Autoanticorpi nelle patologie del Sistema Nervoso Centrale e Periferico: metodi di studio e significato clinico.
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1 Autoanticorpi nelle patologie del Sistema Nervoso Centrale e Periferico: metodi di studio e significato clinico. Marilina Tampoia Responsabile Struttura Semplice di Autoimmunologia U.O. Patologia Clinica I Azienda Ospedaliera Universitaria BARI Autoanticorpi e Neuropatie Autoimmuni Autoanticorpi diretti verso costituenti neuronali sono stati associati ad un numero sempre maggiore di neuropatie croniche. Neuropatie autoimmuni sono descritte soprattutto a carico del SNP ma recenti studi sostengono l ipotesi di un eziopatologia autoimmune anche in alcune patologie del SNC Bassano del Grappa 7-9 settembre 2009 Target antigenici e patogenicità degli autoanticorpi nelle patologie autoimmuni del sistema nervoso centrale (SNC ) Antigen i target VGCK VGCC GAD GM1 GQ1 GluR3 AQP-4 NR2A e 2B Malattia Sindrome di Morvan Epilessia Encefalite Limbica Atassia cerebellare Sindrome miastenica di Lambert-Eaton Sclerosi laterale amiotrofica Atassia cerebellare Epilessia Epilessia Neuropatia multifocale motoria Sindrome di Guillain-Barrè Sindrome di Miller-Fisher Encefalite di Rasmussen Neuromielite ottica LES neuropsichiatrico Risposta immunoterapica Buona Alcune positive Buona Mediocre Buona Non pervenuta Per lo più inefficace Occasionale in pazienti trattati con IVIg Non pervenuta Non pervenuta Non pervenuta Transitoria Buona Specifica Patogenicità anticorpale Trasferimento passivo di IgG di pazienti con neuromiotonia al topo provocano incremento del rilascio di ACh. Gli anticorpi bloccano la corrente di K + nelle linee cellulari. Anticorpi anti-vgcc (vari sottotipi) inibiscono la corrente del Ca 2+ in culture di cellule di Purkinje e di cellule dei granuli IgG GAD-positive nel CSF riducono le sinapsi inibitorie nel cervelletto Trasferimento passivo di anti-gm1 determina la malattia in modelli animali sperimentali Demielinizzazione con blocco della conduzione Meccanismo di mimicrismo molecolare Conigli immunizzati con GluR3 sviluppano la malattia. Anticorpi anti-glur3 causano disfunzione neuronale. Non noto Topi immunizzati con peptidi NMDA sviluppano disfunzioni del SNC a seguito di lesioni della barriera emato-encefalica Autoanticorpi e Neuropatie Autoimmuni La sola presenza di autoanticorpi circolanti non è sufficiente per definire una malattia autoimmune; è necessario valutarne il ruolo patogenetico, la trasferibilità della malattia all animale o l immunizzazione attiva. Poco si conosce sul ruolo patogenetico e sul reale significato clinico di alcuni autoanticorpi, che sono suddivisi in markers: patogenetici ed non patogenetici (epifenomeno). AUTOANTICORPI CON RUOLO PATOGENETICO NOTO: autoanticorpi diretti verso antigeni noti con ruolo patogenetico dimostrato Autoanticorpi diretti contro il recettore dell acetilcolina Autoanticorpi diretti contro i canali del potassio voltaggio-dipendenti Autoanticorpi diretti contro i canali del calcio voltaggio-dipendenti Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica AUTOANTICORPI CON RUOLO PATOGENETICO PROBABILE O NON NOTO: autoanticorpi diretti verso antigeni noti con ruolo patogenetico probabile o non noto Autoanticorpi diretti contro l acido glutammico-decarbossilasi (GAD) Autoanticorpi anti-recettore del glutammato Autoanticorpi anti-gangliosidi Autoanticorpi anti acquaporina-4 Autoanticorpi determinati per fini di ricerca (fase sperimentale) Autoanticorpi determinati per fini clinici (pratica routinaria) in pochi centri specializzati e con metodologie home made in alcuni laboratori clinici con metodologie commercializzate (radioimmunologica, immunofluoresenza indiretta, immunodot-blot, immunoenzimatica)
2 Autoanticorpi e neuropatie demielinizzanti croniche Neuropatia associata ad anticorpi anti-mag IgM Gammopatia monoclonale (MG) occorre nell 1% della popolazione di età > 50 anni (3% > 70 anni) 10-20% delle MG sono IgM ( / > 50 anni) 15-30% dei pazienti con MG IgM hanno PoliNeuropatia (PN) Original report, che per prima riportò la presenza di elevati titoli di anticorpi anti-mag IgM in un paziente con neuropatia demielinizzante 40-50% dei pazienti con PN associate a IgM MG hanno anticorpi anti-mag IgM La prevalenza di PN associata ad antimag IgM nella popolazione di età > 50 anni potrebbe essere almeno 10/ N Eng J Med, 1980 Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG) Antigeni L antigene verso il quale sono diretti gli autoanticopi è la MAG, principale glicoproteina associata alla mielina del sistema nervoso centrale e periferico, formata da cinque domini extracellulari Iglike, un singolo dominio transmembrana e uno citoplasmatico. Glicoproteina mielinica Funzioni principali stabilizzare i contatti tra gli assoni mielinizzati e i processi gliali, formare la guaina mielinica morfologicanente intatta delle cellule di Schwann, compattare la struttura mielinica degli oligodendrociti Altre funzioni rallentamento dell invecchiamento della mielina trasmissione del segnale regolazione della fosforilazione a cascata dei neurofilamenti controllo del calibro dell assone, cruciale per l efficienza della trasmissione nel SNP Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG) La patogenicità degli autoanticorpi anti-mag è dimostrata: trasferimento passivo della malattia con siero di pazienti con anticorpi anti-mag al gatto; l iniezione intraneuronale di sieri nei nervi sciatici del coniglio induce un rapido esordio di demielinizzazione complemento-mediata dei nervi periferici; Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG) L identificazione degli anticorpi anti-mag è stata possibile grazie a metodiche di westernblot (WB) su elettroforesi SDS con mielina centrale. In questo modo è stata evidenziata una banda di 92kD corrispondente al PM della MAG. evidenza di depositi di anticorpi anti-mag e componenti del complemento attivati sulle guaine mieliniche colpite.
3 Anticorpi anti-mag possono essere dimostrati con metodiche di immunofluorescenza indiretta su nervo di scimmia e cervelletto Anticorpi anti-mag possono essere dimostrati con metodiche di immunoenzimatica, che utilizzano come antigene MAG umana ricombinante cervelletto di primate nervo periferico di primate antigene coating : MAG umana ricombinante diluizioni elevate del siero (1:800) coniugato monospecifico IgM, polispecifico Ig totali incubazioni overnight incubazioni a temperatura controllata 2-8 C Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG) Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG) La frequenza di anticorpi anti-mag in pazienti affetti da MG IgM è significativamente più elevata (chi-quadro =44.10, P>.00001) in pazienti con neuropatia associata (45.1%) piuttosto che in quelli senza neuropatia (6.8) S, sensoriale M, motoria Quando presenti gli anticorpi sono associati ad un quadro clinico tipico delle neuropatie sensoriali demielinizzanti, lentamente progressive, distali e simmetrici. La specificità ed il valore predittivo positivo per neuropatia degli anti-mag IgM tra i pazienti con MG IgM sono rispettivamente 93.2% e 91.4%. Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008 Autoanticorpi e neuropatie demielinizzanti croniche sono principalmente IgM monoclonali e sono diretti contro: glicoproteine associate alla mielina (MAG) autoanticorpi anti-sulfatide anti-gangliosidi (GM1, GM2,GD1a, GD1b, GQ1b). Anticorpi anti-mag sono quasi sempre associati a neuropatie e ne predicono l inizio. E stato dimostrato un miglioramento clinico correlato con la riduzione del titolo.
4 Autoanticorpi anti-gangliosidi sono rivolti contro più di 20 differenti gangliosidi e glicolipidi e associati a diverse neuropatologie: reagiscono contro la porzione disaccaridica dei gangliosidi delle guaine mieliniche si legano, a livello strutturale, alla superficie dei neuroni motori ma non di quelli sensitivi spiegando la predominanza motoria della malattia; in particolare gli epitopi bersaglio degli anticorpi sono altamente concentrati a livello del nodo di Ranvier (Corbo 1993) Struttura dei gangliosidi Gal Sfingosina O Glc Gal NAc Gal acido grasso Sial. Ac Ceramide catena carboidrati Glc = Glucosio; Gal = Galattosio; GalNAc = N-Acetil-Galattosamina; Sial. Ac = ac.sialico Glc = Glucosio; Gal = Galattosio; GalNAc = N-Acetil-Galattosamina; Sial. Ac = ac.sialico sono componenti della Cell Wall delle cellule di mammifero presenti in alta concentrazione nel sistema nervoso centrale e periferico Nomenclatura dei gangliosidi G D Ganglioside 1 a Posizione dell acido sialico a o b Migrazione in cromatografia 1, 2 o 3 Numero di molecole di acido sialico M = mono- D = di- T = tri- Q = (lat. Quad-) tetra- Anticorpi, metodi di ricerca Combinazioni disponibili Esempi di strip incubate Immuno-blot Antigeni disponibili: GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GT1b, GQ1b Immunoenzimatica antigene coating : miscele di gangliosidi o singolo ganglioside diluizioni elevate del siero (1:800) coniugato monospecifico IgM, polispecifico Autoanticorpi anti-gangliosidi in pazienti affetti da neuropatie croniche immuno mediate Pazienti 539 pazienti consecutivi affetti da neuropatia, arruolati 302 pazienti affetti da polineuropatia cronica immuno-mediata 166 pazienti affetti da PN, polineuropatia 41 pazienti affetti da MMN, neuropatia motoria multifocale 237 pazienti affetti da neuropatie non immuno-mediate Metodi Immunoblot, immunoenzimatico incubazioni overnight incubazioni a 2-8 C Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008
5 Autoanticorpi anti-gangliosidi in pazienti affetti da neuropatie croniche immuno mediate Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008 Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008 Autoanticorpi e Neuropatie Autoimmuni Sclerosi Multipla (SM) la più frequente patologia neurologia nei giovani a rischio di disabilità nel tempo 2.5 milioni di individui nel mondo sono affetti da SM Nuovi anticorpi come marcatori diagnostici e prognostici nella Sclerosi Multipla SM decorso di malattia 95% esordio con episodi di riacutizzazione e remissione 50% dopo anni converte in un decorso secondario cronico progressivo 10% decorso primario cronico progressivo SM varianti cliniche Mielite trasversa acuta Encefalomielite acuta disseminata (ADEM) Leucoencefalite acuta emorragica (AHLE) Neuromielite ottica di Devic MS acuta tipo Marburg Sclerosi concentrica Balo MS Mielinoclastica Schilder Autoanticorpi nella MS Anticorpi come marcatori diagnostici di forma clinica Anticorpi come marcatori diagnostici Anticorpi come marcatori di progressione di malattia Anticorpi come marcatori di riparazione/demielinizzazione Anticorpi come marcatori predittivi di risposta al trattamento
6 Neuromielite Ottica (Sindrome di Devic) Wingerchuck DM et al. Neurology 2006 Pazienti con anticorpi anti-mog/mbp Elevato rischio di sviluppare CDMS Entro una media di 7.5 mesi Pazienti con anticorpi anti-mog isolati Medio rischio di sviluppare CDMS Entro una media di 15 mesi Pazienti senza anticorpi anti-mielina Conversione a CDMS in un tempo > 45 mesi o mai Anticorpi anti-interferoni Anticorpi anti-interferoni e progressione clinica Interferoni possono indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti (NABs) NABs usualmente compaiono dopo 12 mesi dal trattamento I titoli anticorpali sono variabili e possono cambiare nel corso del tempo Alti titoli anticorpali impattano negativamente -attività biologica del farmaco -decorso clinico La comparsa di autoanticorpi anti-interferone si accompagna ad una peggiore prognosi di malattia Kappos L et al. Neurology 2005
7 Autoanticorpi e Sindromi Neurologiche Paraneoplastiche (SNP) NOTE STORICHE legame tra disturbi neurologici e neoplasie era noto da oltre 50 anni. Brain R evidenza di un legame tra disturbi neurologici, neoplasie e coinvolgimento immunologico.greenlee 1983 JE and Graus F 1985 sono state pubblicate le prime linee guida per la ricerca e la classificazione degli anticorpi neuronali paraneoplastici. Moll JWB sono state pubblicate le raccomandazioni per standardizzare i criteri diagnostici delle sindromi neurologiche paraneoplastiche.graus F2004. Anticorpi, sindromi neurologiche paraneoplastiche e tumori associati Autoanticorpi Onconeuronali Anticorpi anti-nucleo neuronale (ANNA) Caratteristiche antigeniche e pattern immunoistochimico anticorpo antigeni proteine identificate pattern Anti-Hu (ANNA-1) Anti-Ri (ANNA-2) ANNA-3 Anti-Ma nuclei di cellule neuronali e di gangli dorsali nuclei di cellule neuronali e non dei gangli dorsali nuclei delle cellule del Purkinje nuclei di cellule neuronali HuC, HuD (35-40 kda) Nova-1, Nova-2 (55, 80 kda)? (170 kda) Ma1/Ma, Ma2/Ta, Ma3 (39.8, 41.5, 53.3 kda) fluorescenza dei nuclei neuronali e dei gangli dorsali fluorescenza dei soli nuclei neuronali fluorescenza dei nuclei delle cellule del Purkinje fluorescenza dei nucleoli dei nuclei neuronali de Beukelaar J et al The Oncologist 2006 Autoanticorpi Onconeuronali Autoanticorpi Onconeuronali Anticorpi anti-nucleo neuronale (ANNA) Anti-Hu Anti-Ri Anticorpi anti-nucleo neuronale (ANNA) anticorpo Neoplasie Disordini neurologici Altre Neoplasie Anti-Hu (ANNA-1) Anti-Ri (ANNA-2) Anti-Ma microcitoma polmonare (80% dei pz positivi ha una neoplasia polmonare una neoplasia mammaria è presente nel 75% dei pazienti con anticorpi anti-ri (M/F 1:2) giovani con carcinoma delle cellule germinali del testicolo Encefalite paraneoplastica (PE) con le sue varianti : limbica (PEL), del tronco ed associata a neuropatia subacuta sensitiva (Sindrome anti-hu) nell opsoclono mioclono paraneoplastico (POM) encefalite limbica paraneoplastica (PEL) neuroblastoma ca prostatico, seminoma ed adenoca vescicale dell utero, carcinoma della vescica CERVELLETTO DI SCIMMIA INTESTINO (ganglio dorsale) substrato
8 Autoanticorpi Onconeuronali Anticorpi anti-citoplasma delle cellule di Purkinje (PCA) Autoanticorpi anti-yo (PCA-1) CERVELLETTO DI SCIMMIA reagiscono contro antigeni citoplasmatici delle cellule del Purkinje, recentemennte identificati (CDR 34,CDR 53, CDR 62) sono presenti nel 50% dei pazienti affetti da Degenerazione Cerebellare Paraneoplastica (PCD) (Hammack 1990), più comune sindrome paraneoplastica del SNC, prevalente nel sesso femminile ( neoplasie ovariche (60%) e mammarie(30%)), caratterizzata da sintomatologia subacuta invalidante (vertigini, parola scandita, tremore intenzionale, dismetria, atassia del tronco e della marcia) Anti-Yo i sintomi precedono la diagnosi di neoplasia in 50% dei casi altri tumori associati sono ca gastrico, adenocarcinoma parotideo ed esofageo. sono rilevabili su sezioni criostatate di cervelletto dove producono una fluorescenza localizzata soprattutto al citoplasma delle cellule del Purkinje substrato Autoanticorpi Onconeuronali Anticorpi anti-citoplasma delle cellule di Purkinje (PCA) anticorpo Anti-Yo (PCA-1) PCA-2 Anti-Tr pazienti sesso:femmine>>maschi età: media 64 aa* range sesso:femmine>maschi età: media 52 aa range sesso:femmine>maschi età: media 61 aa range Disordini neurologici Degenerazione cerebellare,atassia cerebellare subacuta,neuropatia sensori-motoria Sindrome neurologica progressiva multifocale, encefalomielite Degenerazione cerebellare,atassia cerebellare, encefalite limbica *Shams ili S. Brain 2003 Vernino S. Ann Neurol 2000 Bernal af. Neurology 2003 Neoplasie Ovaio mammella Polmone Linfoma di Hodgkin Autoanticorpi Onconeuronali Altre reattività anticorpali anticorpo Anti-Zic4 Anti-GAD Anti- CV2/CRMP5 Antiamfifisina Anti-mGluR1 AGNA localizzazione antigenica nuclei neuronali dei granuli layer cerebellari terminazioni GABA-ergiche del SNC (cervelletto e midollo spinale) citoplasma degli oligodendrociti terminazioni presinaptiche centrali citoplasma delle cellule di Purkinjie nuclei della glia di Bergman del cervelletto, glia della... Disordini neurologici Degenerazione cerebellare Stiff Man Syndrom Encefalomielite,neuropatia sensoriale Stiff Man Syndrome Degenerazione cerebellare Lambert-Eaton myasthenic syndrome, disordini neurologiche paraneoplastiche Neoplasie polmone mammella, colon, polmone polmone, timoma mammella, polmone linfoma di Hodgkin polmone Metodologie di laboratorio Perchè la ricerca di autoanticorpi è importante? Identifica il tumore Definisce la prognosi Individua nuove sindromi cliniche Immunoistochimica Immunofluorescenza indiretta Western-blot Western-blot con antigeni ricombinanti Line-blot con antigeni ricombinanti Immunoprecipitazione
9 Metodologie di laboratorio immunofluorescenza indiretta Il pattern di immunofluorescenza può essere difficile da interpretare specie se vi è associazione tra anticorpi neurono-specifici e anticorpi sistemici. Il loro riscontro in immunofluorescenza è solo indicativo e la specificità anticorpale deve essere sempre confermata con altre metodologie. Yo ricom. Hu ricom. Western-blot Hu: 38 kda Ri: 80 kda 55 kda Yo: 62 kda 34 kda più Hu ricombinante Yo ricombinante Altre metodologie Paziente 4: maschio, di 70 anni, affetto da SSN senza neoplasia. siero controllo Westerblot Immunoblot Immagini IFI, Western-blot di 2 pazienti controllo Immagini IFI, Western-blot di 2 pazienti controllo
10 Landscape viewing La diagnostica autoanticorpale delle SNP ha subito negli ultimi decenni un importante impulso, ma la sua collocazione nei laboratori di routine appare ancora piuttosto problematica a causa di: bassa frequenza di sindromi paraneoplastiche (<1 caso per all anno), bassa prevalenza di autoanticorpi identificabili nel siero di pazienti difficile selezione clinica dei pazienti da sottoporre alle indagini anticorpali differenti caratteristiche analitiche dei metodi per la determinazione degli anticorpi Landscape viewing Alcuni autori sostengono che i laboratori specialistici con più elevato turnover diagnostico siano meglio deputati alla diagnostica delle patologie neurologiche autoimmuni. Tuttavia se questo poteva trovare giustificazione quando la ricerca degli anticorpi veniva eseguita con metodologie indaginose come l immunoistochimica, oggi l avvento di metodi di immunoblotting e l utilizzo di antigeni ricombinanti ne rende più facile la esecuzione, interpretazione e standardizzazione. Il laboratorio dispone oggi di più metodi per la ricerca degli anticorpi e sempre nuovi anticorpi vengono descritti nella diagnosi delle SNP ma anche un accurata preselezione del paziente con le informazioni cliniche fornite può contribuire ad incrementarne l efficacia diagnostica.
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