La diagnostica sierologica per toxoplasmosi e rosolia sui sistemi automatici per immunometria Beckman Coulter

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1 La diagnostica sierologica per toxoplasmosi e rosolia sui sistemi automatici per immunometria Beckman Coulter Maria Chiara Anelli Beckman Coulter SpA LA TOXOPLASMOSI La Toxoplasmosi è un infezione causata dallo sporozoo Toxoplasma gondii, e può essere acquisita da una gran varietà di mammiferi o di uccelli infettati, sia per ingestione di alimenti crudi che di materiale contaminato dalle loro feci. La diffusione di questa infezione dipende dall età e dalla posizione geografica della popolazione, e la sua prevalenza varia con le condizioni ambientali, igieniche e con l età: per esempio in Francia (area di Parigi), l 80% della popolazione adulta ha anticorpi IgG T. gondii-specifici; negli Stati Uniti, circa il 50% della popolazione ha gli anticorpi specifici; in alcune aree degli Stati Uniti invece, solo il 5-15% delle donne in età fertile ha anticorpi IgG tali da risultare protettivi. Secondo alcuni studi, l incidenza di infezioni congenite è stimata tra 1 ogni 1000 e 1 ogni 8000 nati/anno. L infezione contratta durante la gravidanza può essere trasmessa al feto durante la fase parassitemica mediante passaggio transplacentare diretto dello sporozoo oppure differito mediante cisti tissutali eccezionalmente presenti nel tessuto placentare. In pazienti affetti da AIDS, cancro e leucemia, che hanno deficit immunitario con particolare carenza di linfociti CD4 positivi, può verificarsi una riattivazione endogena dell infezione. Nei pazienti sieropositivi la forma più grave che viene riscontrata è tipicamente quella neurologica, che può comparire dal 3% al 50% dei casi. LA RICERCA DEGLI ANTICORPI Come in tutte le infezioni, anche nel caso dell infezione da Toxoplasma gondii le prime immunoglobuline che compaiono in circolo sono le IgM specifiche, che scompaiono dopo qualche settimana o pochi mesi per lasciare spazio alla produzione di IgG specifiche; queste compaiono più lentamente e raggiungono un picco caratteristico. Le prime metodiche utilizzate per la determinazione anticorpale comprendevano la neutralizzazione del siero, il legame del complemento o l immunofluorescenza. Tali test sono di difficile esecuzione e presentano problemi di riproducibilità. In seguito, le tecniche di inibizione dell emoagglutinazione hanno consentito una più rapida diagnosi sia dello stadio dell infezione acuta che dello stato immunitario del paziente. Nel 1971, Engvall e Perlmann hanno descritto le prime procedure di dosaggio immunoenzimatico. La messa a punto di tali metodiche ha portato ad una migliore specificità e sensibilità per le tecniche di ricerca con antigeni ed anticorpi. Successivamente l automazione ha implementato la riproducibilità e l affidabilità analitica. (Tab. 1) La caratterizzazione delle IgM specifiche, indicative di un infezione in fase acuta, può comportare il rischio di determinazione falsamente positive o falsamente negative. I reperti falsamente positivi sono dovuti alla presenza di sostanze interferenti quali fattori reumatoidi o anticorpi anti nucleo, i falsi negativi sono dovuti alla competitività tra IgG e IgM nella fase tardiva della risposta immunitaria di tipo primario. Nel feto e nel neonato bisogna inoltre considerare la possibilità di reperti falsamente negativi dovuti all interferenza di IgG materne. Per cercare di risolvere questi problemi molte aziende produttrici hanno messo a punto test immunoenzimantici a doppio sandwich con cattura in fase solida delle IgM specifiche. Rimangono comunque aperti problemi di natura interpretativa in alcuni casi particolari: riscontro di IgM specifiche in presenza di IgG specifiche, presenza di IgG specifiche ad alto titolo in assenza di IgM, presenza di IgM specifiche non seguita dalla comparsa di IgG specifiche; in questi casi può essere di aiuto il dosaggio delle IgA specifiche. I TEST TOXO IgM E TOXO IgG SUI SISTEMI ACCESS I test Toxo IgM II e Toxo IgG possono essere eseguiti in completa automazione sugli analizzatori Beckman Coulter Access, Access2, Synchron Lxi 725 e UniCel DxI 800. Il test Access Toxo IgM II è un analisi immunoenzimatica con substrato chemiluminescente (Lumi-Phos* 530) basata sul principio dell immunocattura; il test Access Toxo IgG Tabella 1 Evoluzione metodologica nella determinazione di Anticorpi anti T.Gondii Tecnica Antigene impiegato Immunoglobuline riconosciute Dye test parassita vivo IgG + (IgM) Immunofluorescenza (I.F.) parassita integro (formalina) IgG, IgM, Ig totali Agglutinazione diretta (AD) parassita integro (formalina) IgG, Ig totali ISAGA parassita integro (formalina) IgM, IgA, IgE Lattice citoplasma Ig totali Emoaglutinazione citoplasma + membrana IgG + IgM ELISA convenzionale diretta citoplasma + membrana IgG Immunocattura (ELISA) citoplasma + membrana IgM, IgA 58 LigandAssay 10 (1) 2005

2 Tabella 2 Caratteristiche metodologiche dei test per Toxoplasmosi (IgM e IgG) e per Rosolia (IgM e IgG) sui sistemi Access Analita (Tipo - Unità) Toxo IgM II (QL - S/CO) Toxo IgG (QT - Ul/mL) Rubella IgM (QL - AU/mL) Rubella IgG (QT - Ul/mL) Principio Immunocattua 2 step Sandwich 2 Step Immunocattua 2 step Sandwich 2 Step Ab (Ag) su fase solida PoAb pecora anti-igm Toxo Ag (RH) PoAb capra anti-igm Rubella Ag (HPV77) Ab (Ag) coniugato fosfatasi alcalina T. gondii inatt.+ MoAb topo anti T. gondii - MoAb topo anti-igg MoAb topo anti-rub + Rubella Ag MoAb topo anti-igg umane IgM specifico (P30) Valori di riferimento neg<0.8<ind<1<pos neg < 4 <ind < 6 < pos neg<10<ind<15<pos neg<10<ind<15<pos Calcolo cut-off smoothing spline smoothing spline smoothing spline Punti di calibrazione 2 (2CO + 2C1) 6 x 2 4 x 2 6 x 2 Standard Standard interno WHO 2 ISP per siero Anti-Toxo Standard interno WHO 2 ISP per siero Anti-Rubella utilizza invece tecnica indiretta. (Tab. 2) Confronto tra metodi La Tabella 3 riporta i risultati di confronto per Access Toxo IgM II con un metodo EIA di riferimento mentre la Tabella 4 riporta analoghi test di confronto condotti in tre centri indipendenti (due in Francia e uno negli Stati Uniti occidentali) fra il test Access Toxo IgG e un test EIA su micropiastra disponibile in commercio, volti a confrontarne la validità clinica. In questi studi si sono utilizzati anche campioni retrospettivi (congelati) per rendere più rapido l ottenimento del numero desiderato di campioni reattivi e non reattivi, con l intento di avere sufficiente base di valutazione per l analisi statistica. Tali campioni possono essere stati congelati/scongelati più di una volta. In uno studio interno, la validità dell analisi non è risultata influenzata dall uso di campioni freschi rispetto a quelli congelati/scongelati fino a tre volte. Studi di specificità Si è valutata la specificità del test Access Toxo IgM II in due centri indipendenti in Francia confrontandola con quella di un test EIA disponibile in commercio. Sono stati valutati un totale di 1035 campioni (174 donatori di sangue, 50 uomini e 811 donne gravide). Si è quindi utilizzato un test di agglutinazione quale tecnica indipendente di conferma atta a risolvere i risultati discordanti. I risultati dubbi o non confermati dalla tecnica di conferma non sono stati presi in considerazione per il calcolo, fra di essi due risultati dubbi ottenuti con Access. Si è ottenuta una specificità del 99,90% (1034/1035); dieci campioni sono stati esclusi dal calcolo. Studi di sensibilità Si è valutata la sensibilità del test Access Toxo IgM II in due centri indipendenti in Francia confrontandola con quella di un test EIA disponibile in commercio. Sono stati valutati un totale di 180 campioni di donne gravide. Si è quindi utilizzato un test di agglutinazione quale terza tecnica atta a risolvere i risultati discordanti. I risultati dubbi o non confermati dalla terza tecnica, non sono stati presi in considerazione per il calcolo. Si è ottenuta una sensibilità del 98,88% (178/180). I due risultati discordanti corrispondono a un infezione pregressa con IgM residue; tre campioni Tabella 3 Confronto tra Access Toxo IgM II ed EIA Campioni freschi Campioni congelati n % LC 95% n % LC 95% Concordanza relativa a) 182/185 98,4 96,6-100,0 655/674 98,7 97,8-99,5 Sensibilità relativa 8/9 88,9 68,2-100,0 169/172 98,3 96,3-100,0 Specificità relativa 174/176 98,9 97,2-100,0 496/502 98,8 97,9-99,7 a) Campioni dubbi per Toxo IgM II: 1/188 (0,53%) su campioni freschi e 1/678 (0,15%) su campioni congelati Tabella 4 Confronto tra Access Toxo IgG ed EIA Campioni freschi Campioni congelati n % LC 95% n % LC 95% Concordanza relativa 54/54 100,0 83,2-100,0 1535/ ,4 94,5-100,0 Sensibilità relativa 24/24 100,0 83,2-100,0 725/731 99,2 94,5-100,0 Specificità relativa 30/30 100,0 86,3-100,0 810/812 99,7 96,6-100,0 LigandAssay 10 (1)

3 sono stati esclusi dal calcolo. Con lo stesso obiettivo si sono valutati 73 pannelli (185 sieri) di infezione da sieroconversione o follow-up (centro 1) e 28 pannelli (86 sieri) di sieroconversione (centro 2): su questi pannelli è stata rilevata una sensibilità del 100%. Studi di sieroconversione Sono stati inoltre prelevati dei campioni multipli da pazienti con sospetta infezione recente da Toxoplasma per controllare la sieroconversione. Questi campioni seriali di siero provenienti da 43 pazienti diversi sono stati esaminati con il test Access Toxo IgG, un test EIA specifico per gli anticorpi IgG anti-t. gondii e un test EIA specifico per gli anticorpi IgM anti-t. gondii. Dei 139 campioni dei pazienti esaminati, 87 sono risultati positivi e 52 negativi. Il test Access Toxo IgG ha individuato correttamente 85 dei campioni positivi e tutti i campioni negativi. La sensibilità e la specificità relative dell analisi su questa popolazione sono risultate, rispettivamente, del 98% e del 100%. L aumento di anticorpi IgG anti-t. gondii rilevato dall analisi Access Toxo IgG è risultato ben correlato con i crescenti titoli anticorpali di IgG anti-t. gondii determinati con la seconda analisi EIA. In questi soggetti, l evidenza di un infezione acuta da Toxoplasma è stata confermata da una positività al test per la determinazione degli anticorpi IgM anti-t. gondii. LA ROSOLIA Il virus della rosolia è l unico membro del genere Rubivirus, ed appartiene alla famiglia delle Togaviridae. E un virus a RNA, la cui singola elica serve direttamente da stampo per l RNA messaggero. Il genoma è costituito da una regione che codifica per proteine non strutturali e da una regione che codifica per tre proteine strutturali; il virus è dotato di un pericapside o envelope e di un nucleocapside icosaedrico. La rosolia ha una diffusione mondiale e l affezione si verifica di solito più frequentemente in primavera e nei mesi invernali. I tassi di incidenza variano a seconda del ciclo epidemico, del numero di soggetti sensibili in una popolazione e dei contatti interpersonali all interno del gruppo. Questa patologia è più diffusa fra i bambini di età compresa fra i 5 e i 9 anni. L infezione avviene prevalentemente per via aerea ed è solitamente benigna, o talvolta silente nei bambini e negli adulti. Le sue manifestazioni cliniche comprendono un esantema cutaneo generalizzato su tutto il corpo, un lieve rialzo della temperatura, cefalea e talvolta faringite. Diversi paesi hanno messo in atto programmi di immunizzazione di massa per bambini intorno ai 15 mesi di età. LA ROSOLIA IN GRAVIDANZA Le infezioni contratte in utero, particolarmente nel corso dei primi quattro mesi di gravidanza possono determinare difetti congeniti gravi quali sordità, affezioni cardiache, cataratta o glaucoma e talvolta anche la morte del feto. In molte aree, la vaccinazione dei bambini in età scolare ha significativamente ridotto l incidenza delle epidemie di rosolia. Tuttavia, lo screening sistematico delle donne sieronegative alla rosolia, soprattutto in epoca preconcezionale, rimane piuttosto comune. La presenza di anticorpi IgG anti-rosolia in una donna Figura 1 Schema operativo per la valutazione dello stato immunologico in pazienti non gravide 60 LigandAssay 10 (1) 2005

4 prima del concepimento assicura una protezione del feto contro infezioni virali da rosolia durante la gravidanza. L efficacia della vaccinazione è dimostrata dalla presenza di anticorpi IgG anti-rosolia nel siero in seguito ad immunizzazione (da malattia pregressa o da vaccinazione). La comparsa o l aumento significativo delle concentrazioni di IgG specifiche in due campioni di siero prelevati ad almeno due settimane di distanza l uno dall altro è indice di infezione da Figura 2 Schema operativo per la valutazione dello stato immunologico in pazienti gravide Figura 3 Schema operativo per la valutazione dello stato immunologico in pazienti gravide con esposizione recente (0-15 giorni) a possibile fonte di infezione LigandAssay 10 (1)

5 Figura 4 Schema operativo per la valutazione dello stato immunologico in pazienti gravide con sintomi clinici di infezione da rosolia o controllo tardivo dopo esposizione a possibile fonte di infezione rosolia, anche in pazienti asintomatici. Nelle Figure da 1 a 4 sono rappresentati gli schemi operativi suggeriti per le varie tipologie di pazienti sottoposte ad indagini per valutarne la situazione immunologica nei confronti del virus della rosolia. LA RICERCA DEGLI ANTICORPI La diagnosi di un infezione acuta da rosolia si basa su diversi parametri clinici e sierologici: la presenza di anticorpi delle classi IgM e/o IgG; la comparsa, o un aumento significativo, del titolo di IgG fra due campioni prelevati ad un intervallo di almeno due settimane; la comparsa dei sintomi classici e soprattutto di un esantema ben definito. La necessità di diagnosi differenziale in presenza di un quadro clinico sospetto e la ricerca di un infezione congenita nel feto o nel neonato costituiscono una delle principali indicazioni per la ricerca della presenza di IgM specifiche, che denota un rischio di infezione primaria da rosolia. La ricerca delle IgM specifiche è indispensabile anche per il monitoraggio di donne gravide senza protezione anticorpale (IgG anti-virus della rosolia), in quanto le infezioni da rosolia spesso non presentano manifestazioni cliniche, ed il monitoraggio sierologico può consentire la determinazione precoce della sieroconversione e di una infezione potenziale del feto. I TEST RUBELLA IgM E IgG SUI SISTEMI ACCESS Il test Access Rubella IgM può essere eseguito in completa automazione sugli analizzatori Beckman Coulter Access, Access2 e UniCel DxI 800; il test Access Rubella IgG può essere eseguito in completa automazione sugli analizzatori Beckman Coulter Access, Access2, Synchron Lxi 725 e UniCel DxI 800. L analisi Access Rubella IgM è un dosaggio immunoenzimatico con substrato chemiluminescente (Lumi-Phos* 530) che si avvale del principio dell immunocattura; il test Access Rubella IgG utilizza invece tecnica indiretta. (Tab. 2) Studi di specificità Per lo studio sulla specificità, i sieri sono stati prelevati Tabella 5 Confronto tra Access Rubella IgG ed HAI Campioni freschi Campioni congelati n % LC 95% n % LC 95% Concordanza relativa 50/50 100,0 62,8-100,0 702/713 98,4 93,4-100,0 Sensibilità relativa 42/42 100,0 83,2-100,0 544/554 98,2 93,4-100,0 Specificità relativa 8/8 100,0 62,8-100,0 158/159 99,4 94,2-100,0 62 LigandAssay 10 (1) 2005

6 da donatori di sangue o da donne gravide. La specificità relativa del test Access Rubella IgM rispetto a una metodica disponibile in commercio è risultata pari al 99,7% (1061 risultati concordanti su 1064). Studi di sensibilità Sono stati condotti studi sulla sensibilità analizzando sieri isolati di donne gravide con infezione acuta, di pazienti in corso di sieroconversione e di soggetti seguiti durante la vaccinazione. La sensibilità è stata inoltre valutata su 3 pannelli disponibili in commercio. Tutti i 63 campioni con infezione acuta sono risultati positivi al test Access Rubella IgM con una sensibilità del 100%. Dei 18 campioni di pazienti in corso di sieroconversione, 14 hanno dato gli stessi risultati (12 rilevabili, 2 non rilevabili) di una metodica EIA disponibile in commercio utilizzata per il confronto; due campioni sono stati identificati più precocemente con il test Access Rubella IgM. Dei due campioni discordanti, uno ha dato risultati dubbi con Access e negativi con EIA, mentre l altro è risultato negativo al test Access e dubbio al test EIA all analisi del secondo campione. Nei soggetti seguiti durante la vaccinazione e nei 3 pannelli disponibili in commercio (n= 22 campioni), gli anticorpi IgM anti-rosolia sono stati ugualmente rilevati dal test Access e dal test EIA disponibile in commercio in 20 casi con una sensibilità relativa del 100%. Confronto tra metodi In Francia, due centri indipendenti hanno confrontato la validità clinica del test Access Rubella IgG rispetto al test HAI, esaminando un totale di 784 pazienti. (Tab 5) Nel primo centro 399 dei campioni sono stati prelevati da donne gravide, seguite nel quadro dello studio sierologico obbligatorio condotto in Francia sulle gravide che prevede il monitoraggio mensile delle pazienti che risultano sieronegative. Undici dei campioni del centro (tutti provenienti da donne gravide) sono risultati incerti e non sono quindi stati inclusi nel calcolo dei risultati. Nel secondo centro 290 campioni provenivano da donne gravide; di queste, dieci (tutte donne, 8 gravide) sono risultati incerti e non sono quindi stati considerati per il calcolo dei risultati. I campioni prospettici provenivano da una popolazione sana di donne gravide (28) non gravide (18) e uomini (4). Risultati del pannello CDC Le informazioni che seguono sono state ottenute da un pannello di sieri provenienti dal Center for Disease Control (Centro per il controllo delle malattie) e testati da un centro esterno con il kit Access Rubella IgG. I risultati vengono presentati al fine di fornire ulteriori informazioni circa la validità di quest analisi con un pannello di sieri caratterizzati e mascherati; ciò tuttavia non implica alcun riconoscimento del test da parte del CDC. Il pannello consiste di 82 sieri positivi e 18 sieri negativi. Il test Access Rubella IgG ha mostrato una concordanza totale del 100% con i risultati del CDC, cioè una concordanza del 100% per i campioni positivi e del 100% per i campioni negativi. Risultati dello standard biologico CDC Lo standard biologico CDC del siero di riferimento umano anti-rosolia a basso titolo (21,0 UI/mL) è stato testato puro e diluito 1:2 come descritto nel documento NCCLS I/LA6-A in tre centri esterni. La media dei risultati dei tre centri ottenuta con il test Access Rubella IgG è risultata di 25,1 UI/mL per il campione puro e di 11,8 UI/mL per il campione diluito 1:2. BIBLIOGRAFIA DI RIFERIMENTO 1. Dubey JP, Beattie CP. Toxoplasmosis of animals and man. Boca Raton. in CRC. Press. 1988, Couvreur J, Thulliez Ph. Devenir des toxoplasmoses congénitales. J Péd Puér, 1989; 2: Remington JS, McLeod R, Desmonts G. Toxoplasmosis in: Remington JS, Klein. JO Infectious diseases of the fetus and newborn infant. 4th Ed. The WB Saunders. 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Rev Infect Dis 1985; 7 (Suppl. 1): Approved Guideline - Detection and Quantitation of Rubella IgG Antibody: Evaluation and Performance Criteria for Multiple Component Test Products, Specimen Handling, and Use of Test Products in the Clinical Laboratory -/LA6-T National Committee for Clinical Laboratory Standards Per corrispondenza: Dott.ssa Maria Chiara Anelli Immunochemistry Sales Support Beckman Coulter SpA Via Roma 108, Palazzo F/1 Centro Direzionale Lombardo Cassina de Pecchi, Milano Tel: Fax: LigandAssay 10 (1)

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