Prof.ssa Nadia Mulinacci. Firenze 10 dicembre 2008

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Lazzaro Costantini
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1 Prof.ssa Nadia Mulinacci Firenze 10 dicembre 2008

2 MESSA PUNTO DI METODICHE ESTRATTIVE E ANALITICHE IDONEE AD IDENTIFICARE FLAVONOIDI E FENOLI PRESENTI IN LATTI E FORMAGGI PECORINI DA ESSI DERIVATI

5 1 A ESTRAZIONE con EtOH/H2O = 7:3 1g/10mL; agitatore magnetico per 90 min. 2 A ESTRAZIONE con EtOH/H 2 O = 7:3 1g/10mL; agitatore magnetico per 90 min. ESTRATTO IDRO- ALCOLICO TOTALE Filtrazione sotto vuoto TEMPO % H 2 O + % CH 3 CN Colonna Gemini 110 A, Phenomenex, 150 x 3 mm, 5µm Defatting con esano EVAPORAZIONE e DISSOLUZIONE in 20 ml di EtOH/H 2 O = 7:3

ESTRATTO IDRO- ALCOLICO TOTALE Filtrazione sotto vuoto TEMPO % H 2 O + % CH 3 CN 0.10 95.0 5.0 3.00 95.0 5.0 13.00 80.

6 : rutina; 2: quercetina mono-glicoside; 3: quercetina glucoside; 4: apigenina diglicoside; 5: kanferolo glicoside; 6: kanferolo glucoside; 7: quercetina malonilglicoside; 8: isoflavone; 9: flavonoide; 10: flavonoide; 11: daidzeina; 12: biocanina A glucoside; 13: formononetina malonil glucoside; 14: genisteina + biocanina malonil glucoside; 15: pratensina; 16: isoflavone; 17: formononetina + tracce di pseudobaptigenina; 18: irilone; 19: biocanina A

10: flavonoide; 11: daidzeina; 12: biocanina A glucoside; 13: formononetina malonil glucoside; 14: genisteina + biocanina

10 MESSA PUNTO DI METODICHE ESTRATTIVE E ANALITICHE IDONEE AD IDENTIFICARE FLAVONOIDI E FENOLI PRESENTI NEI LATTI E NEI FORMAGGI PECORINI DA ESSI DERIVATI

11 POCHI DATI SUL METABOLISMO DELLE MOLECOLE FENOLICHE NEI RUMINANTI (metaboliti noti: ac. 3 fenil propionico;ac.p-oh-cinnamico; p-cresolo;4-etilfenolo) MESSA A PUNTO DI METODI ESTRATTIVI IDONEI A VERIFICARE IL RECUPERO DI MOLECOLE TARGET NEL LATTE MEDIANTE TEST DI SPIKING E LA PRESENZA DI FLAVONOIDI NATIVI. OTTIMIZZAZIONE DELLA METODICA ESTRATTIVA PASSANDO DA LATTE A FORMAGGIO COMPARAZIONE DEI DATI OTTENUTI PER LE DIVERSE TIPOLOGIE DI FORMAGGIO E INDIVIDUAZIONE DI FLAVONOIDI NATIVI QUALI POTENZIALI MARKERS

NEL LATTE MEDIANTE TEST DI SPIKING E LA PRESENZA DI FLAVONOIDI NATIVI.

12 2 g di liofilo + 8 ml di H 2 O Sonicazione per 1 ora a 35 C Sospensione Aggiunta degli standard metodo Antignac modificato (Antignac et al. 2004) Sospensione + 10 ml di CH 3 COCH gc di HCOOH Surnatante Centrifugazione a 4500 rpm per 15 Evaporazione per elimin. CH 3 COCH 3 RISULTATI: Bassi recuperi % delle molecole target Soluzione acquosa rimanente Soluzione acquosa rimanente Attivazione: 10 ml MeOH Lavaggio: Lavaggio: 12 ml H 2 O Deposizione 12 ml H 2 O Defatting con 30 ml di cicloesano e evaporazione fino a metà volume Eluizione: 10 ml MeOH/CH 3 CN Metodo lungo e laborioso Evaporazione a secco + ripreso in 300 µl di EtOH/H 2 O 7:3 v/v

CH 3 COCH 3 RISULTATI: Bassi recuperi % delle molecole target Soluzione acquosa rimanente Soluzione acquosa rimanente Attivazione: 10 ml MeOH Lavaggio: Lavaggio:

13 Valutare come ricostituire il latte liofilizzato PER GARANTIRE : la rimozione della frazione lipidica evitando la formazione di emulsioni stabili l efficacia del processo di precipitazione delle proteine (ph, aggiunta di solventi organici etc- problema della formazione di complessi con le sostanze fenoliche) Valutare se utilizzare la tecnica SPE quale metodo di purificazione/concentrazione degli analiti

(ph, aggiunta di solventi organici etc- problema della formazione di complessi con le sostanze

14 Polymeric Phase Strata X-33 mm 1 g; C18 Strata C18-E mm, 70 A, 2 g; PHENYL Strata Phenyl 1 g. 0,02 µmoli in 5 ml di H 2 O

15 Ricostituzione latte 2g di liofilo + 8 ml di H 2 O Sonicazione per 1 ora Metodo Ricostituzione Latte * Sospensione Centrifugazione a 3000 rpm per 20 Soluzione Eliminazione lipidi + 50 µl di HCOOH (ph=4,6) Soluzione a ph 4,6 Centrifugazione a 4500 rpm per 15 * Surnatante Eliminazione proteine Attivazione: 10 ml MeOH Lavaggio: 12 ml H2O Deposizione Lavaggio: con 12 ml H 2 O Eluizione: 10 ml MeOH/CH 3 CN Evaporazione a secco + ripreso in 300 µl di EtOH/H 2 O 7:3 v/v

Centrifugazione a 4500 rpm per 15 * Surnatante Eliminazione proteine Attivazione: 10 ml MeOH Lavaggio: 12 ml H2O

16 2g liofilo + 20 ml MeOH + 1 gc di HCOOH Sonicazione per 30 a 50 C Metodo Liofilo + MeOH * Sospensione Centrifugazione a 4500 rpm per 15 Surnatante Eliminazione proteine Defatting con esano (60 ml) MeOH Evaporazione a secco Eliminazione lipidi * Attivazione: 10 ml MeOH Lavaggio: 12 ml H 2 O Residuo + H2O (4 ml) Deposizione Lavaggio: con 12 ml H 2 O Eluizione: 10 ml MeOH/CH 3 CN Evaporazione a secco + ripreso in 300 µl di EtOH/H 2 O 7:3 v/v

Evaporazione a secco Eliminazione lipidi * Attivazione: 10 ml MeOH Lavaggio: 12 ml H 2 O Residuo + H2O (4 ml)

17 LATTE PONTECCIO maggio mix di STANDARD Test effettuati con cartuccia fenilica a b STANDARD INTRODOTTI ALL INIZIO DEL METODO STANDARD INTRODOTTI PRIMA DELLA DEPOSIZIONE IN CARTUCCIA

18 Latte Ponteccio Quercetrina * Lut-7-glucoside

19 82% 60% 30% 60% 70% 50% 80% 60% 25% 65% 70% 20% 60% 50% 20% 40% 45% 10%

21 2g liofilo + 20 ml CH 3 COCH 3 + HCOOH Sonicazione per 30 a 50 C Metodo Recuperi % Liofilo + CH 3 COCH 3 dopo test di SENZA CARTUCCIA spiking * Sospensione Surnatante, evaporato a residuo secco Ridisciolto in MeOH Centrifugazione a 4500 rpm per 15 Eliminazione proteine Defatting con esano (150 ml) volte) Evaporazione Eliminazione lipidi Residuo solido ripreso 1 ml EtOH/H 2 O 7:3 v/v ANALISI HPLC/DAD/MS

22 Pagazzana Marzo 2008 Pagazzana Giugno 2007

23 MESSA A PUNTO DI METODI ESTRATTIVI RAPIDI, POCO COSTOSI ED IDONEI AL RECUPERO DI MOLECOLE FLAVONOIDICHE da LATTE E FORMAGGIO PECORINI INDIVIDUAZIONE DI FLAVONOIDI E DERIVATI CINNAMICI NATIVI QUALI POTENZIALI MARKER FITOCHIMICI PER LA TRACCIABILITA DELL ALIMENTO CARATTERIZZARE COMPLETAMENTE LA STRUTTURA DEI FLAVONOIDI INDIVIDUATI NEI FORMAGGI EFFETTUARE UNO SCREENING SU UN NUMERO + ELEVATO DI CAMPIONI DERIVANTI DA UNA FILIERA CONTROLLATA

24 Dipartimento di Scienze Farmaceutiche- Facoltà di Farmacia Dott.ssa Marzia Innocenti e Dott.ssa Elena Agostino Dipartimento di Scienze Zootecniche, Facoltà di Agraria Dott.ssa Arianna Buccioni e Prof. Mauro Antongiovanni Dipartimento di Scienze Agronomiche e Gestione del Territorio Agroforestale (DISAT)-Facoltà di Agraria Prof. Andrea Pardini e Dott.ssa Valentina Pratesi Supporto finanziario

27 Cartuccia C18 Waters, da 500 mg analisi quantitativa tramite HPLC/MS

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