Biologia dei crostacei e ricerca scientifica nel contrasto alla diffusione di specie aliene.

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1 Biologia dei crostacei e ricerca scientifica nel contrasto alla diffusione di specie aliene.

2 i Crostacei sp. Dimensioni variabili: da 0,1 mm (parassiti) a 4 m (granchi giapponesi)

3 Probabilmente I Crostacei costituiscono insieme agli Insetti un gruppo monofiletico: I PANCROSTACEI ( specie) Vedono 12 colori e anche la luce polarizzata (sole)

4 Successo/diffusione dovuto a: - esoscheletro (protezione) - appendici articolate (difesapredazione) Esoscheletro: scheletro esterno che funge da struttura di sostegno perché, essendo costituito da chitina, è rigido. Cratteristiche -cuticola pluristratificata -sclerificazione (produzione e accumulo di chitina) -calcificazione (calcio funge da collante e conferisce ancora più rigidità)

5 Tempo Crescere dentro una scatola, mute successive per crescere Dimensioni corporee Crescita artropodiale reale tissutale, tessuti interni molli Crescita artropodiale apparente nel periodo muta Crescita non artropodiale, crescita continua (uomo)

6 GASTROLITI bottoncini di carbonato di calcio che si trovano ai lati dello stomaco Il calcio è recuperato dall esoscheletro, in quanto in acqua dolce può essere un problema reperirlo Subito dopo la muta i gastroliti collassano nello stomaco così il calcio è riassorbito ed è disponibile per l indurimento del nuovo esoscheletro.

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8 Anatomia dei decapodi Crostacei Malacostraci (letteralmente con corazza molle ) Decapodi (letteralmente con 10 piedi ) Pleocyemata (letteralmente che portano le uova sulle appendici addominali ) CEFALOTORACE PLEON Carapace: si estende fino alla base delle zampe lasicando 2 cavità laterali tra sé e la parete del corpo dove sono situate le branchie. L acqua entra dalla base zampe attraverso cavità branchiali ed esce attravrso le mascelle. CARAPACE TELSON

9 Massillipedi: prime 3 appendici anteriori del cefalotorace e sono usate per l assunzione di cibo. Pereopodi: le 5 paia di appendici dopo massilipedi e sono le zampe; il primo specializzato in forma chele Pleopodi: appendici del pleon. Le prime 2 paia nel maschio formano il petasma che serve per il trasferimento delle spermatofore sulle femmine durante l accoppiamento. Nelle femmine i pleopodi sono tutti uguali e sono usati per farvi aderire le uova dopo la deposizione. PEREOPODI PETASMA PLEOPODI Dimorfismo sessuale

10 FEMMINA MASCHIO

11 Gamberi acqua dolce: adattamenti - uova molto più grandi (fino 4 mm diametro) - non ci sono fasi planctoniche perché con l acqua corrente le larve sarebbero tutte trasportate verso la foce del fiume - giovanili simili agli adulti e rimangono attaccati ai pleopodi della madre, inizialmente con un filamento formato dai residui di cuticola del guscio poi con le chele

12 Austropotamobius pallipes complex Acque correnti fino 1400 slm sulle Alpi Acque poco inquinate con un sufficiente contenuto di calcio Abitudini notturne Crescita lenta 9 cm di lunghezza e 40 g di peso in 5 anni Maturità sessuale 3 anno di vita (dipende temperatura, altitudine e latitudine) Uova da 3,6 a 4 mm di diametro e il numero varia da 20 a 120 circa Larve alla schiusa misurano 6-8 mm di lunghezza totale, rimangono legate all addome della madre fino alla seconda muta

13 Procambarus clarkii Originaria Stati Uniti centro-meridionali (Louisiana) Vive anche in acque inquinate, con ampi range temperatura, acque salmastre, livelli ossigeno bassi Acque calde, ferme con periodici cicli di secche, nelle quali sopravvive scavando tane negli argini (anche 2 m) Vita breve fino 18 mesi Crescita veloce con maturità sessuale a lunghezza variabile tra 6-12 cm Uova piccole 0,4 mm I giovanili rimangono con la madre, nella tana, fino alla seconda muta

14 Procambarus clarkii VS Austropotamobius pallipes complex capacità di camminare fuori dall acqua per km si infossa nel fango durante i periodi di siccità specie a strategia R (uova più piccole in numero maggiore, tassi riproduttivi elevati, crescita rapida) multi spawners, si riproducono più volte in un anno anche se dipende dalla temperatura tollera condizioni ambientali avverseinquinamento portatore della peste del gambero provocata dal fungo Aphanomyces astaci non è in grado se si secca muore specie a strategia K (uova più grandi, cure parentali, crescita lenta) si riproducono una sola volta vive in acque pulite (indicatore di buona qualità delle acque) sensibile alla peste del gambero

15 Prima popolazione riproduttiva Piemonte 1989 in Friuli Venezia Giulia 2009 Procambarus clarkii Austropotamobius pallipes Introdotto in Spagna 1972 e in Italia nel 1987 Per allevamento in acquacoltura Procambarus clarkii sfuggito

16 La sua diffusione porta a gravi danni 1 Perdita biodiversità riduzione e scomparsa di specie autoctone es. Austropotamobius pallipes 2 3 Danni aree agricole Diffusione peste del gambero (Aphanomyces astaci) modifiche rete trofica crollo argini, dighe, maggiore torbidità acqua (1,2 milioni di euro 1 anno Lazio per argini) mortale per le specie autoctone 4 Rischio per la salute umana perché accumula sostanze tossiche IUCN ha certificato che Procambarus clarkii è tra le specie invasive più pericolose al mondo

17 Sviluppo di metodologie innovative per l eradicazione di Procambarus clarkii 1- esche feromoniche 2-sterilizzazione somministrando cibo con l ormone gonadoinibitorio (GIH) GIH

18 FEROMONI Sostanze chimiche prodotte dalle ghiandole a rosetta associate alla vescica urinaria. nefropori

19 FEROMONI 1 classificazione: - scatenanti o releasers, che agiscono direttamente sul sistema nervoso centrale - innescanti o primers, agiscono alterando lo stato fisiologico dell animale ricevente rendendolo sensibile a stimoli accessori specifici 2 classificazione: - di distanza sostanze polari e solubili che sono diffuse nell ambiente acquatico - contatto sostanze relativamente insolubili che rimangono sulla superficie del corpo

20 FEROMONI In Procambarus clarkii queste sostanze sono rilasciate dalle femmine sessualmente mature per attrarre i maschi ricettivi (Stebbing et al. 2003). Il rilascio avviene tramite l URINA Vantaggi nell uso di femmine ricettive come esche: - catturati > numero di maschi rispetto alle femmine - attirati maschi di taglia minore dimostrato attraverso esperimenti con sassi, spugne e altri maschi (Ekerholm e Hallberg 2005) Si vorrebbero sintetizzare in laboratorio gli stessi feromoni prodotti dal gambero rosso per creare esche feromoniche specie-specifiche.

21 FEROMONI Creata una libreria in phage-display per identificare composti con un azione attrattiva per Procambarus clarkii. Da nefroporo e green-gland di femmine attrattive estratti a Firenze è stato ottenuto mrna polia. Libreria di 7,6*10^6 cloni Frammentazione Retrotrascrizione Amplificazione BP-ricombinazione (clonaggio nel vettore pdonr221; sistema gateway) Elettroporazione

22 La libreria è stata raccolta e 46 cloni scelti casualmente sono stati sequenziati. I frammenti inseriti sono sequenze di P. clarkii: si procede con il subclonaggio in un vettore ottimizzato per la produzione di fagi. E stata ottenuta una libreria in phage-display di 1,6*10^7 cloni.

23 Stiamo facendo delle selezioni utilizzando l antennula di maschi di P. clarkii, in quanto sembra che proprio qui siano presenti i recettori per i feromoni (Carr et al. 1987)

24 Con i peptidi più attrattivi, individuati dalla selezione, abbiamo creato dei pool che invieremo all Università di Firenze dove, con esperimenti comportamentali, vedremo quali pool risulteranno maggiormente attrattivi su individui vivi per poi creare le esche feromoniche speciespecifiche.

25 Matrici di alginato per la diffusione lenta delle molecole in acqua Individuate le molecole attrattive per i maschi è necessario inserirle in una matrice di gel che ne permetta un rilascio graduale per diverse ore in acqua per massimizzare le catture. Si è deciso di usare una matrice di alginato per la sua particolare proprietà di gelificare (Smidsrod e Skjak-Braek, 1990) in presenza di cloruro di calcio. Non avendo a disposizione i pool fagici attrattivi è stato usato un omogenato di mangime per la validazione del sistema. La soluzione di alginato e mangime è colata in una piastra petri di 8,5 cm di diametro. Sul coperchio della piastra sono praticati dei fori di 4-5 mm in modo tale che, una volta immersa in acqua, possa rilasciare le molecole attrattive. La matrice viene fatta solidificare per 24 ore e successivamente si conserva sigillata a 4 C.

26 Esperimento Per ogni esperimento sono stati usati 5 esemplari maschi, posizionati sul lato destro dell'acquario. Nel lato sinistro sono state poste 3 piastre petri contenenti l'esca di alginato con cibo omogeneizzato 2 esche neutre contenenti sassolini e cilindretti di ceramica. Una volta inseriti esche e gamberi sono state eseguite le riprese per 4 ore. Tutti i gamberi hanno raggiunto l'esca tra il 4 e il 33 minuto dall'inizio dell'esperimento ignorando totalmente le due esche neutre. É stato inoltre osservato che se i gamberi uscivano dalla zona con l esca entro un arco temporale medio di 32 minuti rientravano, attratti nuovamente dal cibo. Viene così confermata la capacità della matrice di alginato di rilasciare molecole attrattive per almeno 4 ore.

27 ALGINATO - estratto da alghe brune (es. Laminaria hyperbore e Ascophyllum nodosum) - usato nell industria alimentare come addensante, emulsionante e stabilizzante - non è tossico ed è biodegradabile quando somministrato per via orale - utilizzato nella cosiddetta cucina molecolare, ad esempio per creare il caviale finto Laminaria hyperbore Ascophyllum nodosum

28 Esempi utilizzo alginato

29 Ormone gonado inibitorio - GIH Neuropeptide prodotto dal complesso organo X - ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari.

30 Ormone gonado inibitorio - GIH Il GIH inibisce la vitellogenesi nelle femmine e lo sviluppo dei testicoli nei maschi per cui la sua somministrazione, per via orale, potrebbe rendere sterili o almeno abbassare la fecondità degli individui di questa specie. < sforzo per la sterilizzazione degli individui abbattimento costi

31 Ormone gonado inibitorio - GIH Abbiamo creato delle esche per la veicolazione dell ormone Electronic beads generator

32 Ormone gonado inibitorio - GIH Si è deciso di utilizzare il mangime per gamberi piuttosto del fegato perché le beads affondano più facilmente e per eliminare l interferenza con gli enzimi epatici.

33 Messa a punto oral delivery Alginato e GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH GIH Chitosano Alginato mescolato al mangime

34 iano sperimentale chh chh chh chh chh chh 5μg ogni animale

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36 Prelievi ogni ora per circa 12 ore

37 Leggero aumento della glicemia degli animali nutriti beads-chh tra la 3-9 ora Maggiore differenza tra i 2 gruppi alla 10 ora Cosa faremo? test con più chh seguire andamento dopo le 12 ore Questi esperimenti ci permettono di mettere a punto il sistema migliore per somministrare il GIH.

38 Vantaggi dall uso del GIH 1- riduzione dei costi correlati alla cattura e rilascio degli animali al loro ambiente 2- l unico costo è rappresentato dal rilascio di esche di cibo contenenti GIH nei corsi d acqua 3- nel caso di presenza di cross-reattività: P. clarkii A.pallipes complex Rilascio ipotetico del GIH Dicembre-Marzo Periodo riproduttivo Marzo-Luglio Settembre-Ottobre LIFE presentation

39 Grazie per l attenzione