Culture organotipiche di polmone embrionale di pollo

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1 Bolletino di zoologia ISSN: (Print) (Online) Journal homepage: Culture organotipiche di polmone embrionale di pollo Tommaso Alescio To cite this article: Tommaso Alescio (1959) Culture organotipiche di polmone embrionale di pollo, Bolletino di zoologia, 26:2, , DOI: / To link to this article: Published online: 14 Sep Submit your article to this journal Article views: 17 View related articles Citing articles: 1 View citing articles Full Terms & Conditions of access and use can be found at Download by: [ ] Date: 08 January 2016, At: 14:37

2 TOPrIMASO ALESCIO Divieione Biologica del Comitato Nazionale per le Ricerche nucleari Gruppo di ricerca per 1 Embriologia - Fraacati. (Roma) Culture orgaiiotipiche di polinone embrioiiale di pollo (Con 1 tav. f. testo) Rifcrisco nlcuni dati prcliminari, raccolti durante ricerclie tuttora in corso, riguartlanti le capaciti niorfogcncticlie dcl polrnonc embrionale di pollo isolato e coltivato in vitro. Queste riccrchc fanno partc di un piano di studio sugli effetti delle radiazioni ionizzanti sullo sviluppo embrionale clic tlovri svolgersi in cpesto laboratorio, e clic, proponendosi in particolarc il trattaimnto con radiazioni di organi sviluppantisi in vitro, presupponc anzitutto una conoscenza precisa del coniportainento in vitro tli organi non trattati. Le ricerclic riferite nella letteratura, riguartlanti lc modaliti tli sriluppo in vitro clel polinone cnil)rionale, sono state condotte sia su matcriale di mammiferi clic cli nccelli. L abbozzo clcl polnione tli ratto 6 statn coltivato in vitro per un periodo fli sei giorni da CIIEIV (1954) in un mezzo interainente liquid0 coinposto di siero e di estratto embrionale. Gli abbozzi, espiantati a1 tlecinio ginrno di gcstazionc quando erano costituiti tlalla trachea e clai due hronclii primari all inizio clclla suddivisione, si raniificarono in cultura produccnclo tre tipi cli dirarnazioni : bronchi rivestiti da epitelio cilintlrico ciliato, 1)roncliioli rivestiti da ccllulc epiteliali cilintlriclie ad unico strato,.e pneumonicri ad epitelio cihico semplice. SAIV~PAOLO e LOFFREDO SAMPAOLO ( 1958) ottennero dal polrnone tli fcti di cavia di 44 e 70 nim, coltivato con la tccnira di Fell c Robison per cpattro giorni, una huona soprayvivenza degli espianti nci quali progrediva il proccsso cli rarriificazinne (lei tuhli rnentre l cpitelio si differenziava acquistando la fnrnia piatta raratteristica tlella porzione respiratoria. DE JONG e DE HAAN (1943) coltivarono, con la lor0 tccnica di perfusione continua, il coniplcsso esofago-stomaco-trachea di em-

3 brioni di pollo cli eti conipresa fra i qiiattro etl i cinque giorni, ed osservarono la crescita c la raniificazione per clivisioiii dicotomiclie dei bronclii priinari, eon tenclenza alla dilatazione cis& c~el lor0 estremo terminale. Stadi piii avanzati cli eiiibrioni di pollo so110 stati studiati da LOFFREDO SAXIPAOLO e SAMPAOLO (1956:57-58), i qiiali coltivarono, second0 la teciiica di Fell e Robison, abbozzi di eti coinpresa fra sette ed undici giorni di incubazione, per uiia clurata fino a quindici giorni. La struttura istologica dell espianto si iiianteiinc inalterata per tutto il periodo di cultura sopratutto nclle porzioni piii periferich, e furono pure osservati yuadri di proliferazione cellulare, secrezione, sticotropismo. *** Le mie osservazioni sono state coiiipiiile sii ottantacinque abbozzi espiantati ad un eti coinpresa fra i qiiattro ccl i cinque giorni c mezzo di incubazione, e coltivati (la a sei giorni. Le culture sono state allestite nella niaggior parte (lei casi seconclo la tcciiica di FELL e O OBI SON (1929), in vetro da orologio su un coagulo coinposto da parti uguali di plasma di pollo aclulto e di estratto cli einbrioni tli pollo a1 nono giorno cli incubazioiie ; alciine vennero eseguite in goccia pendente SII vetrino coprioggetto. Sia le culture clie gli ahbozzi di varia eti non coltivati clie seriirono (la controllo, veiinero fissati in Susa o in Zenker e sezionati in scrie, previa inclusione in paraffina, a110 spcsore cli 6 11; le sezioiii sono state colorate con ematossilina-eosina o con il nietoclo Azaq. Le culture in goccia pendente furono colorate eon cariiialliiine e servirono per preparali in toto. I risultati ottennti Iianno diinostrato clie lo staclio piii adatto perclii l abbozzo cii polinone cii pollo bontinui in vitro il process0 di raiuificazione dei bronchi corrisponde a t~ucllo in ciii, a1 nioniento dell espianto, B appena iniziata l eniissione cli geniine (la parte dci bronchi primari, il clie avviene, tenuto conto tli iina notevole variabiliti individuale, all inizio del sesto giorno cli inculmzione. In cpcsti casi la geminazione prosegue in vitro con le niodaliti clie verranno clescritte, mentre se si parte (la uno stadio piii precocc, cioi: a1 quarto giorno, quando la gemrnazione i: aiicora incominciata, i I)ronclli, piir sopravviventlo abbastanza a lung0 senza subire processi regressivi, non si ramificano e non tli ratlo tcnclnno a clilatarsi.

4 A1 inomento tlell espianto l abbozzo del polmone k in generale niolto opaco, cosi (la lion permettere tli osscrvare direttamente a1 binociilare il grado di sviluppo tlell apparato broncliiale, clie deve essere allora declotto per analogia clall esanie clelle sezioni seriate clcgli abbozzi lion coltivati di pari eti. Esaniinato a1 (pinto giorno cli ineiil)azione, l abbozzo risulta costituito, come si ricava tlai clati clella letteratura sullo sviluppo tlell appareccliio respirntorio del pollo in conclizioni norinali ( LOCY- LARSELL 1916, LILLIE 1940) c clall csaine (lei prcparati di controllo da me eseguiti, (la uii tliverticolo entoclerniico tlclla faringe die rappresenta la trachea, suddiviso all cstremiti cauclalc in clue tubuli a fondo cieco, leggeriiicnte incurvati acl S, die costituiscono i due bronchi primari. Le lor0 pareti sono completamente lisce, ed il mesencliiina elm li avvolge insicnie alla tracliea risulta, nell immediata vicinanza (lei tubuli epitcliali clescritti, piii fittarncnte addensato a costituire uno spesso nianicotto continuo. La formazione dei Iironcl~i secontlari inizia clurante il sesto giorno di ineubazionc eon divisioni nionopodiclic in forriia di gemme cave die si distaccano tlal Iironco primario at1 angolo pressocli6 retto, a coniinciare clal limitc tra terzo superiore e terzo medio, e prosegue poi in tlirezione cautlale. I bronchi secondari lianno inizialmente la fornia cli bozze tondeggianti, ma hen presto si allungano anipliando la lor0 caviti fino ad assuniere l aspctto di saccoece clavate unite a1 bronco principale da un petluncolo piuttosto sottile. Istologicamente i Lronclii primari lianno una struttura analoga a quella della trachea, sono ciok costituiti tla un epitelio cilindrico a piii file di cellule, poggiante su menibrana basale. Numerose sono le cellule in mitosi clie appaiono spostate in posizioni superficiali verso il lume. I1 niesencliiina clie circonda il tuho epiteliale presenta iin iietto addensamento dclle proprie cellule attorno a1 tubulo stesso, mentre non si osservano ancora n6 ablozzi cartilaginci nc fibrocellule iiiuscolari. I bronchi secondari lianno un rivestirnento epiteliale piii sottile di quello dei bronchi prirnari, e costituito da un epitelio cilindrico monostratificato. L addensamento mesencliimale si conserva attorno alle ramificazioiii secondarie, ma il suo spessore k minore di quello clie avvolge i bronchi prirnari.

5 E noto clic l intero coiiiplcsso (lei bronchi sccondari pub essere suddiviso, a scconda clel purito d origine dci singoli bronchi e tlcll orientninento spaziale tla essi assunto nel corso dello sviluppo, in quattro gnippi clic sono stati cliiamati rispettivainente entobronchi, ectolronclii, dorsobronclii, laterobronchi. hii ii riuscito impossibile applicare ni quadri ottenuti in vitro la stessa tlistiiizioiic n causa dellc inevitabili dcforiiiazioiii clie le contlizioni di cultura iiiipriinono sull abbozzo. Per questc ragioni 110 cretluto tli (lover atlottare le denoiiiinazione coinplessiva tli bronchi secoiitlari. La formazione (lei bronchi secoiidari in cultura av\iciie in do iiiolto simile a quanto avviene nello sviluppo in contlizioiii noriiiali ; le sue fasi possoiio cssere seguite con l osservazione dirctta clclla cultura vivcntc, clie ii rcsa possibile dal fatto clic il iiicseiicliiiiia in cultura si rigonfia e diviene traslucido lnsciaiitlo trasparire in niodo nitido i contlotti epiteliali. Tali immagiiii, fis5atc mi prc1)aradi in toto conic q~icllo riprodotto iiella Fig. 1, diiiiostrnno, conic si i: detto, un quadro rriolto simile a qucllo tlcllo sviluppo iioriiiale: si tratta cioi: di divisioni monopodiclie del bronco primario con eriiissionc di gelnine cave. La lor0 struttura istologica, collie appare iiellc sezioni, si distiiigue da tpiella (lei I)ronclii primari per esscre l epitelio cilindrico moiiostratificato ; i: prescnte la iueiiilraria ljasalc, e le, nuiiierose cellule in initosi sono spostate in prossiiiiitl tlel luriie. In rnonienti successivi l epitclio tentle a niotlificarsi ultcrioriiiente clivcnendo cubic0 inonostratificato (Fig. 2). I1 fennineno saliente dcl scttiiiio ccl ottavo giorno tli sviluppo in condizioni naturali i: la forniazione dei bronclii terziari o parabronchi, contlotti cpitcliali tli cnlibro liniforiiie clic prcntloiio origiiie.dai bronchi secoiitlari in forma di gciiiiiie cave c clie coiitiiiuano a raiiiificarsi iiei giorni seguenti. Essi liaiiiio un rivestiincnto di cpitclio moiiostratificato ciliritlrico o cubico, soiio foriiiti cli 1iic111- brana basale, c soiio ancli cssi acconipagnati da un sottile iiiaiiicotto ni es en cli i iii a 1 e. La foriiiazione tlci bronchi terziari non pui, csscrc clirettaiiieiite seguita sulla cultura vivcnte, a causa dclla sovrapposizioiic cli ininiagini clie rende il quadro cosi complesso da iion poter esscrc clccifrato con l esame diretto a1 binoculare. D altra parte iiclle culture in goccia penrlente, clie evitlcntcmentc gotlono tli condizioni tli sviluppo

6 meno favorevoli, la differenziazionc non si 6 inai spinta oltre la forniazione di bronchi secondari. Comunque la forniazione dei hronchi terziari, come i: cliiaranientc dimostrato tlnll esaine dclle sezioni, inizia regolarriicnte nel corso rlel terzo giorno tli ciiltiira, ed avvicne per gemniazione (lei hronclii secontlari clie si sono ncl frattempo notcvolmciitc accrcsciiiti in cliinensioni prentlendo l aspctto cli saccoccc epiteliali tli varia forina. La lor0 forniazionc inizia percih pressappoco alla stessa epoca clie ncllc contlizioni noriiiali tli sviluppo e prosegue nel quarto e nel tpinto giorno di cultura (Fig. 3), ilia con tin ritino alquanto infcriorc a quello (lei corrispondenti nono c clcciiiio giorno cli sviluppo natiiralc, vale a dire clie coiiiplessivariientc si forma un numero tli Iwonclii terziari sensi1)iliiiente infcriore clie non in vivo n, anclic sc le iiiotlaliti di foriiiazionc sono apparcntcnicnte itlenticlie. Anclic il lor0 epitelio 2, C O I ~ nello sviluppo in conclizioni noturali, monostratificato. Un fatto anonialo osservabile in cultura 2: la differenziazione asiniinetrica dei bronclii priiiiari, nel scnso che inentre uno cli essi si rainifica nornialniente l altro piih arrcstnrc il proprio sviluppo in statli ancora arretrati. Ncl corso tiel sesto giorno tli ciiltiira si p~ih osscrvarc in sen0 a1 riicscncliiiiia la forniazioiie dei priitii esili fascetti tli fibrocelliile niuscolari lisce. L abbozzo tli polnione cnilwionale tli pollo si cliffcrenzia dunqiie in cultura, qmndo sia stato espiantato intorno a1 qninto giorno tli incubazione, sccondo iino sclieriia molto simile a qido clie iic regola lo sviluppo in condizioiii naturali, e ne ripcte molto (la vicino le caratteristiclie di clifferenziazionc istologica ; tuttavia il numero tli ramificnzioni (late tlall alliero 1)roncliialc riniane nettaniente a1 di sotto della nornia.

7 L A V O R I C I T A T I CEIES J i - The cultivation in fluid nicdium of organiseci liver, pail. crcas and other tissues of foetal rats. Exp. Cell. Hes., 7, DE JOSC B. J., DE 1IA.m J Organ and tissue differentiation in perfused cultures of cxplants froni the oesophagus-storiiacli-tracliea complex of young chicken embryos. dcto neer. Aforphol., 5, FFLL 11. B., ROBISOS R The growth, developnient and pliospliatase activity of embryonic avian fcniora and IirnL-buds cultivated in vitro. Diocliern. I., 23, LILLIE F. R The clcvclopnicnt of the chick. h cw York. LOGY W. A, LARSELL The ed>ryolopy of the liirils lungs, Iiasctl on ohservation of thc domestic fowl. Am. J, Annt., 19, W dni. 1. Anot., 20, LOFFREDO S.WPAOLO C., S.iairaoLo G proposito tlella coltivazione di abbozzi cornpleti di organi: ahui aspctti istologici del pohione di embrione di pollo coltivato in vitro. Rend. Acc. Sc. rnetl. chir. A npoli, 110, _, Culture organotipiclic di polmonc cnibrionalc di pollo. Alcuni aspetti istolopici ctl istocliiniici. Doll. SOC. itnl. Iliol. sper., 32, , Intlnpini sulla cliffcrcnziazione in cultura orpnotipira della trachea cli rnihrioni cli pollo. Boll. Sor. itnl. niol. sper., 33, , Alciini aspetti istolopici clclla trachca in culturc organotipiche di apparato rcspiratorio cli cmhrioni cli pollo. Rend Arc. Sc. ntetf. chir. A opoli, 111, Les aspects histologiqucs cle I apparcil rcspiratoirc dans -- --_ l emliryon dc poulet aprk culture in vitro. C. R. Ass. Ifnot.! 99, 418-i60. -_, La trachea cli fcti cli cavia in eultura organotipica. Indafine sugli aspetti istologici, sugli attcgginnicnti morfogenetiei e sulla clilfercnziazione in vitro clell epitelio e c ilella cartilaginc. Quotlerni Anof. prutico, 11, Osscrvazioni istologirhe polnione cli fcti cli ravia coltivato in vitro. Quoderni Annt. protico, 1.1,

8 R I A S S U X T O Aliliozzi polnionari cli cmlirione cli pnllo sono stati cspiantati tra i 4 e i 5% piorni cli inculiazione e coltirati in vitro con ii metodo della culturn organotipica per tin periotlo massimo di sei giorni. L'abhozzo continua in ritro il proccsso di ramificazione dei bronchi quando a1 momento clcll'cspianto esso sia gii iniziato. La ramificazione bronchiale in cultura i molto simile a quclla chc si osscna in contlizioni natorali, e pub giungcre fino alla formazione dei parabronchi. L'epitelio bronrhiale si mantiene eilindrico plnriseriato nci bronchi primari, mcntre dibirnc nionostralificato nei bronchi sccondari e terziari. R'el corso dcl wstn giorno tli rnltura si formnno in scno a1 mesenchima le prime ccllule muscolari lisce. S U A1 A1 ti R Y Lung rudiments from chick cnibryos wcre explantea at' stages betm-een 4 antl 51/z days of inruliation antl cnlturccl in vitro by the method for organotypie rulture for it maximum nf 6 days. Lung rutlimcrit continues in vitro the ramification process when this has already Iiegnn at explantation time. The general Lchariniir of the branching prorcss is very similar to what nrrnrs in natural conditions, and may go as far as the formation of paral~ronchi. The Iironrhial epithelium remains pse~rdostratified columnar in primary Iironrhi, whcrcas it lieconies simple in secondary antl tertiary hrnnrhi. During the 6th 'day of cnltnre the first smooth muscle fibrcs arc formcrl.

9 SPIEGAZIONE DELLA TAVOLA Fig Atibozzo tli polnionc rapiantato a.i giorni e 5 ore tli incubazionc c coltivato per 1 giorno c 17 ore. Dai Iironchi primari, a1 cui cstremo si 6 foimato I abliozzo clrl sacra acrifcro atldominalc, si sono originati numcrosi bronchi sccontlari. Susa. Carmalliinic. Prcparato in toto. 26x. Fig Atiliozzo cli polmoiic cepiantato a 5 giorni c 5 nrc di inculiazionc c coltivato per 1 giorno e 2 cre. I1 lironco primaria, in baso. ha un cpitelio alto a niolte filc cli rclltilr; in alto 1111 bronro sccoritlario con cpitrlio nionostratifirato. Zrnker. Ematossilina-rodna. Sczionc. 316%. Fig Abbozzo cli poliiione cspiantatn a I ginrni r 20 ore cli incubazionc e roltivato prr 1 ginrni c. 22 ore. 11 Iironco primaria, situato in liascn a destra, ha dato origine ad un bronco sccondario che si dirigc in alto e poi a sinistra. Da csso clerirano acl angolo retto nitrnerosi rami tcrziari. Zenhcr. Emalossilina-cosina. Sczione. 172x.

10 r. - 'I: