Institute of Neurobiology and Molecular Medicine

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1 CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare Institute of Neurobiology and Molecular Medicine Via del Fosso del Cavaliere Roma, Italy E mail: antonella.lisi@artov.inmm.cnr.it Fax: Tel: Ricerca: B1 45/DIPIA/04 Analisi delle modificazioni pr odotte a seguito di esposizioni pr olungate e contr ollate a campi elettrici e magnetici nelle bande ELF e VLF sul processo di sviluppo di popolazioni biologiche RELAZIONE Per lo studio e l analisi delle modificazioni prodotte a seguito di esposizioni prolungate e controllate a campi elettrici e magnetici nelle bande ELF e VLF sul processo di sviluppo di popolazioni biologiche abbiamo utilizzato differenti popolazioni di cellule staminali. 1 Che cosa sono le cellule staminali? Sono definite cellule staminali quelle cellule che presentano un basso o quasi assente livello di maturazione e di specializzazione ma che mantengono la potenzialità di differenziare e dare origine a diversi tipi di tessuto. In base a questa proprietà, le cellule staminali si distinguono in diverse coorti: cellule staminali totipotenti, identiche e non specializzate, da esse si può ottenere qualsiasi tipo di tessuto; cellule staminali pluripotenti, sono in grado di dare origine solo ad alcuni tipi di cellule o tessuti; cellule staminali unipotenti, possono dare origine ad un solo tipo cellulare; Queste cellule sono oggi considerate fondamentali per la ricerca biomedica, in quanto si ritiene che possano essere usate per la cura di diversi stati patologici.

2 A seconda della fonte di origine esistono diversi tipi di cellule staminali: cellule staminali embrionali eterologhe sono cellule staminali totipotenti che vengono isolate dall embrione nelle primissime fasi dello sviluppo. Ad oggi i metodi di coltivazione messi a punto permettono di trasformarle in diversi tipi di cellule nervose e in cellule progenitrici del sangue; cellule staminali autologhe sono isolate a seguito del trasferimento del nucleo di una cellula somatica adulta in una cellula uovo privata del suo nucleo. In tal modo si ottengono cellule dotate dello stesso patrimonio genetico del donatore e possono essere trapiantate senza pericolo di rigetto; cellule staminali fetali sono cellule staminali pluripotenti derivate da aborti, ma gli studi ad oggi disponibili non permettono di trarre conclusioni definitive sulla loro capacità di originare tessuti; cellule staminali da cordone ombelicale sono cellule staminali provenienti dal sangue del cordone ombelicale, che si sono dimostrate in grado di dare origine a cellule del sangue per la cura di problemi quali la leucemia e alcuni disturbi genetici ed immunitari. Si ritiene che le staminali da cordone ombelicale potranno essere usate anche per la cura di lesioni vascolari o cerebrali, diabete, morbo di Parkinson, distrofia muscolare; cellule staminali da adulto derivano dal midollo osseo dell individuo adulto, vengono impiegate per l autotrapianto delle cellule emopoietiche (per riparare danni provocati da chemioterapia e radioterapia), per la cura di varie forme di tumori e leucemie. Inoltre alcuni ricercatori statunitensi avrebbero di recente identificato nel tessuto adiposo dell adulto un altra fonte di cellule staminali. 2 Campi d applicazione delle cellule staminali. Pur essendo ad oggi l impiego delle cellule staminali embrionali molto più facile e di maggior successo, i problemi etici derivanti dalla fonte d origine di queste cellule (l embrione) spinge il mondo scientifico all uso di cellule staminali provenienti da

3 cordone ombelicale e da adulto. Lo sviluppo di tecniche di prelievo e di coltivazione standardizzate di staminali non embrionali, oltre a mettere fine alle polemiche di tipo etico, permetterebbe infatti di ottenere risultati ottimali nella cura e nella terapia di patologie gravi quali: leucemie, malattie genetiche (talassemia), lesioni estese della cute o della mucosa a seguito di ustioni, lesioni diabetiche, neoplasie cutanee, lesioni del midollo spinale, malattie neurodegenerative (morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, slerosi laterale amiotrofica, malattie da danno ischemico), malattie muscolo scheletriche (displasia ossea, malattie progressive delle giunzioni ossee, osteogenesi imperfetta, miopatie primitive), malattie degenerative della retina, della cornea e dell apparato uditivo, tessuto cardiaco danneggiato da infarto acuto del miocardio, vasi sanguigni danneggiati da processi patologici progressivi come l arteriosclerosi e l ipertensione, terapia cellulare sostitutiva contro malattie metaboliche tipo lisosomali. Le cellule staminali sembrano inoltre essere le cellule ideali da utilizzare per la terapia genica, in quanto sono in grado di accettare e tollerare, molto meglio di cellule mature, geni introdotti con tecniche di ingegneria genetica, per la correzione dell effetto patologico di geni difettosi o mutati.

4 Sistema espositivo: Il sistema espositivo utilizzato in questa ricerca è stato progettato e realizzato come di seguito descritto. Cellule staminali mesenchimali e cardiache e sono state collocate all interno di un incubatore per cellule (vedi specifiche più avanti) e cronicamente esposte fino a 5 giorni a due differenti tipi di campo magnetico. Le cellule mesenchimali sono state esposte ad un campo elettromagnetico ELF di 50Hz, 1mT, mentre le cardiache sono state simultaneamente esposte ad un campo magnetico statico ed uno alternato alla frequenza di risonanza di ciclotrone dello ione Ca 2+ (VLF). Tutta la strumentazione per generare i suddetti campi magnetici, da noi realizzata, è stata installata in una camera amagnetica. L attrezzatura comprende anche un incubatore cellulare costruito in materiale amagnetico dove, la temperatura (37± 0.1 C), la CO2 (5% ) e l umidità erano continuamente controllate e registrate attraverso uno specifico software. Il campo magnetico statico e alternato venivano costantemente monitorati con sonda MAG 03 MC70 ed elaborati con un software appositamente compilato. Ulteriori dettagli sono stati descritti nel brevetto a copertura mondiale ISPESL CNR N MI2005A Il corpo centrale dello strumento è costituito da solenoide formato da un cilindro in PVC spesso 5mm, di 33cm di diametro e lungo 3m, ed assemblato da spire di rame di 1mm di diametro. Il solenoide è alimentato da 3 amplificatori e un generatore di segnale che produce corrente statica ed alternata per la produzione dei campi magnetici sopra citati. Questo strumento e in grado di produrre frequenze nel range comprese tra 0.01Hz 1KHz e campi magnetici tra 10nT 1mT. Ulteriori dettagli sono stati descritti nel brevetto a copertura mondiale ISPESL CNR N MI2005A

5 Razionale della ricerca: Il primo modello sperimentale da noi utilizzato per lo studio e l analisi delle modificazioni e/o danni prodotti a seguito di esposizioni prolungate e controllate a campi elettrici e magnetici in vitro è rappresentato da una popolazione di cellule mensenchimali derivanti da espianti di midollo osseo umano. Come noto i progenitori degli osteoblasti sono cellule mesenchimali indifferenziate con sede nel compartimento stromale del midollo osseo (BMSC, bone marrow stromal cells). Le BMSC sono capaci di differenziare in diverse linee cellulari: osteoblasti, condrociti, adipociti, miociti. Se impiantate in vivo, queste cellule sono capaci di ricostituire tessuto osseo ed in alcune condizioni cartilagine. Dal punto di vista istologico il tessuto osseo é costituito da tessuto connettivo, la cui componente cellulare é immersa nella sostanza fondamentale, rappresentata da fibre di collagene (soprattutto fibre di tipo I) e sostanza amorfa. Le cellule del tessuto osseo sono gli osteoclasti, gli osteoblasti e gli osteociti. La componente amorfa è costituita da un gruppo di molecole proprie della matrice e da molecole provenienti dal plasma circolante. Il reclutamento di osteoblasti da precursori mesenchimali è un altro step fondamentale nei processi di formazione, rimodellamento e riparazione del tessuto osseo ed è a tale livello che il controllo di fattori quali glucocorticoidi, prostaglandine, citochine e BMP (Bone morphogenetic protein), svolge un ruolo determinante. L'osso è continuamente sottoposto a cicli di "remodeling", che implicano il riassorbimento del tessuto vecchio da parte degli osteoclasti e la successiva formazione di nuovo tessuto da parte degli osteoblasti. Le cellule osteoblastiche, pertanto, sono presenti come un insieme di numerosi stadi di differenziamento funzionale (cellule mesenchimali staminali, preosteoblasti, osteoblasti, osteociti), a ciascuno dei quali corrisponde un diverso fenotipo (morfologico, biochimico ecc). Specifici fattori (sistemici e locali) di crescita e di differenziamento sembrano svolgere un ruolo fondamentale nello sviluppo dell'osso. Tra essi un ruolo particolarmente importante sembra essere quello svolto dai membri della famiglia

6 TGF beta che hanno importanti effetti su crescita e differenziamento cellulare sia agendo direttamente (bloccando la transizione G1 >S) che indirettamente "perturbando" l'espressione di fattori di crescita autocrini. Gli Indici di formazione ossea che vengono più spesso utilizzati come marcatori sono rappresentati o da enzimi di cellule coinvolte nel processo di rimodellamento o da componenti della matrice ossea neoformati e/o riassorbiti. A tale scopo è possibile valutare sia le attività enzimatiche degli osteoclasti (fosfatasi acida tartrato resistente) e degli osteoblasti (fosfatasi alcalina), che le componenti della matrice ossea prodotte dagli osteoblasti (peptide C terminale del procollageno I, osteocalcina), oltre ai frammenti della degradazione operata dagli osteoclasti (idrossiprolina, piridinolina, galattosil idrossilisina). Il secondo modello sperimentale da noi utilizzato è rappresentato da cellule staminali cardiache. Queste cellule sono state prelevate e messe in coltura secondo lo schema e il protocollo seguente: 1) Biopsia 2) Piastramento 3) Formazione 4) Cardiosfere cardiosfere 5) Cellule derivate dalle cardiosfere 6) Esposizione 1. Campioni di biopsie umane, ottenuti da pazienti sottoposti a biopsia endomiocardiale percutanea effettuata a scopo terapeutico sono stati processati. In breve, i campioni sono stati ridotti in frammenti, lavati, sottoposti a parziale digestione enzimatica e le cellule singole sono state eliminate.

7 2. I frammenti di tessuto così ottenuti sono stati messi in coltura su piastre. Dopo giorni dalla biopsia, le cellule derivanti dal tessuto stesso hanno proliferato formando un monostrato sul fondo della piastra. 3. Le cellule formatesi attorno all espianto sono state isolate, inizialmente dopo 5 7 giorni ed in seguito ogni 4 5 giorni, per un totale di 4 prelievi. 4. Le cellule cresciute in sospensione hanno formato Cardiosfere. 5. Nei giorni successivi, alcune cellule sono rimaste adese alla superficie della piastra rivestita di poly D lisina mentre altre si sono staccate dal monostrato (Cardiosfere); quest ultime, una volta piastrate in fiasche rivestite di Fibronectina, si sono espanse a formare un monostrato aderente (cellule derivate dai cardiomiociti, CDCs). Lo scopo della ricerca e' stato il seguente: 1) messa a punto di condizioni di coltura che permettano l'isolamento e l'espansione delle cellule provenienti da espianti di tessuto e midollo osseo umano; 2) caratterizzazione cellulare e molecolare delle modificazioni e/o danni prodotti da una esposizione prolungata e controllata a campi elettrici e magnetici nelle bande ELF e VLF sul processo di proliferazione e/o differenziamento delle BMSC e delle cardiosfere. Su tali modelli sperimentali sono stati condotti studi volti ad analizzare le modificazioni prodotte dall esposizione durante il differenziamento e la proliferazione dei precursori degli osteoblasti e dei cardiomiociti analizzando le varie fasi che costituiscono il delicato e complicato processo di differenziamento. Sulla base di tali presupposti il nostro studio è stato eseguito secondo lo schema sotto riportato: 1) analizzare l'effetto dell'esposizione prolungata a campi magnetici (ELF, VLF) durante:

8 a) proliferazione degli osteoblasti e dei precursori delle cellule cardiache b) differenziamento delle cellule cardioprogenitrici >cardiomiociti c) differenziamento osteoblasti > osteociti; 2) valutare l'effetto sinergico di varie molecole come, TGF b, BMP, vit.d3, acido retinoico, estrogeni e dexametasone durante l esposizione degli osteoblasti; 3) rilevare e dosare indici di formazione ossea quali Fosfatasi Alcalina e marker precoci di differenziamento osteocitico quali Osteocalcina durante l esposizione. 4) rilevare e dosare marker precoci e tardivi del differenziamento cardiaco quali, la Troponina I (TnI), il Dominio Chinasico del Recettore (KDR) e l nkx 2,5.

9 Risultati Il primo scopo del nostro studio è stato quello di mettere a punto un protocollo sperimentale che permetta l isolamento e l espansione delle due popolazioni cellulari. L ottenimento di questo risultato ci ha permesso di continuare la nostra ricerca ed è stato possibile condurre su queste cellule studi morfologici, biochimici e molecolari durante l esposizione prolungata a campi magnetici. Effetto dei campi ELF sulla crescita cellulare In figura 1 è possibile vedere la curva di crescita relativa alle cellule mesenchimali in presenza dei vari trattamenti. E interessante notare che nelle cellule cronicamente esposte (Exp) si ha una diminuzione della crescita rispetto alle cellule di controllo (CTR). In particolare questo fenomeno diventerebbe più evidente quando le cellule sono esposte in simultanea al trattamento con il dexametasone (E+D). Effetto dei campi ELF sulla polimerizzazione dell actina Nella Fig. 2 è riportata l organizzazione del citoscheletro di cellule staminali osteoprogenitrici vista con il microscopio confocale dopo 5 giorni di esposizione cronica a campi magnetici. La polimerizzazione dell actina nelle cellule esposte (EXP) risulta alterata rispetto alle cellule di controllo (Control). Mentre in quest ultime infatti, l actina è principalmente addensata a livello delle membrana citoplasmatica nelle cellule esposte è sia distribuita uniformemente su tutto il perimetro cellulare sia organizzata in grossi fasci. Come controllo positivo dell avvenuto differenziamento abbiamo usato il Dexametasone (Dexa). Si vede chiaramente in Fig. 2 come l effetto del differenziante chimico è simile a quello della prolungata esposizione ai campi magnetici ELF. E interessante notare infine, e questo confermerebbe quanto visto in figura 1, che anche in questo esperimento i campi sembrerebbero avere un effetto sinergizzante con il desamentasone (EXP+DX).

10 Effetto dei campi ELF sulla morfologia cellulare Una esposizione prolungata fino a 5 giorni induce inoltre nelle queste cellule staminali anche un cambiamento conformazionale ben visibile in Fig. 3. Al microscopio elettronico a trasmissione è possibile vedere che le cellule esposte (EXP) assumono una forma poligonale rispetto alle cellule di controllo che hanno invece una forma più allungata (CTR). Anche in questo esperimento l uso sinergico del differenziante chimico potenzia l effetto del campo magnetico (Exp+Dexa). Fig. 1

11 Fig. 2

12 Fig. 3 Effetto dei campi ELF sull espressione di marker proteici di differenziamento

13 Al fine di studiare eventuali variazione biochimiche correlate a variazioni conformazionali e di citoscheletro messe in evidenza durante i primi esperimenti siamo andati a saggiare nelle cellule staminali osteoprogenitrici l espressione di marcatori specifici legati al differenziamento. In particolare tramite Innunofluorescenza indiretta (Fig. 4) abbiamo registrato l aumento della sintesi di una proteina, l osteopontina, nelle cellule staminali cronicamente esposte ( Exp) rispetto ai controlli (CRT). Come si può vedere, la sintesi di osteopontina risulta aumenta nella zona perinucleare delle cellule trattate contemporaneamente con il dexametasone ed il campo magnetico( Exp+DX).

14 Fig.4

15 Effetto dei campi ELF sull espressione genica Mediante Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT PCR) abbiamo infine studiato l espressione dei marcatori del differenziamento osteocitico come indici di formazione ossea. Come si vede dalla figura sottostante le cellule esposte mostrano una precoce espressione dei marcatori del differenziamento osteocitico rispetto alle cellule di controllo. In particolare dopo 11 giorni di esposizione al campo si ha un aumento nella sintesi di RNA messaggero (mrna) per i geni della fosfatasi alcalina (AP), dell osteocalcina (OCL) e dell osteopontina (OPN).

16 Fig. 5

17 Da un punto di vista sperimentale si è visto che campi VLF anche di debole intensità possono su alcuni modelli sperimentali agire sull omeostasi del calcio. Nel 1985 Liboff e Blackman elaborarono la teoria fisicamente accettata per cui un campo statico in combinazione con un campo dinamico anche se di debole intensità (alla risonanza di ciclotrone di ioni o molecole di interesse biologico) avrebbero fornito al sistema biologico energia sufficiente a modificarne alcuni parametri biologici. Successivamente Zhadin dimostrò come tale effetto può essere verificato in pratica su ioni in soluzione. In base a questa teoria abbiamo esposto cellule staminali cardiache a campi VLF alla frequenza di risonanza degli ioni calcio. Effetto dei campi VLF sulla crescita cellulare In fig. 6 è riportata la curva di crescita delle cellule staminali cardiache. L esposizione ai campi VLF induce nelle cardiosfere un aumento dell attività proliferativa rispetto alle stesse di controllo. Le cellule esposte infatti, curva rossa, cresciute sia in fibronectina che in polylisina presentano una maggiore crescita cellulare per tutti i giorni dell esperimento.

18 Fig. 6 Esposto Fibronectina WST 8 Controllo Poly D Lisina Giorni Giorni Effetto dei campi VLF sulla modulazione dell espressione di marker di differenziamento cardiaco L esposizione delle cardiosfere a campo magnetico VLF modula il differenziamento cardiaco. Il saggio di immunoistochimica in Fig. 7 mette in evidenza una sovraespressione del marcatore cardiaco Troponina I (TnI) dopo 5 giorni di esposizione; per contro il Dominio Chinasico del Recettore (KDR), marcatore angiogenico, risulta essere sottoespresso.

19 Fig. 7 c T n I Esposti Contr olli Unexpo sed K D R Effetto dei campi VLF sull espressione genica Mediante tecniche di Real Time PCR abbiamo messo in evidenza nelle cardiosfere esposte a campi VLF un aumento degli RNA messaggeri della troponina e l nkx 2,5. Questo effetto come si può vedere in Fig. 8 è presente su cellule cresciute sia in fibronectina che in polylisina. L incremento in mrna, dimostrato dalla RT PCR, è stato poi confermato da un incremento nell espressione delle proteine. Le Cardiosfere differenziano spontaneamente nel fenotipo cardiogenico. Il differenziamento è accelerato in seguito all esposizione ai campi magnetici VLF.

20 Fig. 8 Polylisina 5 Giorni Incremento dell'mrna 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 troponina nkx2,5 vegf ctr exp Fibronectina 5 Giorni 3 Incremento dell'mrna 2,5 2 1,5 1 0,5 ctr exp 0 troponina nkx2,5 vegf

21 In conclusione questa ricerca, grazie alla messa a punto di protocolli sperimentali che permettono l'isolamento e l'espansione delle cellule provenienti da espianti di tessuto umano evidenzia la possibilità di utilizzare campi controllati alle basse frequenze ELF e VLF come protocolli terapeutici per il differenziamento di cellule staminali. Il responsabile scientifico Dr.ssa Antonella Lisi