Biocatalizzatori. Tecniche di immobilizzazione e applicazioni biotecnologiche di cellule ed enzimi

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1 Biocatalizzatori Tecniche di immobilizzazione e applicazioni biotecnologiche di cellule ed enzimi

2 BIOCATALIZZATORI Cellule in coltura l organismo viene cresciuto nel terreno A le cellule vengono raccolte e risospese nel terreno B che contiene il substrato da trasformare condizioni di crescita e di biotrasformazione da ottimizzare separatamente Sistemi cell-free / enzimi purificati si risolvono eventuali problemi legati alla permeabilità della membrana si evita la formazione di prodotti collaterali possibili problemi di stabilità

3 BIOCATALIZZATORI IMMOBILIZZATI VS SOLUBILI Separazione del prodotto Operazione in continuo Tempo di reazione Effetti di inibizione Rigenerazione Stabilità Biocatalizzatore solubile Può essere difficile Impossibile Lungo (bassa [E]) Difficili da controllare?? Biocatalizzatore immobilizzato Facile Di regola Breve (alta [E])? Può essere usato più volte Può aumentare con l immobilizzazione E necessario mantenere l attività catalitica nell immobilizzazione

4 Metodi di immobilizzazione di biocatalizzatori

5 Metodi di immobilizzazione carrier-free (self-immobilizzazione) Cristalli reticolati (CLEC) Aggregati reticolati (CLEA) Spherezyme (particelle enzimatiche reticolate in emulsione acqua-olio)

6 Tecniche di immobilizzazione Adsorbimento Preparazione Tipo di legame Attività dell enzima Rigenerazione Stabilità semplice debole intermedia possibile bassa Legame ionico Preparazione Tipo di legame Attività dell enzima Rigenerazione Stabilità semplice intermedio alta possibile intermedia Cross-linking Preparazione Tipo di legame Attività dell enzima Rigenerazione Stabilità semplice forte bassa impossibile alta Legame covalente Preparazione Tipo di legame Attività dell enzima Rigenerazione Stabilità difficile forte alta rara alta Intrappolamento Preparazione Tipo di legame Attività dell enzima Rigenerazione Stabilità difficile intermedio bassa impossibile alta

7 Matrici per immobilizzazione Le matrici organiche naturali o sintetiche usate per l immobilizzazione di cellule o enzimi devono essere stabili e non reattive. Eupergit: sfere macroporose di co-polimeri derivati dell acrilammide, attivata con epossidi

8 Attivazione della matrice con bromuro di cianogeno (CNBr) per immobilizzare gruppi NH 2 Immobilizzazione ph 8-10 Attivazione ph 12

9 Matrici derivatizzate e attivate per reagire con diversi gruppi sulle proteine (-NH 2, -COOH, -SH, aminoacidi aromatici ecc.) La presenza di un braccio spaziatore sulla matrice riduce problemi legati all ingombro sterico e all accessibilità del sito attivo dell enzima immobilizzato

10 EDC Le carbodiimidi: cross-linker specifici per gruppi carbossilici/amminici 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride EDC reagisce con un gruppo carbossilico sulla molecola 1 formando un intermedio O- acylisourea. Questo intermedio può reagire con un gruppo amminico sulla molecola 2, formando un legame covalente tra le due molecole.

11 Reagenti specifici per gruppi amminici o gruppi sulfidrilici Gruppi amminici: esteri dell N-idrossi-succinimmide Gruppi sulfidrilici: maleimmidi alogenuri alchilici

12 Metodi di immobilizzazione: incapsulamento multi-strato

13 Bioreattori Supporti polimerici: particelle, membrane e nanofibre Packed-bed reactors (biocatalizzatore impaccato su colonna) Fluidized-bed reactors (biocatalizzatore mantenuto in movimento da un flusso continuo di substrato) Continuous flow stirred reactors (biocatalizzatore mescolato con il substrato a flusso continuo) Membrane reactors (biocatalizzatore separato da una membrana)

14 Applicazioni biotecnologiche di cellule immobilizzate per la produzione di etanolo

15 Applicazioni biotecnologiche di cellule immobilizzate per la produzione di acido lattico

16 Applicazioni biotecnologiche di cellule immobilizzate

17 Applicazione di enzimi nella degradazione dell amido. Proprietà ed alcune applicazioni dei prodotti di idrolisi dell amido

18 Applicazione di enzimi nella degradazione dell amido per la produzione di sciroppo ad alto contenuto di fruttosio

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20 Applicazione di enzimi nella degradazione dell amido per la produzione di sciroppo ad alto contenuto di fruttosio

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23 ENZIMI TERMOSTABILI TERMOZIMI Enzimi prodotti da organismi termofili (60-80 C) e ipertermofili (>80 C) Utilizzati in biologia molecolare nell industria dei detersivi e dell amido I termozimi sono molto simili agli enzimi mesofilici (mesozimi) Sequenze aminoacidiche simili (40-85% omologia) Strutture spesso sovrapponibili Meccanismo catalitico uguale Termozimi ricombinanti espressi in organismi mesofilici mantengono la loro termostabilità: sono intrinsecamente stabili

24 ENZIMI TERMOSTABILI TERMOZIMI Che cosa rende i termozimi stabili? sono più rigidi (minore suscettibilità alla degradazione proteolitica e ad agenti denaturanti) interazioni idrofobiche efficienza di impacchettamento (packing efficiency) ponti salini riduzione della tensione conformazionale (X Gly) riduzione dell entropia di unfolding (Gly Pro) stabilizzazione di loop e a-eliche legami idrogeno resistenza alla distruzione covalente (Cys, Asn, Gln, Asp)

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