Skeletal muscle plasticity: proteomic & intracellular signalling pathways analysis. Maria Antonietta Pellegrino

Transcript

1 Skeletal muscle plasticity: proteomic & intracellular signalling pathways analysis Maria Antonietta Pellegrino

2 Tipi di fibre muscolari e isoforme della miosina Uomo MHC-1 MHC-2A MHC-2X Fibre lente Fibre veloci tipo 1 tipo 2A tipo2x

3 I muscoli sono misti soleo vasto l. tib. MHC-2X MHC-2A MHC-1

4 VELOCITA DI ACCORCIAMENTO FORZA SPECIFICA

5 I muscoli sono plastici perché hanno la capacità di modificare la propria specializzazione in base alle necessità funzionali Fibre lente Fibre veloci Proprietà funzionali Fibre ossidative Fibre glicolitiche attività metabolica

6 IL FENOTIPO CAMBIA Condizioni fisiologiche Condizioni patologiche Fase dello sviluppo Variazione attività muscolare Invecchiamento

7 La plasticità muscolare risposte adattative del muscolo a diversi fattori attraverso meccanismi di tipo: qualitativo: composizione in fibre lente e in fibre veloci quantitativo: modificazioni a livello di dimensioni delle fibre 1 2A 2X

8 Meccanismo di plasticità di tipo qualitativo Concetto di fenotipo profilo di tutte le proteine e delle loro isoforme espresse

9 Espressione coordinata delle proteine MHC-slow MLC-1 slow MLC-2 slow TnC slow TnI slow etc.. MHC-fast MLC-1 fast MLC-2 fast MLC-3 fast TnC fast TnI fast etc..

10

11 L espressione coordinata delle proteine non è una regola Necessità di studiare il fenotipo muscolare con un approccio sistemico

12 suffisso omica Genomica, Proteomica, Trascrittomica, Interattomica, Metabolomica ecc

13 GENOMA Nell uomo circa geni conservano le informazioni Corredo di materiale genetico, DNA, di un organismo TRASCRITTOMA Nell uomo circa trascritti trasferiscono le informazioni Studio dei trascritti livelli di mrna PROTEOMA Nell uomo circa di proteine Totalità delle proteine, espresse e modificate dopo l espressione, in un preciso istante

14 Studiare il Proteoma perché? Le proteine sono gli EFFETTORI MOLECOLARI delle funzioni cellulari La sequenza genica non dice quando una proteina viene sintetizzata I livelli di mrna non sempre sono proporzionali alla quantità di proteina espressa 14

15 una proteina puo essere presente quando il suo mrna non lo è piu possono esistere molti mrna che non vengono tradotti in polipeptidi Molte modificazioni delle proteine sono post-traduzionali quindi non deducibili dalla sequenza genica

16 Il complemento proteico di una cellula è altamente dinamico - qualitativamente - quantitativamente variazioni fisiologiche, patologiche, stress, somministrazione di farmaci, ecc.

17 Esistenza di piu proteomi (subproteomi) proteomi delimitati da precisi confini fisici mitocondrio, apparato di Golgi proteomi funzionali costituiti da proteine coinvolte in uno stesso fenomeno cellulare o in una stessa via biochimica che interagiscono a formare macchine molecolari piu articolate

18 Proteomica differenziale Confronto di pattern proteici - derivanti dallo stesso sistema posto in differenti condizioni Presenza di proteine differentemente espresse

19 Adattamenti qualitativi: Studio del profilo di tutte le isoforme e delle loro modificazioni post-traduzionali SDS-PAGE delle isoforme delle MHC 2D electrophoresis

20 SDS-PAGE delle isoforme delle MHC

21 2DE Tecnica di elezione per lo studio del proteoma 1975

22 Identificazione delle proteine con 2DE 2D-PAGE Punto isoelettrico cioè quel valore di ph al quale la carica netta è nulla Peso molecolare Prima dimensione IEF Seconda dimensione SDS-PAGE Principali limiti della 2D-PAGE Impossibilità di visualizzare tutte le proteine realmente espresse -Proteine espresse in minore quantità -Proteine con pi non compreso tra 3 ed 11 -Proteine di massa molecolare inferiore a D -Proteine di massa molecolare superiore a D -Proteine fortemente idrofobiche

23 Identificazione delle proteine di un sistema complesso 2D-PAGE Punto isoelettrico cioè quel valore di ph al quale la carica netta è nulla Peso molecolare kda 100 Prima dimensione IEF Seconda dimensione SDS-PAGE ph 11

24 ANALISI PROTEOMICA Preparazione dell estratto proteico Separazione delle proteine Analisi Identificazione e caratterizzazione delle proteine

25 1 Preparazione dell estratto proteico Lisi (cellule e tessuti) Azoto liquido (mortaio) 8M Urea 2M Thiourea 4% CHAPS 65 mm DTT 40 mmtris e Solubilizzazione Congelamenti e decongelamenti ripetuti

26 1 Preparazione dell estratto proteico Inattivazione delle sostanze che possono interferire Inattivazione delle proteasi: Inibitori delle proteasi (cocktail d inibitori) Inattivazione degli acidi nucleici: cocktail di DNA/RNAasi Concentrazione proteica 2-D Quant Kit

27 2 Separazione delle proteine 2 Prima dimensione: Isoelettrofocusing (IEF)

28 Prima dimensione: Isoelettrofocusing (IEF) avviene in condizioni denaturanti e ad alti voltaggi Tampone di reidratazione Campione Strip Olio Elettrodo esterno anodo catodo IPGphor

29 volt Prima dimensione: Isoelettrofocusing (IEF) step Volt tempo Vhrs Reidratazione S1 step-n-old 30 14:00 h Posizionamento prot lungo la strip S2 gradient 200 2:00 h 230 S3 gradient 300 2:00 h 500 S4 gradient :00 h 650 S5 gradient :45 h tempo S6 gradient :45 h S7 step-n-old :05 h C

30 FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA anodo ph3 D V proteine pi acido proteine pi basico ph10 catodo

31 Seconda dimensione: SDS-PAGE Separa le proteine secondo il loro peso molecolare Iodoacetamide serve per alchilare Tampone di equilibrazione Tris-Cl, ph 6.8 1M Urea (6M) Glicerolo 100% (30%) SDS (2%) Blu di bromofenolo Iodoacetamide (3%) (50 mm) 12% 70 V ~20 h 15%

32 cariche delle catene laterali SDS Il trattamento con SDS conferisce a tutte le proteine una carica negativa Esse migreranno in un Gel, sotto l azione di un campo elettrico, solo in funzione della loro grandezza (M) O O S O O Na

33 Seconda dimensione: SDS-PAGE Separa le proteine secondo il loro peso molecolare 12% 15% Protein Detection Coomassie Stain (100 ng to 10 mg protein) Silver Stain (1 ng to 1 mg protein) Fluorescent (Sypro Ruby) Stain (1 ng & up) 70 V ~20 h

34 Seconda dimensione: SDS-PAGE kda ph 11

35 ANALISI Image Master Platinum Condizione 1 Condizione 2 Il programma individua gli spot (detection)

36 Image Master Platinum accoppia spot corrispondenti di gel diversi (matching) e individua eventuali differenze tra essi (volume, area)

37 4 Analisi Analisi Differenze sono in termini di area, volume Volume = Area x intensità 75% dell altezza del picco Il volume consente di valutare quantitativamente le variazioni del profilo proteico dei campioni analizzati Valutazione precisa di parametri quali pi, peso molecolare e volume degli spot. 75%

38 SPOTS REPORT kda ph 11

39 Criteri adottati per la valutazione differenziale degli spot 3 corse per ciascun campione Spot comuni a tutti i gel Parametro analizzato: volume dello spot

40 Abbondanza relativa degli ioni Identificazione degli spot Confronto con banche dati SWISS 2D PAGE swiss-prot/trembl Spettrometria di massa excisione dello spot Rapporto massa/carica

41 Swiss 2D-PAGE Lecture

42 Spettrometria di massa MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation time-of-flight excisione dello spot digestione con tripsina Estrazione dei peptidi Colorazione con argento compatibile con spettrometria analisi dei peptidi MALDI-TOF

43

44 QUANDO E NECESSARIO CONFERMARE CON UN ESPERIMENTO DI WESTERN BLOT UN RISULTATO DI ESPRESSIONE DERIVANTE DALL ANALISI 2D? - Nel caso di proteine che focalizzano in più spot - Nel caso di analisi su modificazioni post traduzionali

45 Western blotting (blotting di proteine)

46 The carbonyl groups in the protein side chains are derivatized to 2,4-dinitrophenylhydrazone (DNP hydrazone) by reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH); 6 μg of the DNP-derivatized protein samples were separated by PAGE (15% SDS-polyacrylamide gels) and then blotted for 2 h at 100 V to a nitrocellulose membrane Oxyblot Ponceau 1 Ponceau Red and scan 2 primary Ab anti-dnp hydrazone C HU-3 HU-7

47

48 Meccanismo di plasticità muscolare di tipo quantitativo Atrophy Cancer cachexia Neuromuscolar deseases Aging Denervation Disuse Hypertrophy Strength training Steroids

49 MHC-IIA Soleus MHC-I Meccanismo di plasticità muscolare di tipo quantitativo 1 Analisi della variazione di massa muscolare (CSA) a livello di: - muscolo in toto - singola fibra muscolare C HU-3 HU-7 HU-14 2 Analisi dei segnali responsabili delle variazioni della massa muscolare

50

51 Sistema Ubiquitina proteasoma sintesi degradazione Sistema dell autofagia

52

53 Attivazione della via degradativa

54 Attivazione della via sintetica

55 COMUNICAZIONE TRA LA VIA SINTETICA E DEGRADATIVA

56 I sistemi degradativi sono influenzati dalle alterazioni metaboliche Mitochondrial dysfunction/damage Attraverso la produzione di ROS Alterazioni della dinamica mitocondriale

57

58 I sistemi degradativi sono influenzati dalle alterazioni metaboliche Mitochondrial dysfunction/damage Attraverso la produzione di ROS Alterazioni della dinamica mitocondriale

59

60 I sistemi degradativi sono influenzati dalle alterazioni metaboliche Mitochondrial dysfunction/damage Attraverso la produzione di ROS Alterazioni della dinamica Mitocondriale Stress energetico

61 Real Time PCR La Polymerase Chain Reaction (PCR) è il processo che permette l amplificazione di uno specific frammento di DNA. Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati e quantitativi

62 TRATTAMENTO DEL TESSUTO MUSCOLARE Per poter estrarre l RNA dalle cellule dei tessuti è necessario frantumare il tessuto E rompere le cellule che lo costituiscono Possibili metodi per la rottura delle cellule: Metodi meccanici Vibrazioni ultrasoniche Agenti litici responsabili della lisi celulare METODO MECCANICO: 1. CONGELAMENTO DEL TESSUTO IN GHIACCIO SECCO O AZOTO LIQUIDO 2. POLVERIZZAZIONE DEL TESSUTO CON IL PESTELLO Solubilizzazione nel buffer di lisi

63 COLONNINE DI SILICE eliminare DNA e trattenere l RNA sulla membrana Il campione nella soluzione di caricato nella colonnina al centrifugato lisi viene silice e trattamento con DNAasi Eluisco l RNA con l H2O, stacca dalla viene recuperato membrana e Quantificazione dell RNA

64 TRASCRIZIONE INVERSA RNA La trascrizzione inversa consente di produrre una molecola di cdna (DNA complementare) partendo da una molecola di RNA, grazie all utilizzo di un enzima DNA polimerasi RNA dipendente 5 3 AAAAA mrna oligo nucleotidi random APPAIAMENTO DEI RANDOM PRIMERS 5 mrna 3 3 cdna AAAAA 3 5 cdna 5 SINTESI DEL cdna per ottenere una molecola ibrida cdna-rna Eliminazione dell RNA tramite l utilizzo dell RNase

65 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) amplificazione Stampo una piccola quantità di DNA che si vuole amplificare (DNA Target) L operaio l enzima polimerasi che sintetizza il DNA i mattoni, una riserva di nucleotidi liberi costituita da Adenina, Timina, Citosina, Guanina Innesco,2 primer: sequenze di DNA a singolo filamento (20-30 nucleotidi) sintetizzate artificialmente, hanno la funzione di innescare la reazione di sintesi [un primer (for) è complementare a un filamento di DNA all inizio della regione bersaglio; l altro (Rev) è complementare all altro filamento, alla fine della regione bersaglio]

66 Polymerase Chain Reaction: principio CICLI TERMICI: Dapprima viene sintetizzata una molecola di DNA a doppio filamento a partire dalla molecola di cdna, conducendo la reazione ad una temperatura adatta a permettere l'annealing dei primer al DNA DENATURAZIONE (94-96 C) ANNEALING (50-65 C) EXTENSION (72 C)

67 Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles DNA fragment to be amplified 2 copies 4 copies 8 copies

68 Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano al dsdna, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

69 SYBR Green Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore di tutte le molecole di DNA. All inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DN denaturato, primers e la molecola fluorescente

70 Dopo l annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone

71 Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare 3 Primer 5 3 R Q Primer REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter

72 Fluorescenza Curve di amplificazione Plot lineare Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui C T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di template iniziale

73 Normalised reporter fluorescence (R n ) Plot di amplificazione L i n e a s o g l i a s c e l t a d a l l o p e r a t o r e In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale Indica il valore al di sopra del quale inizia l accumulo di un a m p l i f i c a t o PCR cycle number E il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello d e l l a T h r e s h o l d

74 Quantitativa relativa Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario: TARGET La sequenza di DNA da analizzare. CALIBRATORE Il campione da usare come riferimento per l analisi comparativa (Trattato/non Trattato, campione al T0 in uno studio time course) CONTROLLO ENDOGENO Un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione.

75 Quantitativa relativa: analisi dei dati Ct T = Ct gene target campione Ct HK = Ct gene HK campione Ct campione di riferimento Ct campione di riferimento Ct = Ct gene target campione Ct campione HK 2 - (DCT- DCTHK)

76