RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA IN BIOFILM E SEDIMENTI

Transcript

1 METODO NAZIONALE STANDARD RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA IN BIOFILM E SEDIMENTI W 15 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum. Pagina 1 di 15

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2006). Detection and enumeration of Legionella species in biofilms and sediments. National Standard Method W 15 Emisione 1. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 2 di 15

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE DEFINIZIONI PRINCIPIO CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA SUL CAMPIONE ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA E REAGENTI PROCEDURA SUL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL BIOFILM E SOSPENSIONI DEL SEDIMENTO PRE-TRATTAMENTO E SEMINA DELLE PIASTRE DI AGAR SELETTIVO INUBAZIONE E LETTURA DELLE PIASTRE DI AGAR SELTTIVO CONTEGGIO DELLE COLONIE IDENTIFICAZIONE E TIPIZZAZIONE CALCOLO DEI RISULTATI REFERTO CONTROLLO DI QUALITA TERRENO PROVE DI CONFERMA STRUTTURE DI RIFERIMENTO RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI RICERCA E CONTEGGIO DI LEGIONELLA IN BIOFILM E SEDIMENTI BIBLIOGRAFIA Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 3 di 15

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato W 15 Ricerca e conteggio di specie Legionella in biofilm e sedimenti Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data 2/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no Pagina Sessione(i) interessate Generalità Modifica Aggiornate per includere anche la ISO mentre è in revisione Conferma di specie Legionella Titolo modificato in sospette Legionella e sezione aggiornata per evitare l uso di agar sangue Terreno Aggiunta un indicazione quantitativa Prove di conferma Aggiunto controllo negativo Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 4 di 15

5 RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA IN BIOFILM E SEDIMENTI SCOPO La presente procedura descrive un metodo quantitativo per l isolamento di ceppi di Legionella da biofilm e campioni di sedimento. INTRODUZIONE Generalità Le specie Legionella sono agenti eziologici della legionellosi. Sono batteri che vivono nell acqua, diffusi in natura e sono stati riscontrati nell ambiente idrico in un ampio intervallo di temperature compreso fra 30 C e 40 C 2. La tolleranza nei confronti di temperature relativamente elevate probabilmente consente loro di colonizzare alcuni sistemi idrici artificiali che sono spesso a temperature superiori a quelle ambientali. Le Legionelle sono prevalenti nei sistemi idrici artificiali, e la legionellosi si trasmette per aerosol ed occasionalmente per aspirazione. Le torri di raffreddamento sono spesso coinvolte nelle epidemie acquisite in comunità e, sebbene i sistemi d acqua calda siano comunemente coinvolti nelle epidemie nosocomiali, sono state segnalate numerose altre sorgenti d infezione. I campioni idrici possono essere indagati per le specie Legionella in corso di ricerche epidemiologiche, come compito dell autorità locale, industriale, di un programma di sorveglianza ospedaliera, per la validazione di un nuovo trattamento battericida o per altri motivi di controllo. Pure l HSE 3 raccomanda di routine, almeno trimestralmente, il campionamento delle torri di raffreddamento e quello dei sistemi idrici d acqua fredda e calda se le condizioni di temperatura raccomandate non sono state controllate o sono state disattese o se la condizione del rischio locale ne suggerisca la necessità. Anche negli ambienti ospedalieri il numero delle specie di Legionella è spesso ridotto, raramente supera l 1% del totale della popolazione batterica. Al contrario, il loro numero nel biofim e nei sedimenti può essere molto elevato, ed i campioni possono richiedere la diluizione prima dell analisi. Le procedure descritte si avvalgono della BS 6068 (ISO 11731) 4. Nota: La ISO è ora suddivisa in due parti. L ultima, la Parte 2 (BS - ISO :2004 BS :2004 Water quality - Detection and enumeration of Legionella Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. London: British Standards Institution; 1998) è solo applicabile ad acque disinfettate con conteggio di fondo ridotto ed utilizza la filtrazione seguita dalla deposizione diretta della membrana su un terreno selettivo. La ISO originale è ancora valida ed ora è in revisione. A termine delle revisione sarà definita ISO Part 1. La HPA non ha adottato la ISO Parte 2 come metodo standard proprio, ma continuerà a seguire la ISO Parte 1. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 5 di 15

6 1 DEFINIZIONI Per gli obiettivi di questo metodo la Legionella è definita come un genere di microrganismi Gramnegativi, di solito in grado di crescere in non meno di 2 giorni sull agar BCYE (buffered charcoal yeast extract) contenente L-cisteina ed una sorgente di ferro. Formano colonie spesso bianche, dal porpora al blu, o di colore verde vischio, che possono divenire fluorescenti sotto luce ultravioletta. Osservate con microscopio a bassa risoluzione le colonie assumono aspetto di vetro smerigliato od opalescente. La crescita non si manifesta in assenza di cisteina. 2 PRINCIPIO Si prepara la sospensione di biofilm o del sedimento del campione in un diluente sterile o in acqua. Una quota di questa sospensione non è trattata, una seconda è trattata con acido, una terza è esposta al calore. Le quote trattate e non sono seminate su piastre di agar selettivi per le specie Legionella e poste ad incubare. Al termine dell incubazione, le colonie sviluppate sui terreni selettivi che assumono aspetti caratteristici, sono considerate come specie sospette di Legionella e sono contate. Le colonie delle sospette Legionella sono poste in sottocoltura per verificare la richiesta di L-cisteina. 3 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA 5-14 Adottare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. 3.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE N/D 3.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale l adeguamento alle attuali regolamentazioni della posta e del trasporto. 3.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Sebbene la Legionella appartenga ai microrganismi del Gruppo di Rischio 2, l agitazione e la miscelazione con vortex dei concentrati dovrebbe essere eseguita in una cabina microbiologica di sicurezza in conformità alla EN12469:2000 Biotechnology - Performance criteria for microbiological safety cabinet I contenitori della centrifuga dovrebbero essere aperti all interno di una cabina di sicurezza. Se non si sono manifestate perdite, le provette devono essere rimosse con attenzione per non sospendere di nuovo il deposito. Se si sono verificate perdite, ci si deve cautelare secondo le normali procedure di laboratorio per la sicurezza Le seguenti indicazioni devono essere supplementate con le indicazioni del COSHH locale e con la valutazione del rischio 4 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Biglie di vetro Miscelatore Vortex Cabina microbiologica di sicurezza Bagno ad acqua a 50 C ± 1 C Termostato: 36 C ± 1 C (con umidificatore e preferibilmente 2.5% di CO 2 ) Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 6 di 15

7 Microscopio stereoscopio per piastre con illuminazione incidente obliqua Lampada ultravioletta (lunghezza d onda UV 366 nm) Pipettattori automatici e puntali di pipette sterili in grado di distribuire volumi da ml (opzionali) Pipette (sterili a svuotamento totale) da 10 ml ed 1 ml graduate a volume di 0.1 ml (opzionale) Spatole (sterili) 5 TERRENI DI COLTURA Soluzione salina di Page (opzionale) Cloruro di sodio Solfato di magnesio pentaidrato Cloruro di calcio diidrato Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 120 mg 4 mg 4 mg 142 mg 136 mg 1 L Soluzione di Ringer 1/40 (opzionale) Cloruro di sodio Cloruro di potassio Calcio cloruro, anidro Bicarbonato di sodio Acqua 225 mg 11 mg 12 mg 5 mg 1 L Acqua distillata o deionizzata (opzionale) Tampone acido a doppia concentrazione ph 2.2: Miscelare 39 ml di HCl 0.4 mol/l con 250 ml di soluzione di cloruro di potassio 0.4 mol/l. Aggiustare a ph 2.2 ± 0.2 aggiungendo una soluzione di idrossido di potassio (KOH) 1 mol/l. Conservare al buio in contenitore chiuso di vetro a temperatura ambiente per non più di 1 mese. Acido cloridrico 0.4 mol/l: Aggiungere ad 1 litro di acqua 34.8 ml di HCl concentrato (peso specifico 1.18, concentrazione minima 34.8%, circa 10 molare). L esatto volume di acido può richiedere degli aggiustamenti secondo il grado di purezza. Cloruro di potassio (0.4 mol/l): Aggiungere 28.8 g di cloruro di potassio ad 1 L di acqua Agar glicina vancomicina polimixina cicloexamide (GVPC) Carbone attivato Estratto di lievito Idrossido di potassio Tampone ACES (N-2-acetamino-2-aminoetano acido sulfonico) Pirofosfato ferrico L-cisteina cloridrato monoidrato 2.0 g 10.0 g 2.8 g 10.0 g 0.25 g 0.4 g Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 7 di 15

8 α-chetoglutarato, sale monopotassico Glicina (priva di azoto) Polimixina B solfato Vancomicina cloridrato Cicloesamide Agar Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 1.0 g 3.0 g UI 1 mg 80 mg 13.0 g 1 L Nota: Può essere utilizzato come alternativa il GVPN contenente 50mg/L di natamicina al posto della cicloesamide Agar carbone tamponato estratto di lievito con cisteina (BCYE+, buffered charcoal yeast extract agar with cysteine) Carbone attivato Estratto di lievito Idrossido di potassio Tampone ACES (N-2-acetamino-2-aminoetano acido sulfonico) Pirofosfato ferrico L-cisteina cloridrato monoidrato αchetoglutarato, sale monopotassico Agar Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 2.0 g 10.0 g 2.8 g 10.0 g 0.25 g 0.4 g 1.0 g 13.0 g 1 L Agar carbone tamponato estratto di lievito senza cisteina (BCYE-) Carbone attivato Estratto di lievito Idrossido di potassio Tampone ACES (N-2-acetamino-2-aminoetano acido sulfonico) αchetoglutarato, sale monopotassico Pirofosfato ferrico Agar Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 2.0 g 10.0 g 2.8 g 10.0 g 1.0 g 0.25 g 13.0 g 1 L Soluzione fisiologica con formalina al 2% (opzionale) Tampone fosfato salino (phosphate buffered saline) (PBS) (Opzionale) Cloruro di sodio Cloruro di potassio Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua 8.0 g 0.2 g 1.15 g 0.2 g 1 L Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 8 di 15

9 ph 7.3 ± 0.2 a 25 C Reagenti per colorazione di immunofluorescenza (opzionale) Confezioni commerciali per agglutinazione al lattice (opzionale) 6. PROCEDURA SUL CAMPIONE 6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE I campioni dovrebbero essere trasportati da personale adeguatamente addestrato 15. Aggiungere un composto inattivante in eccesso (se disponibile) ai campioni che contengono sostanze biocide. I campioni idrici dovrebbero essere ricevuti e manipolati come descritto nella SOP: W 1 Sezione I campioni dovrebbero essere trasportati a temperatura ambiente (compresa fra 6 e 18 C) e protetti dalla luce solare. I campioni devono essere conservati a temperatura ambiente e protetti dalla luce fino quando sono processati. 6.2 PREPARAZIONE DEL BIOFILM E SOSPENSIONI DEL SEDIMENTO Preparare una sospensioni 1:10 e 1:100 del campione in diluente sterile o acqua. Se il campione non può essere raccolto con la pipetta, preparare la sospensione pesando il campione originale, come 1:10 (p/v). Miscelare in modo appropriato agitando o scotendo con vortex. Per facilitare il mescolamento, aggiungere al campione circa 1cm 3 di palline sterili di vetro. Se la consistenza iniziale del campione lo permette, lo si può utilizzare per prove successive così com è oppure diluito. 6.3 PRE-TRATTAMENTO E SEMINA SU PIASTRA DI AGAR SELETTIVO il concentrato è seminato in tre modi: direttamente senza successivo trattamento; dopo pretrattamento termico; e dopo pre-trattamento acido. Il trattamento e le procedure della semina sono di seguito descritte. Nota: nelle ricerche in corso di epidemia il campione originale non concentrato può esser seminato in coltura nello stesso modo. Ciò si riferisce in modo particolare a campioni provenienti da torri di raffreddamento e da altre acque non potabili TRATTAMENTO TERMICO Distribuire 0.2 ml del concentrato finale in un contenitore dotato di tappo a vite e inserire in un bagno ad acqua a 50 ± 1 C per 30 ± 5 minuti. Miscelare in modo opportuno il campione riscaldato, e diffondere 0.1 ml sulla superficie di un agar GVPC o GVPN utilizzando una spatola sterile. Se si prevede un intervallo di tempo fra le semine, come quando ad esempio si devono manipolare numerosi campioni, raffreddare rapidamente dopo il riscaldamento TRATTAMENTO ACIDO Distribuire 0.2 ml della sospensione di prova in un contenitore dotato di tappo a vite. Aggiungere un uguale volume di tampone acido a ph 2.2 e lasciare agire per 5 minuti ± 30 secondi. Immediatamente dopo seminare su tutta la superficie di un piastra GVPC o GVPN 0.2 ml di campione trattato. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 9 di 15

10 Quando deve essere seminato più di un campione trattato, processare lotti non superiori a 5 aggiungendo il tampone acido ad intervalli di 1 minuto NON TRATTATO Preparare le diluizioni se richieste. Seminare 0.1 ml di sospensione sulla superficie di piastre GVPC e diffondere l inoculo con una spatola sterile CONSERVAZIONE DEI CONCENTRATI Conservare in contenitori dotati di tappo a vite a 6 ± 2 C al buio fino a 12 mesi. Nota: la ripetizione della prova sui concentrati conservati può risultare importante nelle ricerche di epidemie da malattia dei Legionari. 6.4 INCUBAZIONE ED ESAME DELLE PIASTRE DI AGAR SELETTIVO Lasciare i terreni seminati fino a quando l inoculo è stato completamente assorbito, inserire in camera umida ed incubare a 36 ± 1 C. L incubazione in atmosfera di aria con il 2.5% di CO 2 (v/v) può favorire la crescita di alcune specie di Legionella. Incubare la piastre per 10 giorni e controllare almeno 3 volte ad intervalli di 2 4 giorni durante questo periodo. Se sulle piastre si manifesta un rigoglioso sviluppo di colonie diverse dalla Legionella, queste possono sopprimere lo sviluppo di qualsiasi specie di Legionella presente. Se dopo 2 4 giorni di incubazione si osserva un abbondante crescita concomitante, riseminare una quota del concentrato conservato diluita 100 volte. 6.5 CONTEGGIO DELLE COLONIE Al termine dell incubazione, esaminare le colonie con microscopio idoneo all osservazione delle piastre con luce ad incidenza obliqua. Le colonie delle specie Legionella assumono un tipico aspetto a vetro smerigliato con riflessi perlacei iridescenti. Le colonie caratteristiche sono lisce con bordo continuo e spesso assumono colore bianco o grigio-blu-porpora, ma possono essere di colore scuro, rosa, verde vischio o rosso scuro. Contare fino a 150 colonie di Legionella sospette per piastra. Quando un campione contiene alcune specie di Legionella la presenza di autofluorescenza può aiutare l identificazione. Pertanto, esaminare le piastre anche con luce ultravioletta (366 nm). Le colonie di Legionella bozemanii, Legionella gormanii, Legionella dumoffii, Legionella anisa, Legionella cherrii, Legionella steigerwaltii, Legionella gratiana, Legionella tucsonensis e Legionella parisiensis presentano una fluorescenza bianco brillante, Legionella rubrilucens e Legionella erythra appaiono rosse. Queste ultime specie possono mostrare fluorescenza solo quando crescono a temperature più basse o se sono lasciate a temperatura ambiente per 48 ore. La Legionella pneumophila non possiede autofluorescenza ed appare di colore verde opaco o gialla. Le colonie sospette di ciascun tipo di crescita presente devono essere contate e registrate per ogni metodo di pre-trattamento, e una loro selezione deve essere assoggettata alle prove di conferma CONFERMA DELLE SPECIE LEGIONELLA Selezionare tre colonie caratteristiche per Legionella da ciascuna delle piastre di agar GVPC. Eseguire le sottocolture da quelle di agar BCYE+ e BCYE-. Inserire in un termostato a 36 ± 1 C per almeno 2 giorni. Colonie, che crescono sul BCYE+ ma che non si sviluppano sul BCYE- (od agar sangue) sono specie sospette di Legionella. Calcolare e registrare poi il numero confermato di ciascun tipo di colonia di Legionella. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 10 di 15

11 6.6 IDENTIFICAZIONE E TIPIZZAZIONE Le specie Legionella possono essere identificate con metodi diversi, inclusa l immunofluorescenza o l agglutinazione col lattice. Per le richieste di routine è sufficiente identificare i ceppi a livello L. pneumophila sierogruppo 1, L. pneumophila sierogruppi 2-14 o specie Legionella diversa da L. pneumophila. In corso di ricerche epidemiologiche, gli isolati dovrebbero essere conservati e le sottocolture inviate al laboratorio di riferimento per una completa identificazione e siorotipizzazione. Può essere necessario conservare fino a 30 colonie per piastra IMMUOFLUORESCENZA Accertarsi che la crescita delle specie Legionella da coltura di 2 4 giorni sia pura valutando l aspetto della colonia (eseguire sottocoltura su BCYE se necessario). Preparare una sospensione leggermente torbida con 3 colonie di Legionella in 1 o 2 ml di soluzione fisiologica con formalina al 2% (se ciò non è adatto per il reagente a disposizione, seguire le indicazioni del produttore del metodo). Diluire, se necessario, in tampone fosfato salino. Preparare in modo analogo una sospensione di controllo positiva utilizzando L. pneumophila NCTC come controllo del sierogruppo 1, L. pneumophila sierogruppo 6 NCTC come controllo dei sierogruppi 2 14, L. micdadei NCTC come controllo delle specie Legionella, ed un controllo negativo utilizzando la sospensione fornita come controllo negativo. Contrassegnare i vetrini multi pozzetto di PTFE (Poli Tetra Fluoro Etilene) utilizzando un vetrino separato per ciascun controllo e per ciascun ceppo da identificare. Seguire le indicazioni del produttore per la fissazione e la colorazione della sospensione antigene di prova e dei controlli. Allestire i vetrini aggiungendo sufficiente quantità di liquido montante in modo da che diffonda sotto un coprioggetto pulito di larghezza sufficiente a ricoprire tutti i pozzetti (di solito 2 3 gocce). Assicurarsi che non siano presenti bolle d aria fra il vetrino e coprioggetto. Esaminare i vetrini con microscopio ad epifluorescenza a 50x con obbiettivo ad immersione ad acqua. Considerare positive le cellule che assumono aspetto fluorescente verde brillante con l anticorpo specie-specifico. I ceppi che manifestano reattività crociata possono essere inviati al laboratorio di riferimento dopo accordo con gli addetti, se ciò è ritenuto appropriato CONFEZIONI PER AGGLUTINAZIONE AL LATTICE Seguire le istruzioni del produttore. 7 CALCOLO DEI RISULTATI Calcolare il numero di colonie sospette per Legionella per grammo o ml nel modo seguente: Numero colonie sospette = Numero di colonie x Fattore di diluizione Volume seminato Calcolare il numero confermato delle specie Legionella per grammo o ml nel modo seguente: Numero confermato = No. di colonie confermate x Numero colonie sospette No. colonie saggiate 8 REFERTO Se nessuna colonia di specie Legionella è presente alla diluizione 10-1 refertare nel modo seguente: < 1.0 x 10 2 ufc/g o ml Se le Legionella sono rilevate a concentrazioni di 100 o superiori per grammo, refertare il numero ad 1 decimale come potenza di 10 in forma di: a x 10 b ufc/g o ml ove a è il numero di ufc (con 1 decimale) e b rappresenta la potenza appropriata di dieci. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 11 di 15

12 Arrotondare i conteggi per eccesso se l ultima cifra è uguale o superiore a 5 o per difetto se l ultima cifra è 4 o minore: esempio 1920 ufc/g refertare come 1.9 x 10 3 ufc/g ufc/g refertare come 2.4 x 10 5 ufc/g Nel giudizio interpretativo del referto deve essere riferita qualsiasi interferenza che può aver influenzato il risultato finale, come elevate concentrazioni di pseudomonadi. 9 CONTROLLO DI QUALITA 9.1 TERRENO E essenziale che ciascuna beuta di BCYE o GVPC preparata sia considerata come un lotto di terreno separato. Ciascun lotto di terreno deve essere saggiato per verificare la capacità di sviluppo di L. pneumophila e di L. bozemanii e confrontato quantitativamente al precedente lotto di terreno, noto per soddisfare la crescita di L. pneumophila e di L. bozemanii. I conteggi da aliquote della stessa sospensione di prova dovrebbero cadere all interno dell intervallo di confidenza stabilito al 95% (Tabella 8.1 in Microbiology of Drinking Water 2002) 17. Poiché alcuni ceppi di pseudomonas sono in grado di inibire lo sviluppo delle legionella su GVPC, deve essere definita la capacità del terreno di impedire la crescita dei microrganismi concomitanti. Ciò può essere ottenuto preparando diluizioni decimali di Pseudomonas aeruginosa NCTC ed inoculando ciascuna di loro sugli agar GVPC e BCYE per ottenere conteggi compresi fra 10 e 50 colonie. Il terreno è considerato idoneo se il GVPC è in grado di ridurre il numero di microrganismi di almeno una concentrazione logaritmica. Queste condizioni di verifica sono richieste solo per terreni prodotti in laboratorio o confezionati commercialmente ove la certificazione delle prestazioni non specifica il grado di inibizione nei confronti delle pseudomonadi. 9.2 PROVE DI CONFERMA Controllo positivo: Seminare una piastra di agar GVPC con L. pneumophila sierogruppo 1 NCTC per ottenere una crescita a colonie isolate o con 0.1 ml di un concentrato conservato, precedentemente riscontrato positivo per specie Legionella. Processare tutti i controllo in parallelo con le prove di routine. 10 STRUTTURE DI RIFERIMENTO In alcune circostanze come durante un epidemia, gli isolati possono essere inviati alla Health Protection Agency Atypical Pneumonia Unit per la completa identificazione sierologica e per la sottotipizzazione della L. pneumophila sierogruppo 1 dopo colloquio con gli esperti, se ciò è considerato appropriato. 11 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questi Standard Method sono stati iniziati e sviluppati, riveduti e revisionati dal Water Working Group for Standard Method ( Si ringraziano le numerose persone appartenenti a laboratori clinici di microbiologia ed alle organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 12 di 15

13 Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale, London NW9 5EQ Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 13 di 15

14 ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA IN BIOFILM E SEDIMENTI Trasporto in laboratorio in contenitori idonei a temperatura ambiente senza esporre alla luce solare diretta Conservare a temperatura ambiente al buio ed esaminare entro 24 ore dal prelievo Preparare diluizioni 1:10 e 1:100 Miscalare su vortex Dividere in 3 aliquote - non trattata, trattata con calore e trattata con acido Pretrattare come approrpriato e seminare ml (in funzione del trattammento) su agar GVPC Incubare a 36 C ed aumentare l'umidità (preferibilmente con CO 2 ) for 2 to 10 days Eseguire sottocolture in agar BCYE+ e BCYE- per prove di conferma Calcolare il conteggio confermato delle Legionella Inviare al la boratrio di riferimento per prove sierologiche e di identificazione della specie, se ritenuto necessario Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum. Pagina 14 di 15

15 BIBLOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Lee JV, West AA. Survival and growth of Legionella species in the environment. J Appl Bacteriol Symp Sup 1991;70:121S-9S. 3. HSC Approved Code of Practice & Guidance L8 Legionnaires' disease : The control of legionella bacteria in water systems. 3rd ed. Norwich: HMSO; BS 6068-ISO Water quality - Part 4: Microbiological methods - Section 4.12:1998 Detection and enumeration of Legionella. London: British Standards Institution; Advisory Committee on Dangerous Pathogens 2004 Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Accommodation for pathology services. 1 st ed. London: Her Majesty's Stationary Office (HMSO); (Out of print - 2nd edition in press). 11. BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; British Standard BS 7592:1992. Methods for sampling for Legionella organisms in water and related materials Health Protection Agency. National Standard Method: General technique for the detection of bacteria by membrane filtration W1. London: Health Protection Agency; Standing Committee of Analysts. The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 1 - Water Quality and Public Health. Methods for the examination of waters and associated materials. Environment Agency. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum. Pagina 15 di 15