Diversità nel ciclo cellulare tra cellule dell organismo adulto e cellule embrionali

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1 Diversità nel ciclo cellulare tra cellule dell organismo adulto e cellule embrionali

2 La durata del ciclo varia molto, nelle cellule embrionali le fasi G1 e G2 sono quasi inesistenti La durata della fase G1 è molto variabile e condiziona la durata complessiva del ciclo cellulare Nella fase G1 la cellula compie le sue normali funzioni metaboliche proprie del suo stato di differenziamento, cresce ed accumula ATP per entrare in fase S e quindi in Mitosi

3 La fase S ha una durata costante per le varie cellule di un organismo, dipende dalla quantità di DNA La fase S necessita di una grande quantità di ATP per la duplicazione del DNA e la formazione della cromatina Anche la fase G2 ha una durata costante, è il completamento delle sintesi per l allestimento del meccanismo molecolare per la mitosi (M)

4 La fase G1 può durare ore, giorni, settimane o più a lungo, dipende dal tipo cellulare Quando la fase G1 si protrae a lungo, si parla di Go, cioè una fase stazionaria di attesa, oppure di Gz se l uscita dal ciclo è irreversibile Il ritorno da Go a G1 ed il passaggio da G1 a S richiede l intervento di messaggi ambientali, chiamati mitogeni o fattori di crescita

5 Tre tipi di cellule con diversa durata ciclo cellulare: Cellule molto specializzate che hanno perso la capacità di dividersi e si trovano in fase Gz, irreversibile. Le cellule molto specializzate come le cellule nervose, le cellule muscolari, i globuli rossi hanno perso per sempre la capacità di dividersi Cellule differenziate che normalmente non si dividono, ma lo possono fare in risposta ad uno stimolo appropriato, per esempio le cellule del fegato che si trovano in fase G0 ma che possono tornare in G1 Cellule attivamente proliferanti come le cellule staminali. Hanno le fasi G1, S, G2 e Mitosi tutte le cellule che possono proliferare, cioè le cellule embrionali e le cellule staminali nei tessuti epiteliali e nel midollo osseo (globuli rossi e bianchi), le cellule germinali maschili.

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7 Divisione cellulare per Mitosi tipica di tutte le cellule sia somatiche che germinali da una cellula si formano due cellule con lo stesso DNA => Mantiene la ploidia della cellula

8 Divisione cellulare per Mitosi tipica di tutte le cellule sia somatiche che germinali da una cellula si formano due cellule con lo stesso DNA => Mantiene la ploidia della cellula Quattro Fasi: 1 a Profase; 2 a Metafase; 3 a Anafase; 4 a Telofase

9 PROFASE : -duplicazione dei centrioli -condensazione della cromatina per formare i cromosomi -scomparsa di nucleolo e di membrana nucleare -i centrioli sono un centro per l organizzazione dei microtubuli che formeranno il FUSO MITOTICO

10 METAFASE : i cromosomi si allineano all equatore della cellula, agganciati alle fibre del fuso mitotico che partono dai centrioli

11 A N A F A S E

12 TELOFASE : i cromosomi si decondensano, si riforma la membrana nucleare e ricompare il nucleolo

13 CITODIERESI

14 Un organismo DIPLOIDE riceve un cromosoma dal genitore femmina (= materno) ed un cromosoma dal genitore maschio (= paterno) Una coppia di cromosomi corrispondenti uno di origine materna e l altro paterna formano una coppia di omologhi

15 Durante la fase S ogni cromosoma viene duplicato e ogni copia completa (cromatide) resta unita all altra per la zona centrale del centromero sino alla fase M

16 Replicazione del DNA semi-conservativa Meccanismo di replicazione del DNA di Watson e Crick

17 Il progredire della cellula nel ciclo cellulare dipende dal superamento di tre checkpoint per entrare: (1) in fase S, (2) nella profase della Mitosi, (3) nell anafase

18 Evento fisico: Radiazioni X, g, UV o particelle cariche di alta energia ionizzano la materia biologica cedendo energia Evento radiochimico: Formazione di radicali liberi Evento biologico: Danno a carico di molecole importanti come DNA, membrane, etc.

19 Danno al DNA non riparato o mal riparato MUTAZIONE La riparazione del DNA danneggiato ha una funzione centrale non solo nella protezione del genoma ma anche nella generazione della diversità genetica che caratterizza gli individui di una stessa specie Riparazione del DNA ed Evoluzione Mutazioni e ricombinazione sono necessari per l evoluzione, la velocità di riparazione del DNA la velocità di evoluzione influenza Riparazione efficace significa evoluzione lenta ma specie stabili I sistemi di riparazione del DNA negli Eucarioti hanno avuto il massimo sviluppo nel periodo geologico pre-cambriano

20 DNA: insufficiente riparazione del DNA è causa di patologie invecchiamento cellulare associato ad accumulo di danni Studi sperimentali sugli animali, in cui erano stati silenziati geni coinvolti nella riparazione del DNA, hanno evidenziato un accelerato invecchiamento, una manifestazione precoce di malattie connesse con l'età avanzata ed una aumentata suscettibilità a sviluppare neoplasie Patologie ereditarie associate con difetti nella riparazione del DNA determinano prematuro invecchiamento (come la sindrome di Werner)

21 Disordini ereditari nella riparazione del DNA sono responsabili di diversi disordini genetici, quali: Xeroderma pigmentoso: ipersensibilità alla luce solare/uv, che determina aumentata sensibilità ai carcinogeni e incidenza di cancro alla cute ed invecchiamento precoce Sindrome di Cockayne: ipersensibilità a raggi UV e ad agenti chimici

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25 P53 (Tumor Suppressor Gene) Mutata (inattivata) in più del 60% di tutti i tumori umani P53 regola (attiva o reprime) la trascrizione di più di 50 differenti geni La quantità di P53 attivata aumenta rapidamente quando c è un danno al DNA o si accumulano prodotti intermedi della riparazione

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27 APOPTOSI: è una opzione possibile per la Cellula apoptosi L apoptosi si manifesta con alterazioni tipiche della cellula che ne sta attuando il programma genetico L apoptosi viene spesso attivata in risposta ad una situazione di danno che permane e che non riesce ad essere compensata risposta allo stress restare e funzionare transdifferenziare ipertrofia crescere e dividersi dedifferenziare

28 APOPTOSI è una morte cellulare programmata, esecuzione di un complesso programma genetico l altra forma di morte cellulare - necrosi è invece una morte accidentale che si realizza in modo caotico e senza chiamare in causa trascrizione e traduzione la cellula in apoptosi si frammenta in corpi apoptotici che sono fagocitati dai fagociti APOPTOSI : quando? nel corso dello sviluppo embrionale/fetale, l apoptosi rimuove le cellule indesiderate; per esempio quelle della membrana interdigitale, circa metà dei neuroni in differenziamento, i linfociti che possono aggredire il self nei tessuti maturi che vanno incontro a rinnovamento, come le cellule del sangue e quelle epiteliali, l apoptosi è l autoeliminazione delle cellule vecchie e non più utili alcune cellule difensive si sacrificano nell espletamento della loro funzione di protezione del corpo, ad esempio i granulociti neutrofili o i linfociti le cellule infettate da virus impediscono la diffusione del contagio ad altre cellule attivando il programma genetico dell apoptosi l Apoptosi è usata nel continuo ricambio ciclico delle cellule dell endometrio uterino, del corpo luteo, dell epitelio della ghiandola mammaria

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30 Proliferazione Morte cellulare Omeostasi Accumulo Perdita cellulare

31 proliferazione di cellule staminali proliferazione con differenziamento

32 Le cellule di un organismo multicellulare pur avendo gli stessi geni, sono in grado di rispondere a segnali di differenziamento in modo variabile. Le cellule sono plastiche, sono in grado di eseguire la loro funzione specializzata pur mantenendo la capacità di adattarsi ai cambiamenti ambientali. Questo si realizza attraverso molteplici meccanismi che coinvolgono la regolazione diretta dello stato della cromatina in risposta a stimoli. E ancora poco conosciuto come le vie di trasduzione del segnale possano comunicare direttamente con cromatina per cambiare il paesaggio epigenetico, ma è sempre più evidente la possibilità che la cromatina agisca come sito di integrazione e di stoccaggio dei segnali. Nei mammiferi, le informazioni comunicate agli organi sensoriali sono trasmessi al sistema nervoso centrale, in cui l'informazione viene elaborata e convertita in una risposta fisiologica. A livello cellulare, le cascate di signalling trasmettono messaggi tramite proteine effettrici che raggiungono il nucleo, dove opportuni fattori di trascrizione attivano/inibiscono l espressione genica. Questo evento può essere di natura transitoria, ad esempio quando una cellula deve rispondere ad un evento acuto e poi tornare al suo precedente stato stazionario. Emerging roles for chromatin as a signal integration and storage platform - Nat Rev Mol Cell Biol Apr;14(4): doi: /nrm Badeaux AI, Shi Y.

33 A competitive protein interaction network buffers Oct4-mediated differentiation to promote pluripotency in embryonic stem cells - Descalzo et al. - Mol Syst Biol Oct 8;9:694. doi: /msb Nelle cellule staminali embrionali, la pluripotenza è mantenuta regolando l'attività di un piccolo insieme di fattori di trascrizione, tra cui sono particolarmente importanti (Oct4, Nanog, TCF3, β-catenina) che controllano l'espressione dell auto-rinnovamento e dei geni per il differenziamento Il blocco dell'attività trascrizionale di Oct4 sembra essere il principale determinante per uscire dalla condizione di pluripotenza

34 From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin - Ronan et al. - Nat Rev Genet May;14(5): doi: /nrg3413 La specializzazione che le cellule devono acquisire per formare un organismo da uno zigote viene ottenuta mediante cambiamenti graduali nell'espressione genica durante lo sviluppo embrionale. Questi cambiamenti avvengono in risposta sia a segnali extracellulari che a circuiti genetici presenti nel nucleo della cellula. I regolatori della cromatina contribuiscono ai cambiamenti dinamici di espressione genica, ma anche a mantenere i destini delle cellule, fornendo stati stabili ed ereditari di espressione genica. Molti regolatori cromatina sono essenziali per processi di sviluppo, compreso lo sviluppo del cervello. Recenti studi di sequenziamento genomico su individui affetti da disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrico hanno evidenziato mutazioni in molti regolatori della cromatina.

35 The Use of Induced Pluripotent Stem Cells in Drug Development - Clin Pharmacol Ther May;89(5): doi: /clpt Inoue H, Yamanaka S. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (ipsc) sta rivoluzionando la scienza medica, permettendo di esplorare i meccanismi di molte malattie, fornendo nuovi bersagli molecolari terapeutici, e offrendo nuove opportunità per la scoperta ed il testaggio di farmaci vecchi e nuovi L induzione di quattro geni codificanti per fattori di trascrizione (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-myc) basta per innescare la riprogrammazione di cellule somatiche umane e di topo per generare cellule somiglianti alle rispettive ESC Esistono già vari altri metodi alternativi per generare ipsc Le cellule ipsc hanno risolto i problemi di natura etico/morale connessi con la ricerca nel campo delle cellule staminali embrionali La tecnologia delle ipsc ci sta mettendo sempre di più nelle condizioni di sviluppare una efficiente medicina personalizzata

36 Utilizzando i sarcomi come modello sperimentale abbiamo dimostrato che: (1) tumori solidi umani dal cariotipo complesso possono essere riprogrammati ad uno stato pluripotente che soddisfa tutti i criteri in vitro utilizzati per definire le cellule staminali pluripotenti generate da cellule somatiche; (2) sarcomi riprogrammati possono essere differenziati in tessuto connettivo maturo e globuli rossi; (3) la differenziazione terminale dei sarcomi riprogrammati abolisce in modo irreversibile il loro potenziale oncogeno misurato dalla capacità di ulteriore proliferazione in vitro o negli xenotrapianti. Forse, la conclusione più sorprendente è che la riprogrammazione delle cellule tumorali dimostra la capacità delle cellule tumorali di impegnarsi nuovamente e completare l esecuzione di una normale via di differenziazione cellulare con conseguente perdita della cancerogenicità. Reprogramming cancer cells: back to the future - Oncogene, 32, (2013), doi: /onc ; publ online 6 august Lang J- Y, Shi Y & Chin YE

37 Vascularized and functional human liver from an ipsc-derived organ bud transplant - Nature Jul 25;499(7459): doi: /nature Takebe et al. La grave carenza di donatori di organi per il trattamento della insufficienza d'organo in fase terminale rende urgente la necessità di generare organi da cellule staminali pluripotenti indotte (ipsc). Fino ad ora nessun laboratorio era riuscito a generare un organo tridimensionale vascolarizzato come il fegato. Si dimostra la generazione di un fegato umano vascolarizzato e funzionale ottenuto dal trapianto di gemme di fegato formate da ipsc umane create in vitro. Queste gemme si collegano ai vasi sanguigni entro 48 ore dal trapianto e crescono portando alla formazione di tessuto simile al fegato adulto che presentava le funzioni fegato-specifiche, come la produzione di proteine e il metabolismo dei farmaci, con la possibilità di rendere non necessaria la sostituzione del fegato del destinatario. Questo è il primo lavoro che dimostra la generazione di un organo umano funzionale da cellule staminali pluripotenti. Ulteriori sforzi dovranno essere effettuati per tradurre queste tecniche in trattamenti per i pazienti, un nuovo promettente approccio per la medicina rigenerativa.

38 Vascularized and functional human liver from an ipsc-derived organ bud transplant - Nature Jul 25;499(7459): doi: /nature Takebe et al. Generazione di gemme di fegato umano da ipsc umane: (a) Schema del disegno sperimentale; (b) auto-organizzazione tridimensionali di umane in colture di umana; (c) confronto tra quando ottenuto dalle ipsc (pannello superiore) rispetto alle culture Generazione di fegato umano vascolarizzato in vivo ipsc umane Caratterizzazione funzionale di gemme di ipsc di fegato umano bidimensionali convenzionali (pannello inferiore) (d) presenza di reti endoteliali nascenti all'interno delle gemme di ipsc umane; (e) analisi di PCR quantitativa di espressione dei geni marcatori epatici al sesto giorno di coltura.

39 Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells - Nature Biotechnology, 31, 5 may 2013, Najm FJ, Lager AM, Zaremba A, Wyatt K, Caprariello AV, Factor DC, Karl RT, Maeda T, Miller RH & Tesar PJ Le terapie cellulari per le malattie della mielina, come la sclerosi multipla e le leucodistrofie, necessitano di tecnologie per la generazione di cellule progenitrici degli oligodendrociti funzionali. In questo lavoro si descrive la conversione diretta di fibroblasti embrionali e polmonari murini a cellule progenitrici degli oligodendrociti indotte (iopc) utilizzando set di otto o tre ben definiti fattori di trascrizione. Le iopc presentano una morfologia bipolare ed un profilo di espressione genica globale coerente con le vere OPC. Le iopc possono essere espanse in vitro per almeno cinque passaggi, mantenendo la capacità di differenziarsi in oligodendrociti. Quando sono trapiantate in topi ipomielinati, le iopc sono in grado di inguainare gli assoni dell ospite e di generare mielina compatta. La conversione di linee di cellule somatiche a iopc espandibili fornisce una strategia per studiare il controllo molecolare della identità delle linee degli oligodendrociti e può facilitare la costruzione di modelli animali per lo studio delle malattie neurologiche e per arrivare a mettere a punto terapie rimielinanti autologhe.

40 Figura (a) schema del disegno sperimentale e sviluppo temporale per la riprogrammazione mediata da di fibroblasti Plp1-eGFP e R26-M2rtTA per formare iopc, espandibili ed in grado di differenziare in iol. Il transgene di Plp1-eGFP modificato è espresso sia nelle iopc che negli oligodendrociti in vivo... Il potenziale delle terapie cellulari per le malattie della mielina si basa sulla capacità di generare cellule autologhe mielinogeniche da trapiantare. La fonte cellulare più promettente per tali terapie sono le OPC. Gli oligodendrociti maturi sono molto poco efficaci nel rimielinare gli assoni dell ospite dopo il trapianto. Sebbene le cellule staminali neurali e le cellule staminali neuronali indotte possano generare oligodendrociti, l'efficienza di questo processo è piuttosto basso, e le cellule hanno una propensione a formare neuroni ed astrociti. Al contrario, le iopc appaiono limitate alla generazione degli oligodendrociti. Abbiamo dimostrato che le iopc si integrano nel sistema nervoso centrale e mielinizzano gli assoni di topi congenitamente demielinati dopo il trapianto in vivo. Tuttavia, affinché le iopc possano avere rilevanza clinica, gli studi futuri dovranno estendere questa strategia di riprogrammazione a cellule somatiche umane e dimostrare una estesa mielinizzazione nel CNS ed un beneficio funzionale a lungo termine nei destinatari del trapianto. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells - Nature Biotechnology, 31, 5 may 2013, Najm et al.

41 Stem cells: A time to heal - Cassandra Willyard - Nature 503, S4 S6 (14 November 2013) - doi: /503s4a Published online 13 November 2013 Le prime terapie con cellule staminali per le lesioni del midollo spinale sono già in fase di sperimentazione in studi clinici, ma restano l incertezza scientifica e politica. Regenerative medicine: Rebuilding the backbone - Mike May - Nature 503, S7 S9 (14 November 2013) doi: /503s7a Published online 13 November 2013 I chirurghi possono aiutare a fissare le vertebre danneggiate, ma potrebbe un'infusione di cellule in un materiale bioingegnerizzato crescere per sostituire una colonna vertebrale danneggiata?

42 Developmental Neuroscience: Miniature human Brains - Nature Sep 19;501(7467): doi: /nature Brüstle O. Le cellule staminali indotte possono essere utilizzate per formare tessuti tridimensionali che imitano il cervello umano in sviluppo. Questi tessuti forniscono un mezzo importante per lo studio dei disturbi dello sviluppo neuronale. Cellule staminali embrionali pluripotenti possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Questo processo può anche essere ottenuto in vitro, usando sia staminali pluripotenti (ES) che staminali indotte (ipsc) ottenute dalla riprogrammazione di cellule epiteliali differenziate. In condizioni adeguate, le ipsc umane possono auto-organizzarsi in organoidi cerebrali che ricreano i primi passi della formazione della corteccia cerebrale del cervello umano, e quindi si prestano a studi sullo sviluppo del cervello e sui disturbi dello sviluppo neurale. Recentemente era stata dimostrata la formazione di tratti di corteccia cerebrale, di intere strutture oculari nei primi stadi di sviluppo ed anche retine stratificate a partire da cellule umane e d murine. Figura in alto: generazione di organoidi da cellule staminali umane pluripotenti che possono essere derivate sia ES (cellule embrionali dalla massa cellulare interna della blastocisti di embrioni a cellule) che staminali pluripotenti (ips) indotte attraverso la riprogrammazione di cellule adulte. Le cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti si auto-organizzano in organoidi cerebrali con architetture dei tessuti che ben ricordano la corteccia cerebrale umana.

43 Developmental Neuroscience: Miniature human Brains - Nature Sep 19;501(7467): doi: /nature Brüstle O. Figura a sinistra: organoide umano generato in vitro in cui si vedono i neuroni (fluorescenza verde e le cellule progenitrici (fluorescenza magenta). La morfologia della regione superiore destra corrisponde a quella della corteccia cerebrale e la regione in basso a sinistra ha una morfologia simile a quella del plesso coroide. All interno è presente una cavità piena di liquido. La corteccia cerebrale umana è evolutivamente il tessuto più complesso del regno animale. Come nel cervello nativo, le aree corticali segregano in diversi strati e queste peculiarità dello sviluppo corticale umano sono ben riassunte negli organoidi. Negli organoidi cerebrali le aree imitano le diverse regioni del cervello ma distribuite casualmente, non hanno la forma e la complessiva organizzazione spaziale che si vede nel cervello e sono privi di un sistema circolatorio che impedisce di avanzare alla complessa architettura a sei livelli della loro controparte naturale. Anche se con queste limitazioni, le potenziali applicazioni di tale modello in vitro sono affascinanti e gli organoidi cerebrali possono fornire un modello per studiare i meccanismi di sviluppo iniziale del cervello umano in laboratorio. Tali studi possono essere estesi ai disturbi dello sviluppo neurale. Sono state utilizzate cellule ipsc derivate da fibroblasti della pelle di un paziente con una forma genetica di microcefalia (disordine dello sviluppo neurale caratterizzato da una sostanziale riduzione delle dimensioni del cervello che è difficile da studiare in modelli animali a causa delle differenze di specie nello sviluppo del cervello). Rispetto agli organoidi derivati da pazienti sani, quelli derivati da pazienti microcefalici avevano un minor numero di cellule progenitrici e un aumento del numero di neuroni differenziati. Questa osservazione indica il precoce differenziamento neuronale come meccanismo alla base di questa forma di microcefalia.

44 The Use of Induced Pluripotent Stem Cells in Drug Development -Clin Pharmacol Ther May;89(5): doi: /clpt Inoue H, Yamanaka S. Medicina personalizzata Il vantaggio evidente di utilizzare ipsc piuttosto che ESC è che le ipsc possono essere derivate da qualsiasi individuo con relativa facilità, consentendo in tal modo lo sviluppo di una piattaforma di studio personalizzato sul singolo genoma. ipsc e cellule differenziate da ipsc mantengono la loro identità personale, come un alter ego del paziente, e possono essere usate per studiare le sue malattie con approccio personaspecifico per esaminare le differenze individuali nella risposta ai farmaci (vedi figura in alto).

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