Uso industriale di enzimi Applicazione delle biotecnologie alla produzione di alimenti. C. MAZZONI/BiotecnologieMicrobiche07

Transcript

1 Uso industriale di enzimi Applicazione delle biotecnologie alla produzione di alimenti 07

2 Applicazioni su larga scala di enzimi 2 Industria Enzima Effetto Detergenti Tessile Mangimi Amido Proteasi Lipasi Cellulasi Cellulasi Laccasi Xilanasi fitasi Amilasi Glucosio isomerasi Degradazione proteine Rimozione grassi Brillantezza colori Rimozione microfibrille Brillantezza colori Solubilità fibre Rilascio fosfati Formazione glucosio Formazione fruttosio Carta xilanasi biobleaching Succhi di frutta Prodotti forno Lattierocasearia Birra Pactinasi Cellulasi Xilanasi Xilanasi Alpha-amilasi Glucosio ossidasi Rennina lattasi Glucanasi Papaina Chiarificazione succhi Estrazione succhi Impasto Shelf life; lievitazione Qualità impasto Coagulazione proteine Idrolisi del lattosio Filtrazione Controllo della maturazione

3 3 Applicazione su larga scala di enzimi apple Detergenti apple Prodotti ingegnerizzati geneticamente per essere più stabili nelle condizioni ostili delle lavatrici e in presenza di detergenti anionici, agenti ossidanti e alti ph. apple Proteasi: batteriche apple Lipasi: idrolizzano il legame estere tra il glicerolo e l acido grasso. Prodotta in Aspergillus oryzae che esprime il gene di Humicola lanuginosa

4 4 Applicazione su larga scala di enzimi apple Detergenti apple Amilasi:idrolizzano l amido gelatinizzato, che tende ad incollarsi sulle fibre tessili e lega altri componenti dei coloranti apple Cellulasi: rimuovono le microfibrille di cellulosa, che si formano durante il lavaggio e l uso dei capi in cotone. L effetto è un aumento della brillantezza dei colori e una maggiore morbidezza dei capi apple Cellulasi alcaline: Bacillus apple Cellulasi neutre e acide: Trichoderma e Humicola

5 5 Applicazione su larga scala di enzimi apple Tessile apple Amilasi: per rimuovere l amido nel processo di desizing in quanto non aggrediscono le fibre tessili apple Cellulasi: hanno rimpiazzato l uso della pietra lavica nella preparazione del Denim (soffici fibre speciali di cotone dove il colorante è stato parzialmente sbiadito) dalle fibre di cotone colorate con l indigo per il raggiungimento di un elevato grado di sbiadimento apple Laccasi : può degradare ossidativamente molte molecole di natura diversa, tra le quali i pigmenti dei coloranti (sbiancante)

6 6 Applicazione su larga scala di enzimi apple Polpa di cellulosa e carta apple Xilanasi: nel processo di bleaching della polpa apple Cellulasi : Aiutano a liberare l inchiostro dalla carta riciclata apple Amilasi: usata per far raggiungere una determinata viscosità alla sospensione d amido apple Lipasi: usate per eliminare materia grassa dai legni dolci (pino rosso)

7 7 Applicazione su larga scala di enzimi apple Pelle apple Lipasi e proteasi: rimuovono le parti non utili presenti nella pelle degli animali. migliorano la qualità della pelle (superficie più forte e più pulita, maggiore morbidezza e meno macchie).

8 8 Applicazione su larga scala di enzimi apple Prodotti per igiene personale apple Proteasi e lipasi: pulizia lenti a contatto apple Catalasi: elimina l eccesso di perossidi apple Glucoamilasi e glucosio ossidasi: dentifrici apple Amido Glucosio Acido gluconico+h 2 O 2 apple apple glucoamilasi glucosio ossidasi disinfettanti

9 9 Strategie per limitare i costi apple immobilizzazione di enzimi su supporti inerti apple recupero dei microrganismi dal brodo di fermentazione e loro riciclo apple mutagenesi e selezione apple fusione di protoplasti apple Uso delle tecniche del DNA ricombinante /Kg di proteina"

10 10 Esistono davvero?? apple NOVOZYMES ( en) apple GENENCOR apple ( genencor)

11 11 Produzione di HFCS con glucosio ossidasi Società Nome Comm. Origine Metodo immobiliz. Velocità (g vol h -1 ) Enzyme Biosystems G-zyme Streptomyces olivochromogenes DEAE 6 Genencor Spezyme S. rubiginosus DEAE/TiO2 3.9 Nagase Sweetase S. phaechromogenes DEAE 1.4 Novo Nordisk Sweetzyme S. murinus Glutaraldeide 2.1 UOP Ketomax 100 Streptomyces olivochromogenes Allumina trattata con PEI e glutaraldeide 5.2 (HFCS: High Fructose Corn Syrup)

12 12 Perché utilizziamo cibi fermentati? apple apple Proprietà organolettiche sapore consistenza odore apple Conservazione è importante inibire i patogeni è importante prevenire la contaminazione da parte di altri microrganismi

13 Produzione di alimenti 13 fermentati apple Prodotti lattiero caseari latte, latti fermentati, yogurt, formaggi, burro apple Prodotti da forno pane apple Bevande fermentate vino, spumante e vini frizzanti, birra, acquavite apple Ortaggi e olive apple Carni e derivati prosciutto insaccati

14 14 Fermentazioni naturali apple Si cercano le condizioni per inibire le fermentazioni indesiderate e favorire quelle desiderate. apple ESEMPI la birra Belga la fermentazione dei vegetali (vegetali+sale) Molti processi che avvengono in Africa, Asia e America latina

15 15 Fermentazioni controllate apple Si aggiungono deliberatamente i microrganismi che operino la fermentazione desiderata apple ESEMPI: prodotti fermentati dell industria lattiero casearia lattosio acido lattico colture starter Batteri acido lattici (LAB)

16 16 Fermentazioni secondarie apple Microrganismi diversi dallo starter (flora secondaria apple ESEMPI: prodotti fermentati dell industria lattiero casearia Batteri acido lattici non starter (NSLAB) migliorano le proprietà organolettiche del prodotto

17 17 Pratiche artigianali apple Conservare una piccola quantità di prodotto fermentato da aggiungere alle preparazioni successive (praticato già nel 1860) apple Affidarsi all innesco spontaneo del processo

18 Produzione ed applicazione di 18 starter apple Ceppo di partenza apple Selezione o mutagenesi sotto pressione selettiva apple Screening per cloni con attività desiderate apple Caratterizzazione dei ceppi selezionati apple Prove di fermentazione in vitro apple Prove di fermentazione sul substrato apple Intercompatibilità fra diverse colture apple Prove pilota apple Inserimento nella collezione di colture

19 19 Colture miste apple colture tradizionali, a composizione complessa e spesso indefinita (una o più specie diverse, con più ceppi, in rapporti numerici indefiniti) spesso propagate in condizioni non asettiche

20 20 Vantaggi e svantaggi apple Le colture miste hanno il pregio di essere prodotte a costi minori e, generalmente, essere costituite da batteri resistenti ai fagi. Di contro, sussistono difficoltà nella riproducibilità del prodotto finale e risulta difficile il miglioramento dei ceppi.

21 21 Colture a composizione definita apple (Defined Strain Starters, DSS): contengono uno o più ceppi (ma in rapporti noti e definiti: 2-4 ceppi, sono ormai rare combinazioni di 5-6 ceppi.) di una o più specie di fermenti lattici, mesofili o termofili. Sono conservate, controllate e riprodotte come colture stock presso industrie specializzate e distribuite sotto varie forme ai caseifici, presso i quali subiscono le ultime fasi della riproduzione, in condizioni asettiche, utilizzando substrati a base di latte o siero.

22 22 Vantaggi e svantaggi apple un vantaggio è l estrema riproducibilità delle performance tecnologiche. Uno svantaggio è rappresentato dal maggiore costo, dalla dipendenza da fornitori esterni (industrie e istituzioni specializzate). Inoltre, sussiste la necessità di maggiori controlli in fase di riproduzione.

23 23 Starter per l industria lattiero casearia apple Introdotti da tempo nel settore apple Lattobacilli

24 Classificazione delle colture 24 usate come starter Batteri Muffe Lieviti Lattobacilli Cocchi Fermentazione del glucosio Omoferm. Eteroferm. L. bulgaricus L. lactis L. helveticus L. acidophilus L. casei L. plantarum Betabacterium L. fermentans L. brevis Fermentazione del glucosio Omoferm. Streptococcus mesofili termofili St. lactis St. cremoris St. lactis subsp. diacetyl-lactis St. thermophilus Micelio bianco: P. camembertii Micelio blu: P. roquefortii Micelio variabile: A. oryzae Candida kefir (subsp. lactis, subsp. kefir) Eteroferm. Leuconostoc cremoris

25 25 Batteri lattici e alimenti apple Sono ubiquitari nell ambiente (su vegetali e negli animali) apple Colonizzano la mucosa gastroenterica dei monogastrici proteggendola da microrganismi patogeni ed equilibrando il microbismo intestinale apple Fermentano il glucosio, il saccarosio ed il lattosio producendo Soltanto acido lattico (LATTICI OMOFERMENTANTI) Acido lattico, aldeidi, alcoli (LATTICI ETEROFERMENTANTI) apple Possono essere mesofili o termofili apple Quelli di interesse caseario sono per lo più termofili

26 26 Latte

27 27 Latte apple Il carboidrato presente è il lattosio (Gal-Glu). apple Il latte umano ne contiene il 7.5 % (m/v), quello vaccino 4.5 % (m/v). apple Ha un legame β che per essere scisso richiede l enzima beta-galattosidasi. L assenza di questo enzima causa un intolleranza al latte.

28 28 Latti fermentati, yogurt apple La fermentazione del latte è un metodo per aumentarne la stabilità. Si suddividono in apple latti acidi (yogurt e altri) apple latti acidi alcolici (kefir, koumis ed altri) apple formaggi ottenuti da latti acidi apple buttermilk o latticello (una volta ottenuto come sottoprodotto della burrificazione, oggi preparato direttamente dal latte)

29 29 Latti fermentati: starter apple Originariamente l innesco avveniva spontaneamente: il latte era messo nello stomaco di animali o pelli di capre. In questo modo la qualità del prodotto dipende dalle condizioni ambientali: alte temperature, il ph scende a 3,8, fermentazione di lattobacilli basse temperature, il ph arriva solo a 5/6 con prevalenza di coliformi

30 30 Latti fermentati: starter apple Analizzando la flora microbica di latti fermentati in varie zone climatiche, si osservano differenze nelle flore utilizzate apple Paesi Scandinavi : freddo : streptococchi mesofili apple Paesi del Mediterraneo : caldo : streptococchi e lattobacilli termofili

31 31 Latti fermentati: starter apple Gli starter vengono selezionati in base alle caratteristiche organolettiche del prodotto: apple yogurt : termofili : acidificazione rapida apple buttermilk : acidificazione lenta apple kefir : lenta produzione di anidride carbonica a basse temperature

32 32 Microrganismi dello yogurt Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Yogurt bacteria culture

33 33 Produzione di yogurt apple S. thermophilus e L. bulgaricus apple 42 C, 4-5h apple Trasformano il 90% del lattosio in lattato, formano i n o l t r e a c e t a l d e i d e e diacetile (aromi caratteristici dello yogurt). apple Poiché questi microrganismi m a n c a n o d i a l c o l deidrogenasi, nello yogurt non si forma etanolo Fermentazione del lattosio attraverso lattobacilli lattosio glucosio galattosio glucosio fosfato piruvato aldeide attivato + acetilcoa lattato acetaldeide diacetile etanolo

34 34 Produzione di yogurt La densità può essere aumentata con veri metodi: aumento concentrazione del latte aggiunta di latte in polvere uso di ceppi speciali di L. bulgaricus e S. thermophilus che producono colonie in cui le cellule sono unite da membrane poligalatturoniche e di polisaccaridi (esopolisaccaridi EPL)

35 35 Produzione di buttermilk apple Fermentazione del latte con Str. cremoris e Str. lactis per la formazione del lattato e Str. lactis diacetilactia e Leuconostoc cremoris per la formazione degli aromi. apple Più viscoso del latte con sapore leggermente burroso apple Diffuso nei paesi Scandinavi, Europa centrale, USA

36 36 Produzione di kefir apple Contiene alcol e CO 2 apple Lo starter si differenzia per il fatto che la microflora non è omogeneamente distribuita nel substrato ma concentrata in grani che, durante la fermentazione, affiorano apple Flora composta da lattobacilli omo- ed eterofermentativi e lieviti lattosio positivi e negativi apple Diffuso nei paesi dell Est

37 37 koumiss apple Prodotto quasi esclusivamente da latte equino apple Originariamente prodotto in condizione semi-continua in quanto ai contenitori di pelle o ai tini di legno veniva aggiunto latte fresco dopo ogni prelievo apple Latte + 25% H 2 O oppure siero di latte + 2-3% zucchero apple I componenti dello starter sono L. bulgaricus e una Torula.

38 38 Formaggi apple I formaggi vengono classificati in base al latte impiegato,consistenza della pasta temperatura di cottura e tempo di stagionatura

39 39

40 40 Produzione di formaggi apple 1. Coagulazione del latte per formare la cagliata. apple 2. Separazione della cagliata dal siero. apple 3. Messa in forma della cagliata. apple 4. Stagionatura per accentuare il sapore e la consistenza.

41 41 Produzione di formaggi apple Coagulazione: avviene attraverso l aggiunta di caglio (presamica) apple Enzimi coagulanti: proteasi acide=rennina (chimosina) e pepsina apple La rennina idrolizza parzialmente la K-caseina (tra phemet). La paracaseina, con il Ca ++ del latte, precipita a formare il paracaseinato di calcio apple Le rennine microbiche sono adatte ai crudi (bassa resistenza al calore) apple Rennina bovina prodotta con la tecnica del DNA ricombinante nel lievito Kluyveromyces lactis

42 42 Produzione formaggi apple L aggiunta dello starter avviene già durante la fase di coagulazione nella caldaia. apple La formazione lenta di acido lattico (abbassamento di ph) influisce positivamente sulla resa, favorendo la separazione del siero dal caglio apple Durante la stagionatura, avviene la formazione degli aromi e la consistenza (tipici per ogni formaggio) attraverso gli enzimi contenuti nel latte e nei ceppi microbici usati nello starter

43 43 Produzione formaggi apple Roquefort apple Viene inoculato con spore di Penicillium roqueforti apple Le venature blu rappresentano il sito di inoculo delle spore fungine apple Camembert apple Viene aggiunto in superficie Penicillium camemberti. Questo fungo produce delle proteasi che trasformano il formaggio conferendogli la consistenza di una soffice crema

44 44 Lipasi Occupano un ruolo molto importante nel processo di maturazione. apple Agiscono sugli esteri e idrolizzano il legame tra glicerolo ed acido grasso. Sono determinanti per lo sviluppo delle caratteristiche organolettiche di provolone, pecorino, caciocavallo, gorgonzola e roquefort apple Le lipasi possono avere origine microbica o possono essere esterasi pregastriche di capretto, vitello e agnello apple Vengono aggiunte al latte prima della cagliata

45 Batteri propionici: 45 Propionibacterium apple I batteri propionici sono stati isolati per la prima volta dal formaggio Emmenthal di cui determinano, a causa della CO 2 prodotta durante la loro fermentazione, i buchi. apple Sono bastoncini, pleomorfi, asporigeni, immobili e anaerobi. La maggior parte fermenta anche il lattato, producendo propionato, acetato e CO 2. apple Nella produzione di formaggio Emmenthal è proprio la fermentazione del lattato a propionato che rende il formaggio così particolare. apple La coltura di innesco è costituita da una coltura mista di streptococchi e lattobacilli omofermentanti, e da batteri propionici. I microrganismi omofermentanti sono responsabili della fermentazione del lattosio ad acido lattico. Durante la stagionatura (circa due mesi), si ha lo sviluppo dei batteri propionici che possono raggiungere anche la concentrazione di 10 8 cellule/grammo. I buchi (occhiatura) si formano per accumulo di CO 2, che diffonde nella pasta del formaggio e si raccoglie in alcuni punti.

46 46 Aggiunta di lisozima apple Il lisozima, ottenuto dall albume dell uovo, esercita un azione litica sulla parete dei batteri, in particolare clostridi e propionibatteri. Questi microrganismi (C. tyobutiricum) sono responsabili del gonfiore tardivo dei formaggi a lunga stagionatura come grana, provolone, asiago) apple Una volta si usava la formaldeide (cancerogeno).

47 47 Limburger apple Il Limburger è un prodotto dell Europa centrale ottenuto dal cagliato di latte acido. Il cagliato viene separato dal siero e pressato. apple Durante la successiva maturazione avviene, partendo dalla superficie, la trasformazione della caseina e dei lipidi attraverso una flora spontanea di batteri proteolitici e lipolitici, manifestandosi in una progressiva vitrificazione e liquefazione della pasta e la formazione di un prodotto molto aromatico

48 48 Formaggi a pasta filata: mozzarella e provolone apple Streptococcus thermophilus maggiore produttore di acido lattico apple Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus o Lactobacillus helveticus apple Il rapporto tra cocchi e bastoncelli può essere: 1:1 3:1 o 5:1

49 49 Parmigiano e grana apple Streptococcus thermophilus apple Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus o Lactobacillus helveticus apple a volte Lactococcus lactis apple Il rapporto tra cocchi e bastoncelli può essere: 1:1 o 3:1

50 50

51 51 Produzione di burro apple Secondo la normativa italiana il burro è la sostanza grassa del latte di mucca, ricavato con separazione del latticello mediante varie operazioni meccaniche. Per legge deve avere un contenuto di grassi non inferiore all'80 per cento, non deve contenere materie estranee alla composizione del latte, conservanti diversi dal sale comune e nè essere colorato con coloranti diversi da quelli consentiti (carotene e zafferano). apple Essendo di origine animale, il burro è ricco di grassi saturi, i maggiori responsabili della comparsa di alterazioni a carico delle arterie e il cui consumo in quantità elevate è stato associato all'incremento dei livelli di colesterolo nel sangue e della mortalità per malattie cardiovascolari. apple Il "burro di qualità" è ottenuto solo dalla crema di latte. apple Crema di latte apple La crema è costituita da latte arricchito di grasso. Si distinguono creme a basso contenuto lipidico, come la panna da cucina (che ha un contenuto minimo di grasso del 21 per cento) o da montare (contenuto minimo 30 per cento) e quelle a medio o alto contenuto (40-70 per cento), utilizzate nel processo di burrificazione. Si ottiene per centrifugazione.

52 52 Produzione di burro apple La crema ottenuta per centrifugazione viene preventivamente pastorizzata, successivamente inoculata con fermenti acidificanti selezionati come S. lactis, cremoris (acidificanti) e S. diacetilactis e Betacoccus citrovorus (aromatizzanti). I primi formano acido lattico e citrico; i secondi in una prima fase acido acetico, ossalacetico e piruvico e CO 2 ; in una seconda fase l acido piruvico viene trasformato in acetoina e diacetile, i principi aromatici del burro.

53 53 Produzione di burro apple Per ottenere il burro, la crema di latte deve essere violentemente sbattuta, il che consente di rompere i globuli di grasso e di amalgamarli, facendo fuoriuscire la parte residua di acqua. Questo processo viene chiamato zangolatura ed è favorito da condizioni di acidità e da temperature inferiori ai 15 C che rendono il globulo di grasso più fragile. Le zangole, un tempo in legno, sono oggi costituite da recipienti in acciaio inox che ruotano sul proprio asse; internamente possono presentare dei rulli che impastano il burro e lo amalgamano. apple Il liquido che si elimina con la zangolatura viene chiamato latticello e contiene una minima percentuale di grasso (0,3-0,4 per cento) e di proteine, derivanti dagli involucri esterni del globulo di grasso.

54 54 Processo della burrificazione Pastorizzazione del latte Aggiunta delle colture microbiche Latticello Zangolatura Maturazione Lavaggio Impastamento Formatura Confezionamento

55 55 Irrancidimento apple L irrancidimento degli acidi grassi insaturi può avvenire attraverso un processo chimico di ossidazione favorito da luce, aria, acqua e tracce di metalli. apple L irrancidimento microbico avviene attraverso la beta-ossidazione. apple Un altra via di decomposizione (attraverso alcuni funghi) conduce alla formazione di chetoni

56 56

57 57

58 58