La spettrometria di massa nell analisi di steroidi anabolizzanti

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Aloisio Cortese
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1 La spettrometria di massa nell analisi di steroidi anabolizzanti Silvia Persichilli Laboratorio Analisi I Policlinico Universitario Agostino Gemelli Roma

2 Una corsa senza fine Steroidi anabolizzanti e doping sportivo L anti-doping: ricerca diretta e indiretta L arma: spettrometria di massa

3 Storia del doping Antichità (776 a.c d.c.) Gli atleti assumevano bevande ed estratti vegetali prima delle competizioni per migliorare le prestazioni 1896 Primo caso accertato il ciclista Arthur Linton, durante la corsa Bordeaux- Parigi, viene colpito da una crisi cardiaca in seguito ad overdose di stimolanti 1900 Utilizzo di stimolanti durante le competizioni Doping di stato: Steroidi anabolizzanti, ormone della crescita 1967 Tommy Simpson muore al Tour de France, a causa di un collasso cardiocircolatorio poco dopo aver completato la sua prova. Fu riscontrato un mix letale di etere e cocaina Il Comitato Internazionale Olimpico (CIO) pubblica la prima definizione di doping e la prima lista di sostanze vietate, introducendo i controlli obbligatori alle Olimpiadi 1988 Alle Olimpiadi di Seul, Ben Johnson viene squalificato dopo aver vinto i 100m con il primato del mondo (9.79). Gli furono cancellati anche titolo mondiale e primato del 1987 dopo sua confessione 2003 A seguito dello scandalo Balco, 20 atleti sono riscontrati positivi al THG 2012 Lance Armstrong viene privato di tutti i titoli conquistati dalla UCI, inclusi sette Tour de France consecutivi, per quello definito come «serial cheat who led the most sophisticated, professionalised and successful doping programme that sport has ever seen

4 Definizione di «doping» Legge 14 dicembre 2000, n. 376 «Disciplina della tutela sanitaria delle attività sportive e della lotta contro il doping» Art 2. Costituiscono doping la somministrazione o l assunzione di farmaci o di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive e l adozione o la sottoposizione a pratiche mediche non giustificate da condizioni patologiche ed idonee a modificare le condizioni psicofisiche o biologiche dell organismo al fine di alterare le prestazioni agonistiche degli atleti. Art. 3. Ai fini della presente legge sono equiparate al doping la somministrazione di farmaci o di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive e l adozione di pratiche mediche non giustificate da condizioni patologiche, finalizzate e comunque idonee a modificare i risultati dei controlli sull uso dei farmaci, delle sostanze e delle pratiche indicati nel comma 2.

condizioni patologiche ed idonee a modificare le condizioni psicofisiche o biologiche dell organismo al fine di alterare le prestazioni agonistiche degli atleti. Art. 3.

5 Definizione di «doping» World Anti Doping Agency (agenzia del Comitato Internazionale Olimpico) Presenza di sostanze proibite, metaboliti o marker in un campione prelevato dal corpo dell atleta Utilizzo o tentato utilizzo di sostanze o metodi proibiti Rifiuto o mancanza di sottomissione di campioni senza precisa e valida giustificazione, dopo aver ricevuto notifica come autorizzato nel regolamento antidoping, o qualsiasi altro modo per evitare la raccolta dei campioni Violazione dei requisiti applicabili riguardanti la disponibilità a prelievi per test fuori competizione, inclusa la mancata comunicazione di informazioni per rintracciare l atleta e test mancati pur essendo stati definiti entro regole ragionevoli Manomissione, compiuta o tentata, di qualsiasi parte del controllo Possesso di sostanze e metodi proibiti Traffico di sostanze e metodi proibiti Somministrazione, compiuta o tentata, di sostanze o metodi proibiti ad un qualsiasi atleta, o assistenza, aiuto, incoraggiamento o ogni altro tipo di complicità coinvolgente la violazione o la tentata violazione del regolamento anti-doping

regolamento antidoping, o qualsiasi altro modo per evitare la raccolta dei campioni Violazione dei requisiti applicabili riguardanti la disponibilità a prelievi per test fuori competizione, inclusa

Sostanze e metodi proibiti Sostanze proibite in competizione e fuori competizione S0 S1 S2 S3 S4 S5 Sostanze non approvate Agenti anabolizzanti Steroidi Androgeni Anabolizzanti (esogeni ed endogeni)

6 Sostanze e metodi proibiti Sostanze proibite in competizione e fuori competizione S0 S1 S2 S3 S4 S5 Sostanze non approvate Agenti anabolizzanti Steroidi Androgeni Anabolizzanti (esogeni ed endogeni) Altri Agenti Anabolizzanti Ormoni peptidici, fattori di crescita e sostanze correlate EPO, CERA, hgh, IGFs, MGFs, Gonadotropine, Insulina, Corticotropine, Beta-2 Agonisti Antagonisti e modulatori di ormoni Inibitori delle Aromatasi, SERM, anti-estrogeni, inibitori della miostatina, Diuretici e Agenti Mascheranti Sostanze proibite (WADA 2010) 60,8% classe S1

CERA, hgh, IGFs, MGFs, Gonadotropine, Insulina, Corticotropine, Beta-2 Agonisti Antagonisti e modulatori di ormoni Inibitori delle Aromatasi, SERM,

7 Steroidi anabolizzanti di uso comune Testosterone* Stanazolo Danazolo Nandrolone Diidrotestosterone* (DHT) Deidropiandrosterone* (DHEA) Androstenedione* Metandienone Tetraidrogestrinone (THG) C.J. Hunter: positivo per nandrolone (2000) *ormoni naturali

Deidropiandrosterone* (DHEA) Androstenedione* Metandienone

8 Testosterone e steroidi anabolizzanti Esterificazione per somministrazione intramuscolo Alchilazione (di solito metili e etili) per somministrazione orale Modificazioni anelli (A, B, C, D) Riduzione doppio legame Formazione di doppio legame Sostituzioni (c1, c10,..) Nandrolone : manca metile in C19

orale Modificazioni anelli (A, B, C, D) Riduzione doppio legame Formazione

revocati Tim Montgomery (100m) 2 podi olimpici, 2 mondiali Regina Jacobs (1500m) 2 podi mondiali Barry Bonds

9 Doping invisibile Il caso BALCO (Bay Area Laboratory Co-operative) norboletone the Clear tetraidrogestrinone THG Dwayne Chambers (100m) 5 podi europei, 3 mondiali Marion Jones (100m, 200m, lungo) 5 podi olimpici, 6 mondiali 7 revocati Tim Montgomery (100m) 2 podi olimpici, 2 mondiali Regina Jacobs (1500m) 2 podi mondiali Barry Bonds (baseball, MLB) 14 all star, 7 MVP desoximetiltestosterone DMT o Madol Bill Romanowski (football, NFL) 4 Superbowl e molti altri

10 Una corsa senza fine Steroidi anabolizzanti e doping sportivo L anti-doping: ricerca diretta e indiretta L arma: spettrometria di massa

11 Antidoping ricerca indiretta Metabolismo degli steroidi anabolizzanti FASE 1 ossidazione riduzione epimerizzazione idrossilazione FASE 2 coniugazione

12 Spettrometria di massa vs doping Ben Johnson (Seul, 1988)

13 Doping vs Antidoping ricerca diretta 1900 Stimolanti (cocaina, efedrina) 1950 Paper chromatography, TLC, GC 1972 Prime classi di sostanze alchilate 1972 Spettrometria di massa alle Olimpiadi di Monaco 1980 Doping invisibile, Steroidi endogeni RIA screening, GC-MS per conferma 1983 GC/MS per screening EPO, AAS 1984 T/E > 6 (Donike) LC-MS 2000-oggi EPO, IGF, aumento della lista di AAS, doping genetico 1996 GC/IRMS alle Olimpiadi di Atlanta 2004-oggi GC/IRMS, GC- LC-MS, MS/MS, GC-TOF Orbitrap

RIA screening, GC-MS per conferma 1983 GC/MS per screening 1980-2000 EPO, AAS 1984 T/E > 6 (Donike) LC-MS 2000-oggi EPO, IGF,

14 Una corsa senza fine Steroidi anabolizzanti e doping sportivo L anti-doping: ricerca diretta e indiretta L arma: spettrometria di massa

15 Spettrometria di massa Elevata selettività e sensibilità, analisi quantitativa di molecole note Analisi delle proprietà strutturali Identificazione di molecole incognite Monaco, 1972 Atlas MAT CH-5 sector mass spectrometer coupled to a gas chromatograph with packed column via a glass capillary interface. Sistema cromatografico Ionizzazione Analizzatore Rivelatore GC, LC ESI, APCI soft EI hard (info strutturali) Ion Trap, QQQ, Orbitrap, QTOF

spectrometer coupled to a gas chromatograph with packed column via a glass capillary interface.

16 Tecniche di spettrometria di massa MS in sansione Selected Ion Monitoring Massa Tandem Massa in alta risoluzione (HSRM) Massa in rapporto isotopico

17 Tecniche di spettrometria di massa MS In scansione Exemestane

18 Tecniche di spettrometria di massa In ioni selezionati (Selected Ion Monitoring) Exemestane

19 Tecniche di spettrometria di massa Massa Tandem Product Ion Scan Precursor Ion Scan Neutral Loss Selected Reaction Monitoring

20 Tecniche di spettrometria di massa Triplo quadrupolo: Product Ion Scan Utile in accoppiamento con sistemi ad elevata sensibiltà Fornisce informazioni strutturali THG m/z 313,2 L'ombra del Thg verso Atene

Tecniche di spettrometria di massa Triplo quadrupolo: Precursor Ion Scan Si identificano tutti gli ioni del precursore di interesse Per famiglie

21 Tecniche di spettrometria di massa Triplo quadrupolo: Precursor Ion Scan Si identificano tutti gli ioni del precursore di interesse Per famiglie di steroidi a struttura simile Scarsa sensibilità LC-MS/MS precursor ion scan chromatogram mass spectra of the different precursor ions obtained

22 Tecniche di spettrometria di massa Triplo quadrupolo: Neutral loss Neutral loss Si identificano tutti gli ioni caratterizzati da una perdita comune (neutra) Per famiglie di steroidi a struttura simile Scarsa sensibilità

23 Tecniche di spettrometria di massa Triplo quadrupolo: SRM Selezione degli ioni e di specifici frammenti Scelta di elezione per analisi quantitativa di steroidi target (Sensibile, Specifica) SRM chromatograms in a positive fluoxymesterone sample

Tecniche di spettrometria di massa MS in alta risoluzione Ion 358 m/z 358.269 Ion 448 m/z 448.

24 Tecniche di spettrometria di massa MS in alta risoluzione Ion 358 m/z Ion 448 m/z Presenza di Epimetendiolo, metabolita del metandinone time Schänzer W et al. J Chromatogr B time

25 Frequency % Tecniche di spettrometria di massa Rapporto Testosterone/epitestosterone > Orientali <1 Reference < T/E

26 Tecniche di spettrometria di massa GasChromatography/Combustion/Isotopic Ratio Mass Spectrometry

27 Una corsa senza fine Chi sta vincendo la gara del doping: gli atleti o gli scienziati? Non si può vincere, dal momento che non vi sarà mai un traguardo finale. Ci troviamo in una lotta continua ad un livello sempre più elevato. Le procedure di analisi diventano sempre più sofisticate, così come le sostanze dopanti che vengono messe a punto. Londra il laboratorio antidoping più hightech della storia. I campioni resteranno in archivio per altri 8 anni al fine di scoprire anche in futuro frodi che sono riuscite a farla franca

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