UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1. Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging.

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1 UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1 Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging Lezione 6: Generalità à sul RIA D. Cecchin, F. Bui Dosaggi radioimmunologici? Epoca Pre-RIA: Fino al 1959 circa, il dosaggio di molecole biologiche erano di solito effettuate mediante l analisi chimica (isolamento, purificazione e concentrazione) ed il dosaggio biologico (ad esempio per il dosaggio dell insulina si valutava l ipoglicemia indotta in animali da esperimento resi diabetici ed ipofisectomizzati). Tali metodiche risultavano complesse, costose e poco sensibili. Epoca RIA-IRMA: Nel Rosalyn Yalow (premio nobel per la medicina e fisiologia nel 1977) e Solomon Berson al Veterans Administration Hospital (Bronx) rivoluzionano i dosaggi (in primis dell insulina) introducendo il RIA, una tecnica che unisce la specificita di una reazione immunologica (formazione di un complesso antigene-anticorpo) e la sensibilita di un metodo radiochimico. Subito la tecnica si diffuse per tutti gli ormoni proteici e per altri analiti. Nel 1968 Miles e Hales Proposero una sua variante ovvero l IRMA (dosaggio immunoradiometrico).

2 E nel presente/futuro: epoca post-ria Oltre al dosaggio immunologico isotopico (RIA, IRMA) che qui discuteremo, esiste anche il dosaggio immunologico non isotopico che possiamo distinguere in: senza marcatura (nefelometria) con marcatura alternativa (enzimi, componenti luminescenti, radicali liberi ecc). I metodi isotopici richiedono norme di sicurezza e procedure di marcatura speciali, un tracciante che decade nel tempo, è solo parzialmente automatizzabile ed ha una precisione moderata rispetto ai metodi ottici (o non isotopici). Tuttavia mentre la sensibilita! dei sistemi ottici e! intorno ad 1 ng/ml quella dei metodi isotopici arriva ad 1 pg/ml RIA: Componenti A) ANTICORPO: E! una proteina (della famiglia delle immunoglobuline) prodotta dalla serie linfoide. Si lega ad un antigene responsabile della sua produzione. Deve essere specifico, sensibile e possedere una buona costante di affinita!. Gli anticorpi sono costituiti da due catene pesanti e due catene leggere unite da ponti disolfuro e sono caratterizzate da una regione amino-terminale (costituita da parte delle catene pesanti e parte delle catene leggere) molto variabile e per questo responsabile della specificita! e da una regione carbossi-terminale che ha la stessa sequenza in tutte le immunoglobuline di una stessa classe. Perche! la tecnica RIA funzioni l!anticorpo deve legarsi nello stesso modo (o meglio con la stessa affinita!) all!antigene marcato e non-marcato

3 RIA: Componenti Gli anticorpi maggiormante utilizzati nel RIA sono le IgG La produzione di anticorpi policlonali si ottiene iniettando in un coniglio un antigene che deve essere eterologo ed avere un peso molecolare superiore a 5000 d. Dopo un opportuno intervallo di tempo ed eventuali richiami si salassa il coniglio, si centrifuga il sangue e si ottiene plasma o siero con gli anticorpi desiderati. La produzione degli anticorpi monoclonali invece si ottiene con la tecnica degli ibridomi. (Vedi tecnica IRMA) RIA: Componenti B) ANTIGENE: Sostanza che stimola la produzione di anticorpi (ovvero è l immunogeno). L antigene è, normalmente, la sostanza che deve essere misurata (presente nel siero del paziente ). Tutti gli ormoni proteici possono essere immunogeni. Gli steroidi e le sostanze a basso peso molecolare hanno scarsa capacita immunogena a meno che non si leghino a sostanze piu grandi. C) ANTIGENE MARCATO: E uguale all antigene (o con capacita leganti molto simili. Si noti che e sufficiente che immunologicamente si comporti in modo uguale. L attivita biologica non e importante.) Contiene uno o piu atomi di un isotopo radioattivo.

4 Isotopi utilizzati Sono prodotti a partire da un precursore, generalmente in un ciclotrone, in un reattore nucleare o in un generatore. Gli isotopi piu! utilizzati nelle tecniche radioimmunologiche sono i seguenti: 125 I (T 1/2 60 giorni gamma di KeV). Utilizzato, in genere, per marcare gli aminoacidi tirosina e istidina. 3 H (T 1/ anni beta di 18 KeV) Utilizzato, in genere, per marcare steroidi e farmaci. 57 Co (T 1/2 267 giorni- gamma di 122 KeV) Utilizzato soprattutto per il dosaggio della cobalamina. Marcatura La marcatura dell!antigene si puo! ottenere: 1. Per Sostituzione ovvero scambiando un isotopo stabile dell!antigene con uno radioattivo. 2. Per Aggiunta ovvero incrementando con un isotopo radioattivo la molecola dell!antigene. Uno dei metodi di marcatura piu utilizzati e la IODAZIONE. Possiamo distinguere le tecniche di iodazione diretta, nelle quali il radioiodio (che deve essere presente come catione) è incorporato direttamente nei residui tirosinici della catena proteica, da quelle per coniugazione. In questo ultimo caso nella molecola dell antigene non ci sono residui tirosinici ed allora si attacca, si coniuga, un residuo tirosinico premarcato al residuo aminoterminale dell antigene.

5 Esempi di iodazione Cloramina: La cloramina T ossida lo iodio radioattivo (presente come ioduro di sodio) e lo rende cationico e quindi in grado di legarsi al residuo tirosinico (in genere al posto di un H + ). Si tende a legare un atomo di iodio per molecola e non di piu! per limitare l!autolisi da radiazioni. Iodurazione enzimatica: Un enzima (la lattoperossidasi) viene legata ad una resina. Aggiungendo in soluzione acqua ossigenata e glucossidasi l!enzima e in grado di rendere cationico lo iodio radioattivo e quindi in grado di legarsi ai residui tirosinici. Ossidazione chimica: Si espongono le proteine ad ipoclorito di sodio. E! una metodica meno utilizzata. Elettrolisi: Anche questa e! una metodica poco utilizzata che prevede l!elettrolisi come induttore di marcatura. Marcatura per sostituzione Un altro esempio di marcatura per sostituzione e quella con trizio. Si puo ottenere per sintesi chimica, biologica con precursori marcati o con una reazione di scambio. Quest ultima consiste nello scambio di un atomo tra molecole analoghe. Puo essere uno scambio di tipo: omogeneo ovvero in una stessa fase (come ad esempio una soluzione alcolica. Prevede la dissociazione per cause termiche della molecola e la sua riassociazione Es. AX 1 +BX 2 =A B X 1 X 2 =AX 2 +BX 1 ) eterogeneo ovvero tra fasi diverse (solida/liquida). Una volta marcato si deve controllare la qualita del radiofarmaco con Cromatografia (HPLC - High Pressure Liquid Cromatography), elettroforesi o reazioni antigene anticorpo.

6 Schema generale del RIA Alla base del RIA c!e la reazione di un anticorpo specifico con il suo antigene (marcato e non marcato). Il seguente schema e! una semplificazione della reazione che offre una panoramica sulla tecnica. ANTIGENE NON MARCATO (AG) ANTIGENE MARCATO (AG*) ANTICORPO SPECIFICO (AB) Ka Kd AB+ AG AB+ AG* AB AG AG* FRAZIONE LEGATA FRAZIONE LIBERA Caveats a) La reazione fra anticorpo ed antigene (marcato e non marcato) possiede una costante di associazione (ka) elevata ovvero la reazione tende a proseguire verso destra. In altri termini si formano dei complessi antigene anticorpo molto stabili. b) I complessi anticorpo+antigene (AB+AG e AB+AG*) vengono chiamati frazione legata mentre gli anticorpi (AB) e gli antigeni (AG e AG*) non legati vengono definiti frazione libera. c) L anticorpo non distingue tra antigene marcato e non marcato e quindi, in virtu della legge di azione di massa, l antigene piu concentrato occupa piu siti anticorpali. d) Normalmente la variabile, l incognita della reazione, e l antigene non marcato presente nel siero del paziente. e) Si utilizzano una serie di soluzioni con antigene non marcato in concentrazione nota per costruire una curva di calibrazione (uno standard da usare come riferimento per le misure).

7 Curva di calibrazione: : 1 Si supponga di aggiungere concentrazioni crescenti (note) dell antigene non marcato mantenendo costanti tutte le altre componenti della reazione descritta. CPM [AG] non marcato A concentrazioni basse di antigene non marcato aggiunto sara legato quasi solo antigene marcato. Quindi se elimino la frazione libera e misuro otterrò alti CPM (conteggi per minuto) dovuti alla grande quota di antigene marcato legato all anticorpo. Curva di calibrazione: : 2 CPM [AG] non marcato A concentrazioni intermedie di antigene non marcato aggiunto ci sara una quota paragonabile di antigene marcato e non marcato legato all anticorpo. Di conseguenza i CPM rispetto al caso precedente saranno inferiori.

8 Curva di calibrazione: : 3 CPM [AG] non marcato A concentrazioni elevate di antigene non marcato aggiunto si leghera all anticorpo quasi solo antigene non marcato. Quindi i CPM saranno ulteriormente ridotti rispetto al caso precedente. Si noti allora che maggiore e la concentrazione di antigene non marcato minori sono i CPM che misuro Curva di calibrazione: : 4 CPM A = CPM misurati utilizzando un campione del paziente B = Concentrazione dell antigene (incognita) A B [AG] Dopo numerose misurazioni con antigene non marcato in quantità nota con la procedura illustrata poco sopra ottengo una curva detta di taratura. Riportando la misura dei CPM ottenuti utilizzando un campione del paziente (ovvero con la stessa tecnica descrittta ma con antigene non marcato a concentrazione ignota) sulla curva di taratura posso leggere semplicemente la concentrazione dell antigene che cerco.