Elettroforesi su gel. L elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l influenza di un campo elettrico.

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1 Elettroforesi su gel L elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l influenza di un campo elettrico. La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce sulla particella. Nell elettroforesi su gel c è un mezzo di supporto che agisce impedendo disturbi meccanici e di convenzione durante la migrazione e che serve da setaccio molecolare per separare le molecole, provviste della stessa carica, in base alle dimensioni. La matrice può essere costituita da poliacrilammide, agarosio o una miscela di questi. I gel di agarosio sono largamente impiegati per separare molecole di DNA di dimensioni maggiori di 100 bp, si ricorre ai gel di acrilammide quando serve una risoluzione maggiore per frammenti di DNA di piccole dimensioni. L agarosio è un polisaccaride lineare purificato dall agar-agar delle alghe rosse; è solubile in acqua bollente e quando la soluzione si raffredda si forma un gel a causa della formazione di legami idrogeno tra le catene polimeriche dell agarosio. 1

2 Solitamente la preparazione di gel d agarosio richiede pochi minuti: a) si pesa l agarosio b) si aggiunge l adeguata quantità di tampone TAE (Tris-acido acetico-edta) c) si scioglie l agarosio d) si aggiunge bromuro d etidio (colorante che si lega al DNA intercalandosi tra le basi complementari e mostra una forte fluorescenza quando illuminato con luce UV) in concentrazione pari a 0.5-1mg/ml e) si lascia solidificare il gel f) il DNA viene addizionato di una soluzione tampone contenente il 30% di glicerolo e, solitamente, blu di bromofenolo e xilene cianolo Il gel viene posto nella camera di corsa, si carica il campione e si attende che il DNA migri verso il polo positivo (i coloranti addizionati indicano l avanzamento del campione nel gel). 2

3 In alcuni casi è necessario recuperare il DNA dopo la corsa elettroforetica: il frammento di DNA di interesse viene tagliato dal gel, posto su un transilluminatore, con un bisturi e posto in una microprovetta. 3

4 La matrice di agarosio viene sciolta in un bagnetto termostatato, la soluzione ottenuta viene caricata su una resina. Solo il DNA resta legato alla resina mentre il resto (agarosio e sali) viene rimosso tramite tamponi di lavaggio contenenti Sali e etanolo Si lascia evaporare l etanolo e si eluisce il DNA con acqua. L elettroforesi può essere su gel verticale o orizzontale. Elettroforesi su gel verticale: il gel viene formato tra due lastre di vetro che sono mantenute verticali parallele e separate da sottili spaziatori. Un pettine di plastica viene sistemato nella soluzione prima che polimerizzi in modo da costruire i pozzetti per il caricamento del campione. Preparata la matrice, questa viene posta nella vasca di corsa che, inferiormente viene riempita di tampone. Nella parte che sovrasta il gel si crea una nuova vasca che viene anche essa riempita di soluzione tampone; qui sono immersi gli elettrodi. L alimentatore fornisce corrente agli elettrodi, nella soluzione tra gli elettrodi la corrente viene condotta dagli ioni del tampone. Le particelle caricate si muovono nel gel in funzione della loro carica e massa molecolare. 4

5 Un gel precast viene montato nel suo alloggiamento Il gel viene fissato nella cassetta elettroforetica La cassetta viene montata nell alloggiamento con gli elettrodi 5

6 Il gel viene caricato con l estratto proteico L alloggiamento viene inserito nella camera inferiore con il tampone Si monta la camera superiore e si applica la tensione elettrica 6

7 Qualora si debbano separare delle proteine si può condurre un elettroforesi denaturante o nativa. Nell elettroforesi denaturante i campioni proteici, prima del caricamento su gel vengono trattati con un tampone contenente β-mercaptoetanolo e SDS e riscaldati a 100 C. In questa situazione tutte le proteine, cariche negativamente e denaturate, si spostano nel gel solo in funzione del peso molecolare delle subunità che le costituiscono. 7

8 Nell elettroforesi nativa, invece, i campioni non vengono denaturati né caricati negativamente prima della corsa: la velocità di migrazione pertanto sarà il risultato della massa molecolare del campione e della sua carica intrinseca. Elettroforesi su gel orizzontale: (vedere descrizione precedente: gel agarosio) il gel in questo caso viene colato in una vaschetta fornita di un pettine in modo da creare i pozzetti di caricamento e fatto correre in orizzontale in una cella elettroforetica riempita preventivamente di tampone di corsa. 8

9 Attrezzature per elettroforesi orizzontale su gel di agarosio Un esempio di gel di agarosio colorato con bromuro di etidio 9

10 Gel di poliacrilammide (PAGE): i gel di acrilammide sono preparati facendo polimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N -metilenbisacrilammide. La polimerizzazione inizia con l aggiunta di ammonio persolfato (APS) e TEMED. Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato: si producono radicali liberi che attaccano i monomeri di acrilammide e ne avviano la polimerizzazione. I gel denaturanti contengono, inoltre, anche SDS, un detergente anionico che denatura le proteine e gli conferisce carica negativa. La grandezza dei pori della matrice è determinata dalla percentuale di acrilammide presente Si dicono gel in gradiente quelli in cui la concentrazione di acrilammide varia nella fase di caricamento (più lassa) e in quella di separazione (più concentrata). Il vantaggio dei gel in gradiente è che la separazione che si ottiene risulta migliore. 10

11 Le proteine separate tramite SDS-PAGE, finita la corsa, vengono fissate su gel (tramite soluzioni contenenti metanolo) e poi evidenziate tramite un opportuno metodo di colorazione. Di solito si ricorre alla colorazione con l argento (silver stain) quando si richiede una maggiore sensibilità, mentre si impiega blu di commassie quando la quantità di proteina caricata è maggiore. SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% Colorazione con Blu di Coomassie 11

12 Argento: Si fissano le proteine con il metanolo, si aggiunge nitrato di argento che si lega alle proteine. Si aggiunge quindi formaldeide in bicarbonato per ridurre l Ag+ ad argento metallico. La reazione viene fermata con acido acetico. Il procedimento e analogo a quello dello sviluppo fotografico. Blu Comassie: Per prima cosa si fissano le proteine al gel con una soluzione di acido acetico e metanolo. Si aggiunge il colorante in acido acetico e metanolo, si lascia a reagire finche tutto il gel e diventato blu, poi si decolora con acido acetico e metanolo Se le bande proteiche sono marcate con isotopi radioattivi possono essere rivelate tramite autoradiografia. E possibile, ad esempio, produrre proteine che contengono 35 S-metionina producendole in vivo in cellule cui viene somministrato l aminoacido marcato. Le proteine radiomarcate, dopo separazione su gel, vengono rivelate seccando il gel e mettendolo in diretto contatto con una lastra da raggi X. Western blot: Le proteine separate in elettroforesi (SDS-PAGE) possono essere trasferite su un foglio di nitrocellulosa. Il trasferimento, di solito, si effettua per elettroblotting: il gel e la nitrocellulosa vengono posti in un apposito supporto a forma di sandwich, immerso in un tampone, nel quale ci sono due elettrodi paralleli. 12

13 La corrente trasferisce le proteine dal gel sul foglio di nitrocellulosa. Il foglio viene quindi saturato con siero di latte in polvere privo di grassi al 10%, oppure con una soluzione salina contenente una concentrazione opportuna di BSA, per bloccare i legami aspecifici e, poi, sottoposto a reazione con anticorpi. Western Blotting Buffer-soaked filter papers Nitrocellulose membrane - + Gel Buffer SDS-PAGE Assemble sandwich Wet blotting Electrode Direction of transfer Graphite Electrode Plates - + Semi-dry blotting Nitrocellulose with bound proteins Stained (Red Ponceau) 13

14 L anticorpo primario è diretto contro la proteina di interesse; il secondario è diretto contro le IgG dell organismo usato per produrre l anticorpo primario. Gli anticorpi secondari sono opportunamente marcati in modo da poter essere rivelati una volta legato l anticorpo primario (in genere sono coniugati ad un enzima come ad esempio la perossidasi). Il blot viene quindi incubato con una soluzione contenente il substrato dell enzima che viene convertito in un prodotto colorato. Produzione di anticorpi Gli anticorpi sono proteine prodotte dalle cellule B del sistema immunitario. Consistono di due frammenti: il frammento Fc e il frammento Fab. Il frammento Fc, in un dato animale, è sempre lo stesso in tutti gli anticorpi. Il frammento Fab, invece, è variabile, riconosce e si lega ad un epitopo dell antigene. Antigene: sostanza che scatena una risposta immunitaria. Epitopo: regione dell antigene a cui si lega un anticorpo. 14

15 Anticorpi primari: si distinguono in policlonali e monoclonali. Anticorpi policlonali: quando un antigene viene iniettato in un animale (topo, coniglio, capra) viene prodotta una miscela di anticorpi. Migliaia di parti diverse (epitopi) dell antigene sono coinvolte nell attivazione di migliaia di cloni di cellule B, ciascuno producente un anticorpo diverso. Questi anticorpi sono chiamati policlonali perché hanno specificità diverse verso epitopi diversi. Anticorpi monoclonali: gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici diretti contro un epitopo specifico di una proteina. Sono prodotti da un clone derivato da una singola cellula. Per ottenere anticorpi monoclonali occorre: -iniettare l antigene in un topo -prelevare la milza del topo dopo qualche settimana -le cellule prelevate dalla milza vengono fuse in vitro con cellule di mieloma (tumorali) -ciascuno degli ibridi cellulari derivanti dalla fusione si moltiplica -analisi e selezione degli ibridomi 15

16 Anticorpi secondari Gli anticorpi primari, di solito, non sono marcati e quindi non rilevabili. Si usano perciò degli anticorpi secondari marcati, diretti contro il frammento Fc, che consentono di rilevare l avvenuto legame all antigene e quindi la presenza dell anticorpo primario. Vantaggi uso anticorpi secondari: 1) Amplificazione del segnale, aumento sensibilità del saggio. 2) Il secondario può essere usato contro tutti gli anticorpi primari prodotti nello stesso organismo (es. contro tutti i primari prodotti in coniglio) La presenza di bande colorate sulla nitrocellulosa indica la presenza della proteina di interesse. Un metodo alternativo e più sensibile sfrutta il luminolo (un substrato chemiluminescente) la perossidasi ossida il luminolo con produzione di luce, la luce emessa può essere rivelata esponendo il blot a una lastra fotografica. Trasferimento degli acid nucleici su membrana (blotting) Blotting: trasferimento e immobilizzazione di un campione di acidi nucleici su un supporto solido (in genere nitrocellulosa o nylon). Southern blotting Il gel di agarosio contenente il DNA da trasferire (precedentemente digerito con enzimi di restrizione) viene posto su un ponte di carta da filtro, le cui estremità pescano all interno di un recipiente contenente il tampone di trasferimento. 16

17 La membrana viene posta in contatto con il gel e coperta da una pila di tovaglioli di carta assorbente, che, per capillarità, richiamerà il tampone. Le molecole di DNA vengono trasportate dal flusso di tampone attraverso il gel verso i tovaglioli di carta, rimanendo intrappolate sulla membrana che non è permeabile al DNA. Condizione essenziale è il pretrattamento del gel: il DNA su gel viene trattato con una soluzione di HCl 0.25M e poi con una soluzione alcalina (depurinazione e denaturazione), il gel viene poi posto in una soluzione neutralizzante per riportare il ph a valori simili a quelli del tampone di trasferimento. (la depurinazione è necessaria solo per frammenti di DNA molto grandi; la depurinazione assicura che, durante le denaturazione in NaOH, il DNA venga rotto a livello delle basi depurinate) 17

18 Dopo il trasferimento gli acidi nucleici devono essere fissati sulla membrana: in genere si utilizzano i raggi UV (inducono la formazione di legami covalenti tra le Timine del DNA e i gruppi amminici carichi presenti sulla membrana) o si pone la membrana in stufa a 80 C. Si procede, poi, con l immersione della membrana in una soluzione contenente RNA o DNA a singolo filamento o oligonucleotidi marcati la cui sequenza sia complementare a quella del frammento che si vuole identificare sulla membrana. Le condizioni di ibridazione vengono scelte in modo da massimizzare la quantità di sonda legata al bersaglio e ridurre il legame non specifico. La membrana viene quindi lavata per eliminare l eccesso di sonda non legato. L avvenuto legame viene evidenziato mediante autoradiografia (ovvero mettendo la membrana in contatto con una lastra da raggi X). 18

19 Differenti condizioni di ibridazione producono appaiamenti non corretti. Se si desidera ottenere solo l appaiamento alle sequenze target di DNA, la reazione di ibridazione viene condotta appena qualche grado al di sotto della temperatura di fusione della doppia elica (melting temperature). Quando la sonda di DNA viene usata per trovare DNA che sono correlati, ma non identici, alla sequenza, l ibridazione viene condotta a temperature più basse. Ciò consente l appaiamento imperfetto e la formazione della doppia elica. Solo le condizioni di ibridazione a bassa temperatura possono essere usate per cercare geni (C e E nell esempio) che sono simili ma non identici al gene A 19

20 In genere l ibridazione viene effettuata in condizioni di bassa stringenza, mentre i lavaggi hanno una stringenza via via più elevata (temperatura maggiore o salinità più bassa) Gel electrophoresis 10_05_gel.electrophor.jpg USI Identificare mutazioni, delezioni, riarrangiamenti genici Usato in prognosi di tumori e in diagnosi prenatale di malattie genetiche Leucemie Diagnosi di HIV-1 e malattie infettive 20

21 USI Ogni individuo possiede sequenze ripetute caratteristiche (chiamate Variable Number Tandem Repeats, VNTRs) Per trovare queste sequenze VNTR si usa il Southern. Northern blotting: La Tecnica Northern viene utilizzata per misurare quantitativamente un determinato mrna e valutare la dimensione di un mrna. Si segue all incirca la procedura del Southern, ma in questo caso si prepara un gel di agarosio denaturante (formaldeide, MOPS, ). Si carica l RNA denaturato (formaldeide e formammide) e si manda la corsa. Si ottiene una strisciata nella regione dei mrnas, infatti ho mrna di diversa lunghezza. Per vedere l mrnadi interesse, si effettua un trasferimento su nitrocellulosa o nylon, poi si fa ibridare una sonda radioattiva fatta con il gene di interesse. 21