PLATELIA RUBELLA IgM 96 TEST 72851

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1 PLATELIA RUBELLA IgM 96 TEST DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgM ANTI-VIRUS DELLA ROSOLIA NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO MEDIANTE DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO

2 1. USO PREVISTO Platelia Rubella IgM è un dosaggio che utilizza il metodo ad immunocattura per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM anti-virus della rosolia nel siero o nel plasma umano. 2. INTERESSE CLINICO La rosolia è una patologia ad eziologia virale diffusa in tutto il mondo. Si tratta prevalentemente di un'infezione benigna a volte non manifesta che colpisce i bambini e gli adulti. A livello clinico, si manifesta con rash cutanei generalizzati su tutto il corpo, febbre leggera, cefalea e talvolta mal di gola. L'infezione da rosolia è grave durante la gravidanza, essa comporta infatti molte complicanze per il feto, tra cui sordità, cataratte, ritardo mentale del neonato e a volte morte del feto. L'immunizzazione dei bambini in età scolare ha notevolmente ridotto l'incidenza delle epidemie di rosolia. Esiste tuttavia la necessità di un accurato monitoraggio dello stato immune, specialmente per delle donne in età fertile. Il rilevamento della presenza di anticorpi di classe IgG contro il virus della rosolia mediante test eseguito precedentemente al concepimento garantisce al feto una protezione in caso di possibili epidemie virali di rosolia durante la gravidanza. L'efficacia della vaccinazione è altresì dimostrata tramite la determinazione, successivamente all'immunizzazione, degli anticorpi della classe IgG contro il virus della rosolia. Fin da quando il virus della rosolia è stato isolato nel 1962, il rilevamento degli anticorpi specifici per questo virus ha suscitato notevole interesse a causa del rischio teratogenico legato alla possibilità di infezione primaria all'inizio della gravidanza. I primi metodi utilizzati per il rilevamento degli anticorpi sono stati i test di neutralizzazione, la reazione di fissazione del complemento e la tecnica di immunofluorescenza. Si tratta di test difficili da inserire nella routine di un laboratorio ed inoltre poco riproducibili. Più di recente, le tecniche di inibizione dell'emoagglutinazione hanno consentito una diagnosi rapida sia dello stato di infezione acuta sia dello stato immunologico del paziente. Nel 1971, Engvall e Perlmann descrissero i primi test che utilizzavano il metodo immunoenzimatico. Lo sviluppo di tali metodi ha contribuito a migliorare la specificità e la sensibilità delle tecniche di ricerca di una ampia gamma di antigeni e di anticorpi. L interpretazione di test sierologici ripetuti, che evidenziano la presenza di IgM, l'insorgenza o un incremento significativo del titolo delle IgG (titolo raddoppiato) tra due campioni di siero prelevati a una distanza di almeno tre settimane, giocherebbero a favore di un'esposizione al virus della rosolia, anche quando non sono presenti i sintomi clinici di questa infezione. 66

3 3. PRINCIPIO Platelia Rubella IgM è un test qualitativo per la determinazione degli anticorpi IgM anti-virus della rosolia nel siero o nel plasma umano mediante immunodosaggio enzimatico con cattura degli anticorpi IgM in fase solida. Gli anticorpi anti-catene µ umane sono adesi alla fase solida (pozzetti della micropiastra). Come coniugato viene utilizzata una miscela dell'antigene rubella e dell'anticorpo monoclonale anti-antigene rubella marcato con perossidasi. Il test prevede le seguenti fasi: Fase 1 I campioni dei pazienti, il calibratore e i controlli vengono diluiti in rapporto 1/21, quindi distribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, gli anticorpi IgM presenti nel campione si legano agli anticorpi anti-µ adesi ai pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi non specifici non legati e altre proteine seriche vengono eliminati dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 2 Il coniugato (miscela di antigene rubella e anticorpo monoclonale anti-rubella marcato con perossidasi) viene aggiunto nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, il coniugato si lega agli anticorpi IgM specifici anti-rubella. Il coniugato non legato viene eliminato dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 3 La presenza di immunocomplessi (Anti-catene µ umane / IgM anti-rubella / Antigene rubella / anticorpo anti-rubella marcato con perossidasi) viene dimostrata attraverso l'aggiunta di una soluzione di sviluppo enzimatica in ogni pozzetto. Fase 4 Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente (18-30 C), la reazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con uno spettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla quantità di anticorpi IgM anti-rubella presenti nel campione. 67

4 4. INFORMAZIONI SUL PRODOTTO Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l'esecuzione di 96 test. Tutti i reagenti sono destinati esclusivamente all uso diagnostico in vitro. Marcatura Natura dei reagenti Presentazione R1 Microplate Micropiastra : (Pronta per l'uso) : 12 strip con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzati con anticorpi anti-catene µ umane 1 R2 R3 Concentrated Washing Solution (20x) Negative Control Soluzione di lavaggio concentrata (20x) : Tampone TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Conservante: < 1,5% ProClin 300 Controllo negativo : Siero umano negativo per anticorpi IgM anti-rubella e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R4 Calibrator Calibratore : Siero umano reattivo per anticorpi IgM anti-rubella e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R5 Positive Control Controllo positivo : Siero umano reattivo per anticorpi IgM anti-rubella e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R6a Antigen Antigene rubella : Antigene rubella liofilizzato Conservante: < 1,5% ProClin 300 R6b Conjugate (101x) Coniugato (101 x) : Anticorpo monoclonale murino anti-rubella marcato con perossidasi Conservante: < 1,5% ProClin 300 R7 Diluent Diluente per campioni e coniugato : (Pronto per l'uso) : Tampone Tris-NaCl (ph 7,6), albumina bovina serica, 0,1% Tween 20 e rosso di fenolo. Conservante: < 1,5% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 4 x qsp 8,0 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml 68

5 R9 Marcatura Natura dei reagenti Presentazione Chromogen Cromogeno (Pronto per l'uso): 1 x 28 ml TMB 3,3.5,5 tetrametilbenzidina (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) R10 Stopping Solution Soluzione bloccante (Pronta per l'uso): Soluzione di acido solforico 1N 1 x 28 ml Pellicola adesiva per micropiastre 4 Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza, consultare le indicazioni riportate sulla confezione. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle buone prassi di laboratorio riportate di seguito: Non utilizzare reagenti scaduti. Non mischiare né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in una stessa seduta analitica OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo etichetta: 20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo etichetta: TMB color turchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo etichetta: 1N color rosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, a condizione che i reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzato un unico lotto in una stessa seduta analitica. OSSERVAZIONE: Inoltre, la Soluzione di Lavaggio (R2, identificazione dell etichetta : 20X di colore verde ) può essere miscelata con le altre 2 soluzioni di lavaggio incluse in vari kit di reattivi Bio-Rad (R2, identificazioni delle etichette : 10x di colore blu o 10x di colore arancione) una volta adeguatamente ricostituite, a condizione che all interno di una seduta analitica venga utilizzata solo una miscela. Prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). Ricostituire o diluire con cura i reagenti evitando contaminazioni. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure vetreria perfettamente lavata e sciacquata con acqua deionizzata Il lavaggio della micropiastra è una fase essenziale della procedura: eseguire il numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti. 69

6 Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno. La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere sostituito. Utilizzare puntali diversi per ogni campione. Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altre strumentazioni. 70 ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENE Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è stato analizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-hcv) e i virus dell'immunodeficienza umana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Dato che nessun metodo può garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi, manipolare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti. Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri direttamente in contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di origine umana deve essere considerato potenzialmente in grado di trasmettere malattie infettive. Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti. Non pipettare con la bocca. Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire le superfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquido contaminante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio, quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con carta assorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in un contenitore speciale per rifiuti contaminati. Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenti contenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotti contaminati mediante uno dei seguenti metodi: - immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% di ipocloruro di sodio per 30 minuti, - oppure lavaggio in autoclave a 121 C per almeno 2 ore. ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodio nell'autoclave

7 Evitare qualsiasi contatto dei reagenti, compresi quelli considerati non pericolosi, con la pelle e le mucose. La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devono essere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio. Tutti i reagenti forniti nel kit sono destinati esclusivamente all uso diagnostico in vitro. Attenzione: alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1,5% R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e Xi - Irritante abbondantemente con acqua e sapone. Indossare guanti adatti 6. PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 1. Il siero e il plasma (EDTA, eparina o citrato) sono i tipi di campione raccomandati. 2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioni ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni: Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso. Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di procedere alla centrifugazione. Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse. Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente. È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra 2 e 8 C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni. Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna, congelare i campioni a una temperatura di -20 C o inferiore. Non utilizzare campioni scongelati più di cinque volte. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo lo scongelamento e prima del test. 3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non coniugata, i campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di trioleina (trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a 10 g/l di emoglobina non influenzano i risultati. 4. Non riscaldare i campioni. 7. PROCEDURA 7.1 Materiale richiesto, ma non fornito Agitatore tipo Vortex. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*). Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su 37±1 C (*). 71

8 72 Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre (*). Acqua distillata o deionizzata sterile. Guanti monouso. Occhiali di sicurezza o antispruzzo. Carta assorbente. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e ml. Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio. Contenitore per rifiuti biologici. Provette monouso. (*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico. 7.2 Ricostituzione dei reagenti R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a temperatura ambiente ( C). Estrarre il vassoio, riporre immediatamente le strip non utilizzate nella bustina e verificare la presenza di essiccante. Richiudere con cura la bustina e conservarla a +2-8 C. R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata: ad esempio 50 ml di R2 e 950 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione di lavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 ml di soluzione di lavaggio diluita per una piastra da 12 strip in caso di lavaggio manuale. R3, R4, R5: Diluire in rapporto 1/21 nel Diluente (R7) (esempio: 15 µl di R µl di R7). R6a: L antigene rubella è liofilizzato. Per l elaborazione di 3 strip, ricostituire un flacone di antigene liofilizzato aggiungendo 8 ml di Diluente (R7). Miscelare bene. Dopo la diluizione, la soluzione antigenica (R6a+R7) deve essere perfettamente limpida. R6 (R6a+R6b) - Soluzione di lavoro del coniugato: Aggiungere estemporaneamente 80 µl di coniugato (R6b) in ogni flacone di antigene rubella ricostituito (R6a diluito). Miscelare bene. La soluzione di lavoro del coniugato deve essere ricostituita almeno 1 ora prima dell uso. 7.3 Conservazione e validità dei reagenti aperti e / o ricostituiti Il kit deve essere conservato a 2-8 C. Se viene conservato a 2-8 C prima dell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta riportata sul kit. R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a 8 settimane, se conservate a 2-8 C nella stessa bustina sigillata (verificare la presenza di essiccante).

9 R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata per 2 settimane a 2-30 C. La Soluzione di lavaggio concentrata conservata a 2-30 C, in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. R3, R4, R5, R6b, R7: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a 8 settimane. R6 (R6a+R6b): Dopo la ricostituzione, la soluzione di lavoro del coniugato mantiene la stabilità per 8 ore a temperatura ambiente (18-30 C) o 2 settimane a +2-8 C. R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a 8 settimane. R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservato a 2-8 C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. 7.4 Procedura Seguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi di laboratorio. Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente ( C). Se si utilizzano pozzetti divisibili, prestare particolare attenzione durante la manipolazione. Utilizzare il calibratore, i controlli negativi e positivi in ogni seduta per convalidare i risultati del test. 1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per il calibratore, i controlli e i campioni dei pazienti. 2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 4. Preparare la soluzione di lavoro del coniugato R6 (R6a+R6b) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 5. Diluire il calibratore R4, i controlli R3, R5 e i campioni dei pazienti (S1, S2 ) nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/21: 15 µl di campione e 300 µl di Diluente (R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. Vortexare i campioni diluiti. 6. Distribuire in ogni pozzetto 200 µl di calibratore, di controlli diluiti e di campioni dei pazienti secondo lo schema riportato di seguito: 73

10 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 8. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 9. Distribuire 200 µl della soluzione di lavoro del coniugato (R6) in tutti i pozzetti. Agitare leggermente la soluzione prima dell'uso. 10. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 11. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 12. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl di Cromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Non utilizzare nastri sigillanti adesivi durante questo periodo di incubazione. 74

11 13. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo. 14. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a 450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Non esporre le strip alla luce prima della lettura. 15. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la lettura e il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni. 8. CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 8.1 Calcolo del valore soglia (cut-off) (CO) Il valore di Cut-Off (CO) corrisponde al valore medio delle densità ottiche (DO) dei duplicati del Calibratore (R4): CO = media di DO R4 8.2 Calcolo del rapporto Campione Il risultato per un campione viene espresso sotto forma di rapporto mediante la seguente formula: Rapporto Campione = DO campione/co 8.3 Controllo di qualità Includere il calibratore e tutti i controlli in ogni micropiastra e per ogni seduta di lavoro e analizzare i risultati ottenuti. Per la validazione del test, è necessario che siano soddisfatti i seguenti criteri: Valori delle densità ottiche: CO 0,300 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x CO 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x CO (La singola DO di ogni duplicato del calibratore (R4) non deve differire più del 20% dal valore CO). Rapporti delle densità ottiche: Rapporto R3 (DO R3 / CO) 0,30 Rapporto R5 (DO R5 / CO) 1,50 Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta analitica dovrà essere ripetuta. 75

12 8.4 Interpretazione dei risultati 8.5 Guida alla risoluzione dei problemi Le reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da: Lavaggi della micropiastra inadeguati. Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto titolo di anticorpi. Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici ossidanti (candeggina, ioni metallici...). Contaminazione della Soluzione bloccante. 9. PRESTAZIONI 9.1 Prevalenza La prevalenza degli anticorpi IgM anti-rubella mediante il test Platelia Rubella IgM (72851) è stata determinata su di un pannello di 347 campioni di donne in gravidanza. 2 campioni sono risultati positivi per gli anticorpi IgM anti-rubella. La prevalenza determinata mediante il test Platelia Rubella IgM si attesta intorno al 0,6% (2/347). L efficacia del kit Platelia Rubella IgM è stata valutata in 2 siti su un totale di 809 campioni di donne in gravidanza e donatori di sangue. In un centro, è stato effettuato uno studio comparativo utilizzando il Kit Platelia Rubella IgM TMB (72922) ; nell altro centro, le prestazioni del Kit Platelia Rubella IgM sono state confrontate con un altro test EIA in commercio. 9.2 Studi comparativi (sito 1) Le prestazioni del kit Platelia Rubella IgM sono state determinate su un pannello di 399 campioni ripartiti come segue: 172 sieri di donatori di sangue 151 sieri di donne in gravidanza 76 sieri di pannelli commerciali 76 Rapporto campione Risultato Interpretazione Rapporto < 0,80 Negativo Il campione è considerato non reattivo per la presenza di anticorpi IgM anti-rubella. 0,80 Rapporto < 1,00 Equivoco Il campione è considerato equivoco per la presenza di anticorpi IgM anti-rubella. Il risultato deve essere confermato da un altro test eseguito su un secondo campione prelevato ad almeno 3 settimane di distanza dalla data della prima analisi. Rapporto 1,00 Positivo Il campione è considerato reattivo per la presenza di anticorpi IgM anti-rubella.

13 Platelia Rubella IgM (72851) Platelia Rubella IgM TMB (72922) Negativo Equivoco Positivo Totale Negativo Equivoco Positivo Totale Concordanza globale 396 / ,25% [IC 95% = 97,82% - 99,84%] Specificità relativa 319 / ,38%* [IC 95% = 97,77-99,92%] Sensibilità relativa 77 / 78 98,72% [IC 95% = 93,06-99,97%] *equivoci sono stati considerati positivi [IC 95%] = intervallo di confidenza 95%. In aggiunta, 60 sieri da 7 follow-up di vaccinazione (effettuate con due tipi di vaccini) sono stati valutati con i due Kit: la cinetica di comparsa di IgM anti- Rosolia segue lo stesso andamento per i 2 Kit. 9.3 Efficacia (sito 2) Le prestazioni sono state determinate su un panello di 350 campioni che provengono da: 47 bambini di età inferiore a 15 anni (27 femmine e 20 maschi) 299 adulti (298 donne in gravidanza o che hanno appena partorito e 1 maschio) 1 siero del controllo di qualità nazionale francese. I risultati sono stati comparati con quelli ottenuti con un altro Kit commerciale EIA preso come riferimento. Platelia Rubella IgM (72851) Altro test commerciale EIA Negativo Equivoco Positivo Totale Negativo Equivoco Positivo Totale Specificità relativa 344 / ,71%* [IC 95% = 98,40-99,99%] *equivoci sono stati considerati positivi [IC 95%] = intervallo di confidenza 95%. Fra i 5 sieri positivi : i 4 campioni positivi concordanti sono stati prelevati dalla stessa persona in tempi differenti. il siero discordante positivo è stato confermato positivo con un terzo Kit EIA e corrispondeva ad un prelievo effettuato 4 mesi dopo vaccinazione. 77

14 9.4 Reattività crociata Un pannello di 212 campioni costituito da 164 campioni positivi per i marker CMV, toxoplasmosi, EBV, HSV, VZV, parotite, morbillo e HIV e 48 campioni positivi per il fattore reumatoide, auto-anticorpi e anticorpi eterofili e campioni di pazienti con mieloma è stato testato con il test Platelia Rubella IgM e un test EIA per lo screening degli anticorpi IgM anti-rosolia. Fra questi campioni, 1 campione di CMV IgM è stato trovato positivo discordante e 6 campioni da pazienti con fattore reumatoide sono stati trovati positivi o dubbi con entrambe i Kit. Quattro di questi 6 campioni sono stati confermati negativi per mezzo di altri Kit commerciali EIA. 9.5 Precisione Precisione intra-saggio (ripetibilità): Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo e tre campioni positivi sono stati analizzati 30 volte durante lo stesso ciclo. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: Precisione intra-saggio (ripetibilità) N=30 Campione negativo Campione debolmente positivo Campione positivo Campione fortemente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,07 1,73 2,51 4,06 DS 0,002 0,03 0,06 0,11 % CV 2,7% 1,8% 2,5% 2,7% Precisione inter-saggio (riproducibilità): Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, tutti e quattro i campioni (uno negativo e tre positivi) sono stati analizzati in duplicato in due cicli al giorno per un periodo di oltre 20 giorni. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: Precisione inter-saggio (riproducibilità) N=80 Campione negativo Campione debolmente positivo Campione positivo Campione fortemente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,04 1,19 2,24 3,60 DS 0,005 0,03 0,06 0,10 % CV 12,7% 2,8% 2,6% 2,8% 78

15 10. LIMITI DELLA PROCEDURA La diagnosi dell'infezione da rubella può essere stabilita solamente sulla base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di un singolo test di titolazione degli anticorpi IgM anti-rubella non costituisce una prova sufficiente per una diagnosi di infezione recente da virus della rosolia. Solo una combinazione di dati clinici e biologici (significativo aumento degli anticorpi IgG anti-rubella in 2 sieri prelevati da uno stesso paziente a distanza di 3 settimane e analizzati in una stessa seduta analitica, presenza di un livello significativo di IgM anti-rubella, determinazione di IgG a bassa avidità) può confermare la diagnosi di un infezione recente. La sola presenza di anticorpi IgM anti-rubella non costituisce una prova sufficiente per confermare un infezione recente poiché gli anticorpi IgM possono persistere per numerosi mesi o persino per anni dopo l infezione. In presenza di IgM, è necessario eseguire una determinazione quantitativa degli anticorpi IgG anti-rubella, nonché un controllo dell evoluzione degli anticorpi anti-rubella su almeno un secondo campione prelevato tre settimane più tardi. Se un campione viene analizzato troppo precocemente durante una primoinfezione, gli anticorpi IgM anti-rubella potrebbero non essere ancora presenti. In caso di dubbio, è necessario eseguire un secondo prelievo circa 3 settimane più tardi sul quale verrà ripetuta la ricerca delle IgM. Campioni positivi per la presenza di fattore reumatoide possono dare risultati falsamente positivi 11. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad. 12. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Vedere la versione Inglese. 79

16 12. REFERENCES 1. COOPER, L.Z., BUIMOVICI-KLEIN, E : Rubella. In Virology: Edited by Fields, B.N., et al. New York, New York: Raven Press. 2. DORSETT, P.H., MILLER, D.C., GREEN, K., BYRD, F : Structure and function of the Rubella virus proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 150-S FORSGREN, M : Standardization of techniques and reagents for the study of Rubella antibody. Rev. Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 129-S KALKKINEN, N., OKER-BLOM, C., AND PETTERSSON, R.F : Three genes code for Rubella virus structural proteins El. E2a, E2b, and C. J. Gen. Virol, 65: LUCAS, G., et al. April 17-20, : Serological diagnosis of IgG immunoglobulins ant-rubella by immunoenzymatic assay in a commercially available kit. Nice: 4th European Congress of Clinical Microbiology. 308/PP MAURIN, J : Le virus de la rubéole. Bulletin de l Institut Pasteur 1969, 67, Virologie médicale, chap. 34, Flammarion Médecine Sciences. 7. NCCLS Document I/LA6-T Tentative Guideline December 1992 : Evaluation and Performance Criteria for Multiple Component Test and Product intended for the Detection and Quantitation of Rubella IgG Test Products. 8. PETTERSSON, R., et al : Molecular and antigenic characteristics and synthesis of Rubella virus structural proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 140-S WOLINSKY J.S. : Rubella. In Virology, 1990, 2nd Ed Edited by Fields, B.N., and al. New York: Raven Press, Ltd. 15

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