17-OH-Progesterone ELISA

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1 Istruzioni per l Uso 17-OH-Progesterone ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro quantitativa di 17-OH-progesterone in siero e plasma umano. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro quantitativa di 17-OH-progesterone in siero e plasma umano. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI L ormone steroideo progesterone 17-OH (17-OHP) è prodotto nella corteccia surrenalica e nelle gonadi. L azione gestagenica esercitata dal 17-OHP è modesta. Quest ormone è tuttavia significativo dal punto di vista clinico in quanto rappresenta il principale precursore del11β-desossicortisolo (composti, CpS). Il CpS si forma per idrossilazione dell atomo di carbonio C 21. L attività enzimatica della 21 idrossilasi nella corteccia surrenalica si può quindi monitorare analizzando il livello di 17-OHP nel sangue. Il deficit di 21 idrossilasi, che si riscontra normalmente nell iperplasia surrenalica congenita, causa una secrezione eccessiva di 17-OHP e, di conseguenza, valori ematici superiori alla media. Il deficit di 11- idrossilasi, comunque, causa un alterazione solo moderata di 17-OHP. L analisi dell ormone steroideo è quindi significativa nella diagnosi differenziata dell iperplasia surrenalica congenita. Nelle donne adulte, non in stato di gravidanza, i livelli di 17-OHP nel sangue dipendono dalla fase del ciclo mestruale. Come il progesterone, il 17-OHP è secreto dal follicolo maturo e dal corpus luteum. Le concentrazioni in generale sono maggiori dopo l ovulazione. I livelli di 17-OHP vengono inoltre influenzati dai ritmi giornalieri che sono correlati alla secrezione surrenale di cortisolo. Livellli massimi di 17-OHP si riscontrano in campioni raccolti tra le e le 8.00 del mattino. Negli uomini adulti esistono scarse indicazioni riguardo a simili fluttuazioni dei livelli di 17-OHP. Durante la gravidanza feto, placenta e corteccia surrenalica producono grandi quantità di 17-OHP. L ormone è secreto nella circolazione sanguigna fetale e materna. I valori di 17-OHP nella madre aumentano notevolmente dopo la 32 settimana di gravidanza, raggiungendo livelli 4 volte superiori rispetto alla fase luteale del ciclo mestruale. Il 17-OHP si riscontra anche nel cordone ombelicale del neonato. 3. PRINCIPIO DEL TEST Test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio di competizione. Una quantità sconosciuta dell antigene presente nel campione e una quantità fissa di antigene legato all enzima competono per i siti di legame sugli anticorpi che rivestono i pozzetti. Dopo incubazione i pozzetti vengono lavati per bloccare la reazione di competizione. Successivamente alla reazione del substrato l intensità del colore sviluppato è inversamente proporzionale alla quantità dell antigene presente nel campione. I risultati dei campioni possono essere determinati direttamente usando la curva standard. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. Version / 5

3 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero, Plasma (EDTA) Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Conservazione: 2-8 C -20 C (Aliquote) Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Stabilità: 7 giorni 3 mesi Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 20 ml ENZCONJ 1 x 2.0 ml 6 x 1.0 ml CAL A-G 2 x 1.0 ml CONTROL x 50 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Micropiastra Strisce separabili. Coniugato con anti-coniglio IgG. (capra, policlonale), 17-OH-Progesterone Antisiero. Coniugato Enzimatico Di Colore Giallo. Pronto/a all uso. Contiene: 17-OH-Progesterone, coniugato a HRP, tampone fosfato, stabilizzatori. Standard A-G 0; 0.15; 0.5; 1.5; 3.0; 7.5; 20 ng/ml 0.45; 1.5; 4.5; 9.1; 22.7; 60.6 nmol/l Pronto/a all uso. Standard A = Zero Standard (siero privo di steroidi). Contiene: 17-OH-Progesterone, Siero umano, stabilizzatori. Controllo 1+2 Pronto/a all uso. Per le concentrazioni /gli intervalli accettabili vedere le etichette sulle provette. Tampone Lavaggio Concentrato (20x) Contiene: tampone fosfato, Tween, stabilizzatori. Soluzione Substrato TMB Pronto/a all uso. Contiene: TMB, Tampone, stabilizzatori. Soluzione Stop TMB Pronto/a all uso. 1 M H 2SO 4. 3 x FOIL Pellicola Adesiva 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 5; 25; 50; 100; 500 µl 2. Vortex mixer 3. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 4. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 5. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 6. Acqua bidistillata o deionizzata 7. Carta assorbente, puntali per pipette e timer Version / 5

4 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 8. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati Diluire / dissolvere Componente Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 15 ml WASHBUF CONC fino a 300 ml acqua bidist. 1:20 Mescolare energicamente. 2-8 C 4 settimane Diluizione dei Campioni I campioni sospettati di avere una concentrazione superiore a quella dello standard con concentrazione più alta devono essere diluiti con Standard A. 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 25 µl di Standard, Controllo e campione nei rispettivi pozzetti della Piastra Microtiter. 2. Pipettare 200 µl di Coniugato Enzimatico in ogni pozzetto. 3. Coprire la piastra con pellicola adesiva. Agitare delicatamente la piastra. Incubare 60 min a TA (18-25 C). 4. Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 5. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento positivo ed evitare la formazione di bolle d aria. 6. Pipettare 100 µl di Soluzione Substrato TMB in ogni pozzetto. 7. Incubare 30 min a TA (18-25 C). 8. Fermare la reazione substrato aggiungendo 100 µl di Soluzione Stop TMB in ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 9. Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 ± 10 nm (Lunghezza d onda di riferimento: nm) entro 30 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop. Version / 5

5 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. Conversione: 17-OH-Progesterone (ng/ml) x 3.03 = nmol/l Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard 17-OH- Progesterone (ng/ml) DO Media DO/DO max (%) A B C D E F G (OD) OH-Progesterone ELISA (ng/ml) 14. VALORI ATTESI I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori: 17-OH-Progesterone (ng/ml) Donne Uomini Phase Media Intervallo N Media Intervallo N Fase Follicolare Fase Luteale dopo stimolazione ACTH 1.4 < 3 17 Gravidanza (terzo trimestre) Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento LIMITI DELLA PROCEDURA I seguenti componenti del sangue non hanno effetto significativo (+/-20%) sui risultati del test fino ai livelli di concentrazione riportati in tabella: Emoglobina Bilirubina Trigliceridi 8.33 mg/ml 0.33 mg/ml 0.25 mg/ml Version / 5

6 16. PERFORMANCE Specificità Analitica (Reattività Crociate) Sostanza Reattività Crociate (%) 17α-OH-Pregnenolone 1.7 Progesterone Desossi-Cortisolo 1.3 Desossi-Corticosterone 0.12 Cortisolo Pregnenolone Sensibilità Analitica (Limite di Rilevazione) Precisione Intervallo (ng/ml) CV (%) Intra-Saggio Inter-Saggio Linearità Recupero Metodo di Paragone verso GCMS 0.03 ng/ml Media (Zero-Standard) - 2SD Intervallo (ng/ml) Diluizioni Seriali fino a Intervallo (%) : Media (%) Intervallo (%) % Recupero dopo i picchi Test IBL = 1.31 x GCMS 0.45 r = 0.94; n = 22 Cross-reattività di altre sostanze esaminate % 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Sahin Y and Kelestimur F. 17-Hydroxyprogesterone responses to gonadotrophin-releasing hormone agonist buserelin and adrenocorticotrophin in polycystic ovary syndrome: investigation of adrenal and ovarian cytochrome P450c17alpha dysregulation. Hum. Reprod., 12: (1997) 2. Liovic M et al. CYP17 gene analysis in hyperandrogenised women with and without exaggerated 17- hydroxyprogesterone response to ovarian stimulation. J. Endocrinol. Invest., 20: (1997) 3. Oriola J et al. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene. Clin. Chem., 43: (1997) 4. Ibanez L et al. Ovarian 17-hydroxyprogesterone hyperresponsive-ness to gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist challenge in women with polycystic ovary syndrome is not mediated by luteinizing hormone hypersecretion: evidence from GnRH agonist and human chorionic gonadotropin stimulation testing. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: (1996) 5. Bernini GP et al. 17-Hydroxyprogesterone response to ACTH in bilateral and monolateral adrenal incidentalomas. J. Endocrinol. Invest., 19: (1996) J. Assist. Reprod. Genet., 13: (1996) 6. Glock Jl et al. The relationship of corpus luteum volume to relaxin, estradiol, progesterone, 17- hydroxyprogesterone and human chorionic gonadotropin levels in early normal pregnancy. Early Pregnancy, 1: (1995) 7. Berkow R, Fletcher AJ, Beers MH.Congenital Adrenal Hyperplasia. In The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, pp , Merck & Co., Inc., 16th edition Chrousos GP, Loriaux DL, Mann DL, Cutler GB. Lateonset 21-Hydroxylase deficiency mimicking idiopathic hirsutism or polycystic ovarian disease. Ann. Int. Med. 96: 143 (1982). 9. Schnakenburg K, Bindlingmaier F, Knorr D. 17-hydroxy-progesterone, androstendione, and testosterone in normal children and in prepubertal patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur. J. Pediatr. 133: 259 (1980). Version / 5

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8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: WEB: Tel.: +1 (416) Fax: WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /

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