, urine, tessuti o altro materiale patologico. Il terreno è preparato in accordo con la formula descritta da Leifson e raccomandata dall APHA. Il sodio selenito possiede una elevata tossicità, a ph neutro, per Escherichia coli ma non per la maggior parte dei microrganismi appartenenti al gruppo delle salmonelle. Nel terreno è presente un sistema tampone che tende a rendere minimi gli effetti alcalinizzanti indotti dalla riduzione del selenito, che diminuirebbero notevolmente le proprietà selettive del mezzo; gli acidi che sono prodotti dai coliformi a partire dal lattosio contribuiscono anch essi a neutralizzare le reazioni alcaline del terreno. Alcuni ceppi di Shigella avendo delle similarità con E. coli, in Selenite Broth sono inibiti nella stessa misura di questi ultimi. Per questo motivo per l isolamento di Shigella è raccomandato l uso di un brodo d arricchimento meno selettivo (GN Broth) seguito dal trapianto in XLD Agar. Price riporta che un aumento nell isolamento di Shigella si ottiene arricchendo i campioni in Selenite Broth sterilizzato per filtrazione. Il terreno Biolife pronto all uso in provetta e flacone è sterilizzato per filtrazione e distribuito con le precauzioni dell asepsi. BIBLIOGRAFIA APHA (1963) - Diagnostic Procedures and Reagents, 4th Ed. Banfer, J.R.J. (1971) - Comparison of the isolation of salmonellae from human faces at 37 C and 43 C Zent. Bakt, Par, Inf. Hyg. 217, Chattopadhyay, B. and J.N. Pilfold (1976) - The effect of prolonged incubation of Selenite F broth on the rate of isolation of Salmonella from feces. Med. Lab. Sci. 33, Georgala, D.L. and M. Boothroyd (1964) - A rapid immuno-fluorescence technique for detecting salmonellae in row meat. J. Hyg. Camb. 62, Harvey, R.W.S. and Scott Thompson (1953) - Mont. Bull. Min. Hlth. Pub. Hlth. Serv. 12, Leifson, E. (1936) - New Selenite Enrichment Media for the isolation of Typhoid and Parathyphoid (salmonella) Bacilli. Am. J. Hyg. 24, Price, T.H. (1976) - Isolation of Shigella sonnei by fluid media. J. Hyg. Camb. 77, Spino, D.F. (1966) - Elevated temperature technique for isolation of salmonella from streams. App. Microbiol. 14, CONFEZIONI Terreno in polvere Selenite Broth, 500 g (21.7 l) Selenite Broth, 5 kg (217 l) Terreno pronto per l uso Selenite Broth, 6 flaconi pronti per l uso da 100 ml Selenite Broth, 20 provette pronte per l uso da 9 ml Biolife Italiana Srl Pagina 9 di 33

10 SELENITE CYSTINE BROTH Brodo per l arricchimento selettivo di Salmonella negli alimenti FORMULA TIPICA (g/l) Triptone 5.00 Lattosio 4.00 Sodio fosfato bibasico Sodio selenito acido (NaHSeO 3 ) 4.00 L-cistina 0.01 PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 23 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa soluzione e distribuire in provette sterili. Non eccedere nel riscaldamento e non autoclavare. ph finale 7.0 ± 0.1. TERRENO IN FLACONE Il terreno liquido è pronto per l'uso. ph finale 7.0 ± 0.1. DESCRIZIONE Selenite Cystine Broth è impiegato per l arricchimento selettivo delle salmonelle negli alimenti ed in generale nei campioni di interesse igienistico. Il terreno è raccomandato per questo scopo dallenormative internazionali (AOAC, FDA, ISO) e nazionali (O.M. 11/10/1978) abbinato ad un secondo terreno selettivo d arricchimento: Mueller Kauffmann Tetrathionate Broth o Tetrathionate Broth, o Rappaport Vassiliadis Broth. Selenite Cystine Broth è preparato in accordo con la formula descritta da Leifson e modificata da North e Bartram, raccomandata da ISO 6579:1993 per i prodotti alimenatari e da USP per i prodotti farmaceutici (Microbial Limit Test) Per l esame degli alimenti è generalmente riconosciuta valida la tecnica che prevede un prearricchimento non selettivo del campione in Buffered Peptone Water ed un arricchimento selettivo in Selenite Cystine Broth ed in un secondo terreno selettivo. BIBLIOGRAFIA AOAC (1980) - Official Methods of Analysis, 16th Ed. (1995). FDA (1995) Bacteriological Analytical Manual, 8 th ed. Revision A, Published by AOAC International. ISO 6579: 1993 Microbiology - General guidance on methods for the detection of Salmonella. Leifson, E. (1936). Am. J. Hyg., 24, NCCLS document M22-A2, Quality Assurance for Commercially prepared Microbiological Culture Media-2 nd ed.; Approved Standard. North, W.R. and M.T. Bartram (1953) Appl. Microbiol. 1, 130. U.S. Pharmacopoeia 24, NF 19 (2000) CONFEZIONI Terreno in polvere Selenite Cystine Broth, 100 g (4.3 l) Selenite Cystine Broth, 500 g (21.7 l) Selenite Cystine Broth, 5 kg (217 l) Terreno pronto all uso Selenite Cystine Broth, 6 flaconi pronti all uso da 100 ml Selenite Cystine Broth, 20 x 10 ml, provette pronte all uso Biolife Italiana Srl Pagina 10 di 33

11 MULLER KAUFFMANN TETRATHIONATE BROTH BASE MULLER KAUFFMANN TETRATHIONATE BROTH Brodo selettivo in polvere e pronto all uso in provetta e flacone, per l arricchimento di Salmonella FORMULE TIPICHE Muller Kauffmann Tetrathionate Broth Base terreno in polvere (g/l) Triptone 7.00 Peptone di soia 2.30 Sodio cloruro 2.30 Calcio carbonato Sodio tiosolfato Sali biliari 4.75 Muller Kauffmann Tetrathionate Broth provette e flaconi (g/l) Triptone 7.00 Peptone di soia 2.30 Sodio cloruro 2.30 Calcio carbonato Sodio tiosolfato Sali biliari 4.75 Iodio 3.80 Potassio ioduro 4.75 Verde brillante PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 82 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione e raffreddare a 45 C. Aggiungere 19 ml di soluzione di iodio e 9.5 ml di una soluzione allo 0.1% di verde brillante. Mescolare bene e distribuire in provette o beute. Soluzione di iodio: iodio 20 g, potassio ioduro 25 g, acqua distillata q.b.a 100 ml Sciogliere lo ioduro di potassio in 5 ml di acqua distillata e addizionare lo iodio e riscaldare leggermente fino a completa solubilizzazione. Portare al volume finale. In alternativa usare la soluzione pronta all uso cat. n Soluzione di verde brillante: verde brillante 0.1 g, acqua distillata 100 ml Riscaldare a 100 C per 30 minuti per assicurare la completa solubilizzazione del colorante. In alternativa usare la soluzione pronta all uso cat. n Conservare in flaconi di vetro scuro lontano dalla luce. TERRENO IN FLACONE: Il terreno liquido è pronto per l'uso. DESCRIZIONE Muller Kauffmann Tetrathionate Broth è preparato secondo una modifica di Kauffmann alla formulazione originale di Muller. Il terreno è raccomandato dall O.M. 11/10/78 per l arricchimento di Salmonella in campioni alimentari quali latte, gelati e prodotti a base d uova pastorizzati e da ISO 6785 per latte e derivati. Il terreno è indicato dal rapporto ISTISAN 96/35 per l arricchimento selettivo di Salmonella nel latte e derivati e nelle uova fresche. Per la preparazione del terreno completo si deve aggiungere alla base, raffreddata ad una temperatura inferiore a 45 C, verde brillante e soluzione iodica. L aggiunta eventuale di novobiocina 4 mg/l sopprime la crescita dei protei. BIBLIOGRAFIA ISO 6785 Milk and milk products - Detection of Salmonella 1st Ed Muller, L. (1923) C.R. Soc. Biol. (Paris) 89, Kauffmann, F. (1935) Z.f. Hyg. 117, Anon (1975) Meat and Meat products detection of salmonellae. international Standard (E) Geneve: International Organization for Standardisation. O.M. 11/10/78: Limiti di cariche microbiche tollerabili in determinate sostanze alimentari e bevande. Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana n. 546 del 13/12/78. Rapporto ISTISAN 96/35. ISSN Metodi di analisi per il controllo microbiologico degli alimenti. Raccolta a cura di D. De Medici, L. Fenicia, L. Orefice e A.Stacchini. CONFEZIONI Terreno in polvere M.K. Tetrathionate Broth Base, 500 g (6,1l) M.K. Tetrathionate Broth Base, 5 kg (61 l) Terreno pronto all uso M.K. Tetrathionate Broth, 20 x 10 ml, provette 18x145 mm M.K. Tetrathionate Broth, 6 flaconi da 100 ml Biolife Italiana Srl Pagina 11 di 33

12 MULLER KAUFFMANN TETRATHIONATE BROTH BASE ISO FORM. NOVOBIOCIN MKTT ANTIMICROBIC SUPPLEMENT IODINE SOLUTION Brodo selettivo in polvere e relativi supplementi per l arricchimento di Salmonella Formule tipiche Muller Kauffmann Tetrathionate Broth Base ISO Formulation (g/l) Idrolisato enzimatico di carne 4.30 Idrolisato enzimatico di caseina8.60 Sodio cloruro 2.60 Calcio carbonato Sodio tiosolfato anidro Sali biliari 4.75 Verde brillante 9.50 mg Novobiocin MKKT Antimicrobic Supplement ( fiala per 500 ml) Novobiocina 20 mg Iodine Solution (flacone da 50 ml) Iodio 10.0 g Potassio ioduro 12.5 g Acqua distillata q.b 50 ml PREPARAZIONE Sospendere 44.6 g di polvere in 500 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione e raffreddare a C. Aggiungere 10 ml di Iodine Solution (REF ) ed il contenuto di una fiala di Novobiocin MKTT Antimicrobic Supplement-20 mg/fiala (REF ), ricostituita con 5 ml di acqua distillata sterile. Nel caso si utilizzasse il supplemento selettivo con codice (Novobiocin Antimicrobic Supplement da 10 mg/fiala) a 500 ml di terreno di base addizionare il contenuto di 2 fiale. Mescolare bene e distribuire in provette o beute. Nel caso la soluzione di iodio fosse preparata dall utilizzatore procedere come segue: Soluzione di iodio: iodio 20 g potassio ioduro 25 g acqua distillata q.b.a 100 ml Sciogliere lo ioduro di potassio in 5 ml di acqua distillata e addizionare lo iodio e riscaldare leggermente fino a completa solubilizzazione. Portare al volume finale. In alternativa usare la soluzione pronta all uso cat, n ph finale del terreno: 8.2 ± 0.2 DESCRIZIONE Muller Kauffmann Tetrathionate Broth Base ISO Formulation, supplementato con novobiocina e iodina corrisponde al terreno raccomandato da ISO 6579 per l arricchimento di Salmonella nei campioni alimentari. Il metodo orizzontale ISO prevede l impiego di un secondo brodo selettivo (Rappaport Vassiliadis Soy RVS- Broth) ed il pre-arricchimento in Buffered Peptone Water BIBLIOGRAFIA ISO 6579: 2002 Microbiology of food and animal feed stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp. CONFEZIONI Terreno in polvere M.K. Tetrathionate Broth Base ISO Formulation 500 g (5.6 l) M.K. Tetrathionate Broth Base ISO Formulation 5 kg (56 l) Supplementi richiesti Iodine Solution 50 ml Novobiocin MKTT Antimicrobic Suppl. (20 mg) 10 fiale, ciascuna per 500 ml di terreno Biolife Italiana Srl Pagina 12 di 33

13 FORMULA TIPICA (g/l) Peptone di soia Sodio cloruro Potassio fosfato monobasico Potassio fosfato bibasico Magnesio cloruro Verde malachite ossalato RAPPAPORT VASSILIADIS SOY (RVS) BROTH Terreno per l arricchimento di Salmonella in campioni alimentari ed ambientali PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 26.6 g in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare leggermente per sciogliere il terreno, distribuire 10 ml in provette con tappo a vite ed autoclavare a 115 C per 15 minuti. ph 5.2 ± 0.2 TERRENO IN FLACONE Il terreno liquido è pronto per l'uso. ph finale 5.2 ± 0.2 DESCRIZIONE Rappaport Vassiliadis Soy (RVS) Broth è prodotto in accordo alla formulazione indicata dalla norma ISO 6579:2002. Rappaport Vassiliadis Soy (RVS) Broth è un terreno impiegato per l arricchimento selettivo di Salmonella in campioni alimentari, ambientali e nelle acque. Rispetto alla formulazione classica (Rappaport Vassiliadis Broth cod ) l RVS Broth contiene il potassio fosfato bibasico ed il peptone di soia e concentrazioni inferiori di potassio fosfato monobasico. Queste modificate concentrazioni saline consentono un migliore mantenimento del ph e un miglioramento nell isolamento delle salmonelle. BIBLIOGRAFIA Van Schothorsts, M., Renaud, A., van Beek, C. (1987) Food Microbiology 4, ISO 6579 Microbiology of food and animal foodstuff - Horizontal method for the detection of Salmonella spp CONFEZIONI Terreno in polvere Rappaport Vassiliadis Soy (RVS) Broth, 500 g (18.7 l) Rappaport Vassiliadis Soy (RVS) Broth, 5000 g (187 l) Terreno pronto all uso Rappaport Vassiliadis Soy (RVS) Broth, 6 flaconi da 100 ml Rappaport Vassiliadis Soy (RVS) Broth, 20x10 ml provette pronte per l uso Biolife Italiana Srl Pagina 13 di 33

14 RAPPAPORT VASSILIADIS (RV) BROTH Brodo selettivo per l arricchimento di Salmonella FORMULA TIPICA (g per 1000 ml di terreno) Triptone 4.54 Potassio fosfato monobasico 1.45 Sodio cloruro 7.2 Magnesio cloruro anidro 13.3 Verde malachite ossalato PREPARAZIONE Sospendere 26.5 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Riscaldare fino a completa soluzione. Distribuire in provette con tappo a vite ed autoclavare a 115 per 15 minuti. ph finale 5.2 ± 0.2. TERRENO IN FLACONE Il terreno liquido è pronto per l'uso. ph finale 5.2 ± 0.2. DESCRIZIONE La formulazione riportata da ISO 6579:1993 si riferisce ad un volume complessivo di 1110 ml. La formulazione Biolife così come riportata, è riferita a 1 litro di acqua distillata, impiega ingredienti anidri al fine di una migliore conservazione della polvere e corrisponde a quanto prescritto dalla norma ISO 6579:1993. Il terreno Rappaport Vassiliadis Broth è un brodo per l arricchimento selettivo delle salmonelle in campioni alimentari, ambientali e clinici. Il terreno è indicato da ISO 6579:1993 per l arricchimento di campioni alimentari a 42 C per l isolamento di Salmonella, abbinato ad un pre-arricchimento non selettivo in Buffered Peptone Water e ad un arricchimento selettivo a 37 C in Selenite Cystine Broth. Il Rapporto ISTISAN 96/35 indica lo schema seguente per l arricchimento selettivo di Salmonella negli alimenti: - Alimenti non normati: RV (42 C) + Selenite Cystine Broth (37 C) - Latte e derivati: MK (42 C) + Selenite Cystine Broth (37 C) - Uova fresche : RV (42 C) + MK (42 C) - Molluschi : MSRV (42 ) Il Rappaport Vassiliadis Broth presenta una spiccata attività inibitoria verso la flora saprofita ed una buona capacità di stimolare la crescita delle salmonelle essenzialmente per i quattro motivi elencati da Van Schothorst: a - capacità delle salmonelle di sopravvivere all alta pressione osmotica data dalla concentrazione elevata del magnesio cloruro; b -capacità delle salmonelle di crescere a ph relativamente bassi; c -resistenza al verde malachite; d -richieste nutrizionali modeste. Una vasta rassegna dei lavori scientifici effettuati sul Rappaport Vassiliadis Medium è stata pubblicata da Vassiliadis nel BIBLIOGRAFIA Vassiliadis,P. (1983) The Rappaport Vassiliadis enrichment Broth for the isolation of salmonellas: an overview. J. App. Baci. 54, 69. Vassiliadis, P., Pateraki, E., Papiconomou, N., Papadakis, J. and Trichopoulos, D. (1976) Nouveau procède d enrichissement de salmonella. Ann. Microb. lrist, Pasteur 127 B, 195. Vassiliadis, P., Trichopoulos, D., Kalandidi, A., Xirochaki, E. (1978) lsolation of salmonellas from sewage with a new procedure of enrichement. J. App. Baci. 44, Vassiliadis, P., Trichopoulos, D., Kalapothaki, V., Sorié, C.H. (1981) lsolation of salmonella with the use of 100 ml of the R10 modification of Rappaport s enrichment medium. J. Hyg. Camb. 87, CONFEZIONI Terreno in polvere Rappaport Vassiliadis (RV) Broth, 500 g (18,8 l) Rappaport Vassiliadis (RV) Broth, 5000 g (188 l) Terreno pronto all uso Rappaport Vassiliadis (RV) Broth, 6 flaconi da 100 ml pronti per l uso Rappaport Vassiliadis (RV) Broth, 20x10 ml provette pronte per l uso Biolife Italiana Srl Pagina 14 di 33

15 FORMULA TIPICA (G/L) Peptocomplex 5 Sali biliari 1 Calcio carbonato 10 Sodio tiosolfato 30 TETRATHIONATE BROTH BASE Brodo d arricchimento per Salmonella. PREPARAZIONE Sospendere 46 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione e raffreddare a 45 C. Addizionare 20 ml di una soluzione preparata sciogliendo 6 g di iodio e 5 g di potassio ioduro in 20 ml di acqua distillata (Jodine Solution cat. n ). Se si desidera, aggiungere anche 10 ml di una soluzione di verde brillante 0,1% (Brilliant Green 0,1% Solution cat. n ). Mescolare bene e distribuire in provette sterili in ragione di 10 ml per provetta. Si raccomanda di non riscaldare il terreno dopo che è stata aggiunta la soluzione iodurata. DESCRIZIONE Tetrathionate Broth Base, addizionato di una soluzione iodurata, è un terreno d arricchimento per Salmonella typhi e Salmonella spp. dalle feci, urine, acque, alimenti e altri campioni sospetti di essere contaminati da questi microrganismi. L uso di Tetrathionate Broth Base per la coltivazione di Salmonella fu descritto da Mueller; la modificazione della formula originale apportata da Kauffmann con l aggiunta dei sali biliari e del verde brillante, aumenta marcatamente la percentuale di risultati positivi nell isolamento di Salmonella. La soluzione iodurata permette un arricchimento selettivo di Salmonella; i sali biliari sono incorporati per ritardare la crescita degli altri batteri Gram negativi e per inibire la crescita dei Gram positivi. La formulazione del terreno Biolife è in accordo con quanto indicato dai metodi USA: APHA, AOAC, USP. BIBLIOGRAFIA U.S. Pharmacopoeia 24, NF 19 (2000) FDA (1995) Bacteriological Analytical Manual, 8 th ed. Revision A, Published by AOAC International.. CONFEZIONE Tetrathionate Broth Base, 500 g (10.9 l) Biolife Italiana Srl Pagina 15 di 33

16 XYLOSE LYSINE DESOXYCHOLATE (XLD) AGAR Terreno selettivo e differenziale in polvere per l isolamento di Salmonella e Shigella XLD Agar: colonie di Salmonella spp (nere) e di E.aerogenes (gialle) FORMULA TIPICA (g/l) Xilosio 3.50 L-lisina 5.00 Lattosio 7.50 Saccarosio 7.50 Sodio cloruro 5.00 Estratto di lievito 3.00 Sodio desossicolato 2.50 Sodio tiosolfato 6.80 Fe-Ammonio citrato 0.80 Rosso fenolo 0.08 Agar TERRENO IN POLVERE: PREPARAZIONE Sospendere 56.5 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, raffreddare a 50 C e trasferire in piastre sterili. Non eccedere nel riscaldamento del terreno e non autoclavare. Il prodotto si presenta come una polvere omogenea, fine, di colore rosso-arancio. L aspetto del terreno in piastra è rosso limpido. ph finale a 25 C: 7.4 ± 0.2 DESCRIZIONE Xylose Lysine Desoxycholate Agar è un terreno selettivo e differenziale usato per l isolamento degli enterobatteri patogeni; l XLD è il terreno d elezione per l isolamento di Shigella. Il terreno è preparato in accordo con la formula originale descritta da Taylor e secondo le indicazioni di USP ed EP. XLD Agar è raccomandato insieme al Bismuth Sulphite Agar (cat. n ) ed al Brilliant Green Agar (cat. N ) da USP. Su XLD Agar si ottiene una differenziazione degli enterobatteri sulla base della fermentazione dello xilosio, della decarbossilazione della lisina e della produzione di idrogeno solforato a partire dal sodio tiosolfato. Il sodio desossicolato inibisce la crescita dei microrganismi Gram positivi, il rosso fenolo è presente come indicatore di ph, il ferro ammonio citrato come indicatore della produzione di idrogeno solforato. I microrganismi appartenenti al genere Shigella non fermentano lo xilosio, non producono acidificazione del terreno e coltivano quindi su XLD con colonie rosse. Salmonella fermenta lo xilosio con acidificazione del mezzo e decarbossila la lisina con conseguente inversione del ph del terreno a valori alcalini; ad eccezione di alcuni specie H2S negative (Salmonella paratyphi A, Salmonella cholerae-suis, ecc.), Salmonella possiede anche l attività tiosolfato reduttasica, quindi su XLD coltiva con colonie rosse con centro nero, per la precipitazione del ferro solfuro. Biolife Italiana Srl Pagina 16 di 33

17 Il lattosio ed il saccarosio sono presenti nel terreno per produrre un eccesso di acido e differenziare quindi Salmonella dai coliformi lisina-decarbossilasi positivi. Su Xylose Lysine Desoxycholate Agar Salmonella arizonae coltiva con le stesse caratteristiche di Salmonella spp.; Proteus inconstans e le salmonelle H 2 S negative con le stesse caratteristiche di Shigella. Alcuni enterobatteri non patogeni (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Citrobacter) sono H 2 S positivi ma non decarbossilano la lisina; il mantenimento di un ph acido impedisce la precipitazione del ferro solfuro e l annerimento delle colonie. Solo raramente Proteus mirabilis coltiva con piccole colonie con centro nero che, comunque, sono facilmente distinguibili da quelle prodotte da Salmonella, larghe e con grosso centro nero. Proteus rettgeri e Proteus morgani non producendo idrogeno solforato e non fermentando lo xilosio, coltivano su XLD con colonie rosse simili a quelle di Shigella. Escherichia ed Enterobacter fermentano il lattosio e coltivano con colonie gialle. BIBLIOGRAFIA European Pharmacopoeia, 3rd Edition, 2001 Supplement. NCCLS document M22-A2, Quality Assurance for Commercially prepared Microbiological Culture Media-2 nd ed.; Approved Standard. Taylor, W.l. (1965) - Isolation of Shigella I. Xylose Lysine Agars, New Media for Isolation of Enteric Pathogens.Techical Bulletin of Registry of Medical Technology, 35, Taylor, W.l. & Harvin, B. (1965) - Isolation of Shigella III. Comparison of new and traditional media with stool speciemens. Technical Bulletin of Registry Technology, 37, U.S. Pharmaopoeia 24, NF 19 (2000) CONFEZIONI Terreno in polvere XLD Agar, 500 g (8.8 l) XLD Agar, 5 kg (88 l) Il terreno è disponibile anche pronto in piastra XLD Agar, 20 piastre, diametro 90 mm CHROMOGENIC SALMONELLA AGAR BASE Biolife Italiana Srl Pagina 17 di 33

18 SALMONELLA SELECTIVE SUPPLEMENTS Terreno in polvere e supplemento selettivo, per l isolamento e l identificazione di Salmonella spp. inclusa S.typhi CSA: piastra di sinistra S.enteritidis, piastra di destra Enterobacter aeroogenes FORMULE TIPICHE (G/L) Chromogenic salmonella Agar Peptone 10,0 Miscela di inibitori 12,0 Miscela di cromogeni 0,9 Agar 15,0 Salmonella Selective Supplement, Vial A (per fiala) Emulsionanti 5,7 ml Salmonella Selective Supplement, Vial B (per fiala) Cefsulodina 2,5 mg PREPARAZIONE Sospendere 19 g di terreno in 500 ml di acqua distillata fredda; addizionare il contenuto di un flacone di Salmonella Selective Supplement, Vial A (cod ). Portare ad ebollizione sotto agitazione ed autoclavare a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a circa 50 C ed aggiungere il contenuto di una fiala di Salmonella Selective Supplement, Vial B (cod ), ricostituito con 2 ml di acqua distillata sterile. Mescolare con cura e distribuire in piastre di Petri. ph 7,2 ± 0,2 DESCRIZIONE Chromogenic Salmonella Agar è un terreno selettivo e diagnostico, adatto per l isolamento e l identificazione di Salmonella spp., incluso S.typhi, da campioni clinici ed alimentari. La selettivittà del terreno è garantita da una miscela di sostanze inibenti comprendente una cefalosporina attiva soprattutto nella soppressione della crescita di Pseudomonas spp., da sali biliari, attivi nella soppressione dei batteri Gram positivi e di alcuni Gram negativi, Tergitol 4, inibitore soprattutto di Proteus spp. La differenziazione tra i ceppi di salmonella e di non-salmonella è ottenuta attraverso: la presenza nel terreno di un substrato cromogenico sul quale agisce una esterasi specifica di Salmonella con liberazione di un metabolita color rosso magenta. la presenza di un derivato cromogenico glucopiranosidico sul quale agisce la ß-glucosidasi con liberazione di un metabolita color verde-blu. Il sistema selettivo/differenziale del terreno consente di determinare anche i rari ceppi di Salmonella fermentanti il lattosio che sui terreni tradizionali e su altri terreni cromogenici non sono evidenziabili. Il terreno consente l isolamento e l identificazione presuntiva anche di S.typhi. Microrganismo Salmonella spp. Salmonella spp. lac + Caratteristiche colturali buona crescita colonie color rosso-viola buona crescita colonie color rosso-viola Biolife Italiana Srl Pagina 18 di 33

19 Salmonella typhi E.coli Enterobacter spp. Klebsiella spp. Pseudomonas spp Proteus spp. chiaro Batteri Gram positivi buona crescita colonie color rosso-viola crescita scarsa con colonie incolori crescita con colonie verde-blu crescita scarsa con colonie verde-blu crescita inibita crescita scarsa con colonie marrone crescita inibita Il terreno Chromogenic Salmonella Agar consente di determinare Salmonella spp, con elevata sensibilità, per cui tutte le piastre che non presentano colonie tipiche possono essere eliminate. Le piastre con crescite caratteristiche (rosso-viola) devono essere sottoposte ai test biochimici e sierologici di conferma. In rari casi sul terreno coltivano Pseudomonas ed Aeromonas con colonie rosso-magenta, differenziabili da Salmonella con il test dell ossidasi. CONFEZIONI Terreno in polvere Chromogenic Salmonella Agar Base 500 g (13,2 l) Supplemento Salmonella Selective Supplements 5+5 fiale, ciascuna per 500 ml di terreno Il terreno è disponibile anche in piastre pronte Chromogenic Salmonella Agar 20 piastre BRILLIANT GREEN AGAR MODIFIED Terreno di Edel e Kampelmacher per l isolamento di Salmonella spp. dagli alimenti. Biolife Italiana Srl Pagina 19 di 33

20 FORMULA TIPICA (g/l) Estratto di carne Peptone Estratto di lievito Sodio fosfato bibasico Sodio fosfato monobasico Lattosio Saccarosio Verde brillante Rosso fenolo Agar Colonie di Salmonella spp. (rosse) e di E.coli (gialle) PREPARAZIONE Sospendere 52.7 g in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino ad ebollizione sotto agitazione. Non autoclavare. ph finale 6.9 ± 0.1 DESCRIZIONE Brilliant Green Agar Modified è preparato in accordo alla formulazione di Edel e Kampelmacher ed era indicato dal metodo ISO 6579 del 1993 per la determinazione di Salmonella negli alimenti. Il terreno può essere impiegato anche sui campioni clinici per l isolamento di Salmonella spp. I vantaggi di questo terreno rispetto alla formulazione classica sono: una maggior inibizione di E. coli, Proteus e Pseudomonas. La normativa generale per gli alimenti descritta da ISO 6579:1993 prevede un pre-arricchimento non selettivo del campione in Buffered Peptone Water, ed un arricchimento selettivo in Rappaport Vassiliadis Broth ed in Selenite Cystine Broth, il primo incubato a 42 C per 24 ore, il secondo a C per ore. Le crescite nei due brodi selettivi sono trapiantate, per ciascun brodo, su due terreni in piastra: il primo è indicato dalla norma ISO nel Brilliant Green Agar Modified, il secondo è lasciato a discrezione del laboratorio. BIBLIOGRAFIA Edel W. and Kampelmacher E.H.(1968) Bull. WHO, 39 (3), 487 ISO 6579: General Guidance on methods for the detection of Salmonella ISO 6785: Milk and milk products - Detection of Salmonella, CONFEZIONI Terreno in polvere Brilliant Green Agar Modified, 500 g (9.5 l) Terreno pronto all uso Brilliant Green Agar (Edel Kampelmacher) 20 piastre Biolife Italiana Srl Pagina 20 di 33

21 HEKTOEN ENTERIC AGAR Terreno selettivo e differenziale in polvere e pronto all uso in piastra e flacone per l isolamento di salmonelle e shigelle HEA: colonie di Salmonella (colore nero) e di E.coli (color salmone) FORMULA TIPICA (g/l) Triptosio Estratto di lievito Sali biliari n Lattosio Saccarosio Salicina Sodio cloruro Sodio tiosolfato Fe-Ammonio citrato Agar Blu di bromotimolo Fucsina acida PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 76.6 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, lasciar bollire 1-2 minuti e trasferire in piastre sterili. Non autoclavare. ph finale 7.6 ± 0.2. PREPARAZIONE DEL TERRENO IN FLACONE In un bagnomaria termoregolato a 100 C introdurre i flaconi e riscaldare fino ad ebollizione ed a dissoluzione completa. Raffreddare a C e versare in piastre sterili. ph finale 7.6 ± 0.2. DESCRIZIONE Hektoen Enteric Agar è un terreno selettivo per l isolamento e la differenziazione della flora intestinale Gram-negativa, preparato secondo la formula di King e Metzger. Il terreno contiene, oltre ad una miscela di peptoni: - carboidrati: lattosio, saccarosio e salicina; - indicatori di ph: blu bromotimolo e fucsina acida; - agenti selettivi: sali biliari n 3 - indicatori di H 2 S: sodio tiosolfato e ferro (ico) ammonio citrato. Il terreno permette di distinguere facilmente la flora che fermenta lattosio, saccarosio e salicina, da quella che non fermenta tali zuccheri: King e Metzger affermano che Salmonella arizonae si comporta come non fermentante. Con l impiego dell Hektoen Enteric Agar è possibile anche una primaria differenziazione, a livello colturale, tra Salmonella e Shigella. Nella tabella sottostante sono indicate le caratteristiche colturali di alcuni microrganismi su Hektoen Enteric Agar dopo incubazione per 24 ore a 37 C. Biolife Italiana Srl Pagina 21 di 33

22 Microrganismo Salmonella spp. Salmonella typhi Shigella spp. E.coli Enterobacter spp. Klebsiella spp. Pseudomonas spp Proteus spp. saccarosio/salicina fermentanti Proteus spp. saccarosio/salicina non fermentanti Batteri Gram positivi Caratteristiche colturali (HEA) colonie verde blu con o senza centro nero colonie verde blu senza centro nero colonie verde chiaro, il terreno non vira al blu crescita scarsa, colonie rosso salmone colonie rosso salmone colonie rosso salmone colonie incolori tendenti al verde colonie rosso salmone colonie verde blu con o senza centro nero crescita inibita King e Metzger hanno sperimentato tale terreno, in paragone all SS Agar e al Levine EMB Blue Agar, su circa campioni di feci: sia in isolamento primario che dopo arricchimento in brodo selenito; l Hektoen Enteric Agar ha dato risultati migliori dei terreni di confronto, soprattutto per quanto riguarda l isolamento delle shigelle. Tali migliori risultati sono probabilmente da attribuire alla scarsa tossicità del sistema indicatore di ph e delle sostanze selettive oltre che alla quantità relativamente abbondante di peptoni e carboidrati presenti nel terreno. L Hektoen Enteric Agar Biolife è stato impiegato da Silvia King per l isolamento di salmonelle e shigelle dalle feci, con risultati ottimali. BIBLIOGRAFIA King S. & Metzger W.L (1968) - A new plating medium for the isolation of enteric pathogens. 1) Hektoen Enteric Agar. Appl. Microbiol., 16, King S. & Metzger, W.l. (1968) - A new plating medium for the isolation of enteric pathogens. II) Comparison of Hektoen Enteric Agar with SS and EMB Agar, Appl. Microbiol. 16, King, S. (1968) - Comunicazione personale Taylor, W.l. (1965) - Isolation of Shigellae. I) Xylose Lysine Agar; new media for isolation of enteric pathogens. Am. J. Clin. Path., 44, NCCLS document M22-A2, Quality Assurance for Commercially prepared Microbiological Culture Media-2 nd ed.; Approved Standard. CONFEZIONI Terreno in polvere Hektoen Enteric Agar, 500g (6.52 l) Hektoen Enteric Agar, 5 Kg (65,2 l) Terreno pronto all uso Hektoen Enteric Agar, 20 piastre Hektoen Enteric Agar, 6 flaconi da 100 ml Hektoen Enteric Agar, 6 flaconi da 200 ml Biolife Italiana Srl Pagina 22 di 33

23 SS AGAR Terreno selettivo e differenziale in polvere e pronto all uso in piastra e flacone per l isolamento di Salmonella SS Agar: colonie di Salmonella arizonae FORMULA TIPICA(G/l) Estratto di carne Peptocomplex Lattosio Sali biliari n Sodio tiosolfato Sodio citrato Ferro citrato Rosso neutro Agar Verde brillante mg PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 60 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda; portare ad ebollizione sotto agitazione e distribuire in piastre sterili. Si raccomanda di non eccedere nel riscaldamento del terreno. Non autoclavare PREPARAZIONE DEL TERRENO IN FLACONE Scaldare in bagnomaria a 100 C portando ad ebollizione il terreno in flacone agitando di tanto in tanto. Raffreddare a circa 50 C e trasferire in piastre Petri sterili. ph finale 7.0 ± 0.2. DESCRIZIONE ED IMPIEGO SS Agar è un terreno selettivo e differenziale, indicato per l isolamento di Salmonella dalle feci e da campioni di altra origine contaminati da questi microrganismi. Il terreno è preparato in accordo con la formula raccomandata dall APHA. SS Agar offre un ottima distinzione degli enterobatteri lattosio non fermentanti da quelli lattosio fermentanti la cui crescita è consentita dagli inibitori presenti. Il terreno fu originariamente descritto come mezzo selettivo adatto all isolamento di Salmonella e Shigella; gli studi di molti autori, rivolti ad evidenziare l efficacia dell SS Agar nell isolamento di Shigella, mostrano come l SS Agar sia poco indicato per questo genere di microrganismi e come vi siano altri terreni che offrono prestazioni superiori (XLD Agar, HEA). Il sodio citrato, i sali biliari e il verde brillante dell SS Agar inibiscono la crescita dei microrganismi Gram positivi e di alcuni enterobatteri non patogeni. Il lattosio è inserito nel terreno come carboidrato fermentabile per differenziare i microrganismi lattosio fermentanti da quelli non fermentanti. Il rosso neutro è presente come indicatore di ph. Quando il mezzo Biolife Italiana Srl Pagina 23 di 33

24 diventa acido per la fermentazione del lattosio, vi è una precipitazione dei sali biliari e le colonie assumono il colore dell indicatore. Dopo ore di incubazione a 37 C, Salmonella e altri microrganismi lattosio non fermentanti coltivano su SS Agar con colonie piccole, opache, trasparenti o traslucide, prive di colore. Alcune specie dei generi Proteus e Salmonella presentano colonie con centro nero; ciò è dovuto alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di idrogeno solforato a partire dal sodio tiosolfato presente nel terreno. Nell isolamento degli enterobatteri patogeni dalle feci, tutti gli autori raccomandano di usare combinazioni di terreni selettivi e differenziali allo scopo di aumentare le possibilità di mettere in evidenza questi microrganismi, soprattutto se presenti in numero ridotto. BIBLIOGRAFIA Isenberg, H.D., Kominos, S. & Siegel, M. (1969). Appl. Micriobiol. 18, NCCLS document M22-A2, Quality Assurance for Commercially prepared Microbiological Culture Media-2 nd ed.; Approved Standard. Rahaman, M.N., Hug, I. & Pajan Dey, C. (1975) J. Inf, Dis., 131, CONFEZIONI Terreno in polvere SS Agar, 500 g (8.3 l) SS Agar, 5 kg (83 l) SS Agar è disponibile nei seguenti formati pronti per l uso SS Agar, 20 piastre pronte per l uso SS Agar, 6 flaconi da 100 ml Biolife Italiana Srl Pagina 24 di 33

25 RAPPAPORT VASSILIADISSEMI-SOLID MEDIUM MODIFIED (MSRV) NOVOBIOCIN ANTIMICROBIC SUPPLEMENT Terreno di base e supplemento selettivo per la determinazione dei ceppi mobili di Salmonella negli alimenti, nei campioni ambientali, nel cioccolato e nei prodotti a base di cacao FORMULE TIPICHE Rappaport Vassiliadis Semi-Solid Medium Modified (MSRV) (g/l) Triptosio Idrolisato acido di caseina Sodio cloruro Potassio fosfato monobasico Magnesio cloruro anidro Verde malachite ossalato Agar Novobiocin Antimicrobic Supplement ( fiala per 500 ml) Novobiocina 10 mg PREPARAZIONE Sospendere 15.8 g di MSRV Medium in 500 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione. Non autoclavare. Raffreddare a 50 C ed addizionare, con le precauzioni dell asepsi, il contenuto di una fiala di Novobiocin Antimicrobic Supplement, ricostituita con 5 ml di acqua distillata sterile. Mescolare bene e distribuire in piastre Petri sterili. Lasciare asciugare le piastre all aria per 1 ora. Il terreno di base è molto igroscopico. Tenere il flacone ben chiuso in ambiente non umido; maneggiare la polvere usando guanti e mascherina. ph finale 5.2 ± 0.1 DESCRIZIONE Il terreno Rappaport Vassiliadis Semi-Solid Medium Modified (MSRV) addizionato con Novobiocin Antimicrobic Supplement consente la determinazione, con metodo sensibile, di Salmonella in alimenti contaminati o in altri campioni quando la ricerca sia mirata ai ceppi mobili di Salmonella. Il terreno è raccomandato da IOCC/ISCM per la determinazione di Salmonella nel cacao e nel cioccolato. Il terreno è indicato dal Rapporto ISTISAN 96/35 per la subcoltura del brodo di pre-arricchimento per la ricerca di Salmonella nei molluschi. L uso di questo terreno preparato in accordo alla formulazione descritta da De Smedt e coll. (1986), consente di ottenere risultati migliori nell isolamento di Salmonella (De Smedt e coll. 1991, Perales e coll. 1991), rispetto ai metodi tradizionali. Il principio del metodo si basa sulla capacità delle salmonelle di crescere e di migrare nel gel semi-solido dal punto d inoculazione, più rapidamente rispetto ad altri microrganismi competitivi, producendo così un arricchimento e una differenziazione tra campioni che inducono la migrazione e campioni che non sviluppano questo fenomeno. Il terreno non risulta idoneo alla ricerca dei ceppi non mobili di Salmonella che si presentano comunque con incidenza molto bassa (inferiore allo 0.1%). Se si sospetta la presenza di ceppi non mobili si consiglia di seguire una metodica tradizionale con prearricchimento ed arricchimento selettivo. Il terreno risulta essere selettivo per la presenza concomitante di tre agenti selettivi: verde malachite, magnesio cloruro e novobiocina. IMPIEGO - Allestire il pre-arricchimento del campione in Buffered Peptone Water o in Skim Milk addizionato con 2 ml/l di soluzione all 1% di verde brillante (25 g di campione ml di brodo di pre-arricchimento). - Dopo 20 ore di incubazione a 37 C trasferire 3 gocce (circa 0.1 ml) in zone separate su piastra di MSRV ed incubare a 42 C per 24 ore con le piastre non capovolte. Biolife Italiana Srl Pagina 25 di 33