Analisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine

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1 Training Course 2010 Stem Cell Differentiation Napoli, 9-12 Novembre Analisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine Cristina D Aniello

2 Differenziamento in vitro delle cellule ES

3 Differenziamento in vitro Analisi marcatori specifici: espressi solo dalla popolazione cellulare che si intende analizzare non espressi dalle cellule indifferenziate

4 Metodi per la valutazione dei marcatori del differenziamento Real-Time PCR Immunofluorescenza

5 Perché Real-Time PCR? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale

6 Real-Time PCR amplificazione sequenza bersaglio in maniera sensibile e specifica quantificazione dell espressione genica in tempo reale identificazione del prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici utilizzo del SYBR Green metodo del DDct per la quantificazione del livello di espressione del gene d interesse

7 Differenziamento cardiaco Brachyury Eomes Mesp1 Mesp2 Nkx2,5 GATA4 Mef2C ANP α/β-mhc MLC2a/v Oct3/4 Nanog T0 T2-T4 T12 time NeuroD Nestin βiii-tub NF-L NF-M Differenziamento neurale

8 Marcatori del mesoderma primitivo Brachyury Eomes

9 Marcatori cardiaci precoci Mesp1 Mesp2

10 Marcatori cardiaci Nkx2.5 Tbx5 Mef2c GATA4

11 Marcatori cardiaci tardivi Mlc2a Mlc2v MHC

12 Marcatori neurali 800 Nestin βiii tubulin

13 Real-Time PCR: la reazione Componenti della reazione: - cdna (ES; time course del differenziamento) - oligonucleotidi - Master mix (dntp; DNA Polimerasi; probe fluorescente)

14 Cellule indifferenziate Differenziamento cardiaco Differenziamento neurale EBs in sospensione T4 Neuroni T7 precursori Cardiomiociti contrattili T10 Neuroni T10

15 SYBR Green E un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza Primer SYBR Green ANNEALING L intensità della fluorescenza comincia ad aumentare Luce emessa ALLUNGAMENTO L intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento Polimerasi L AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E REGISTRATO A 530 nm

16 Analisi della curva di melting Consente di identificare il prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici. Fluorescenza Curva di fluorescenza 10 4 copie 10 copie 0 copie Cicli di amplificazione Al termine della PCR la temperatura viene lentamente aumentata inducendo un decremento della fluorescenza. La temperatura in corrispondenza della quale si ha un repentino decremento della fluorescenza corrisponde alla T m del prodotto. Fluorescenza -df/dt Curva di melting 10 4 copie 10 copie 0 copie Temperatura ( C) Derivata negativa della curva di melting prodotti non specifici TM 10 4 copie 10 copie 0 copie Temperatura ( C)

17 Quantificazione ASSOLUTA: i campioni sono quantificati in modo assoluto. Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve). Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni. RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i CT. Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve). Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro DCT con quello del controllo endogeno.

18 Real-Time PCR: analisi del risultato CT= è il ciclo soglia definito come il numero di cicli richiesti affinchè la fluorescenza superi il background. Il CT è inversamente proporzionale alla quantità di gene target presente nel campione. CT medio= media del triplicato tecnico DCT= CT medio (gene target) - CT medio (housekeeping) DDCT= DCT campione in esame - DCT controllo Fold induction= 2^-DDCT