Enzimi REDOX. Deidrogenasi

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1 Enzimi REDOX Gli enzimi coinvolti in processi redox possono essere classificati in tre categorie: deidrogenasi,, ossigenasi e ossidasi Deidrogenasi Riciclo del cofattore Nei processi redox enzimatici deve essere utilizzato un cofattore, solitamente la nicotammide adenin dinucleotide [NAD(H)] (80%) e il corrispettivo fosfato [NADP(H)] (10%). Altri cofattori quali le flavine (FMN e FAD) e il pirrolo chinolin chinone (PQQ) si incontrano più raramente.

2 Ossidazione di alcoli ad opera di NAD + (alcol deidrogenasi)

3 Tutti i cofattori sono molecole instabili e troppo costose per essere utilizzate in quantità stechiometrica. Non possono essere sostituite da analoghi artificiali. Possono però essere rigenerato utilizzando una seconda reazione redox. L efficienza di un processo di riciclo viene espressa dal TTN (numero totale di cicli catalitici, total turnover number) ) che indica il numero di volte che il cofattore può essere rigenerato prima di decomporsi. Per processi di laboratorio TTN = sono accettabili, per un processo produttivo sono necessari TTN > Se si utilizzano cellule intere il problema del riciclo del cofattore non sussiste. Riciclo del NAD + (forma ridotta) Storicamente NAD+ è stato riciclato utilizzando sodio ditionito (Na 2 S 2 O 4 ) come agente riducente (TTN 100). Altri metodi elettrochimici o fotochimici forniscono TTN maggiori ( ( 1000) ma basse regioselettività. Risultati nettamente migliori sono stati ottenuti con metodi enzimatici sia con il NAD + e il NADP +. I metodi di riciclo enzimatico possono essere suddivisi in due classi: c Metodi con substrati accoppiati (coupled( coupled-substrate process) Il cofattore è costantemente rigenerato per aggiunta di un secondo substrato ausiliario trasformato dallo stesso enzima, ma nel senso so inverso Metodi con enzimi accoppiati (coupled( coupled-enzyme enzyme process) In questo caso i due processi, conversione del substrato principale e riciclo del cofattore,, sono catalizzati da due diversi enzimi

4 Metodi con substrati accoppiati (coupled( coupled-substrate process) Il cofattore è costantemente rigenerato per aggiunta di un secondo substrato ausiliario trasformato dallo stesso enzima, ma nel senso so inverso. Per spostare il secondo equilibrio a destra si utilizza il substrato ausiliario in largo eccesso ottenendo TTN = 10 3 Metodi con substrati accoppiati (coupled( coupled-substrate process) Il riciclo del cofattore con lo stesso enzima è elegante ma ha alcuni inconvenienti piuttosto severi: 1. L efficienza globale del sistema è limitata poiché l enzima lavora in entrambi i processi 2. Il prodotto deve essere separato dal substrato ausiliario in eccesso esso 3. Può esserci disattivazione dell enzima enzima se si utilizzano composti carbonilici molto reattivi quali acetaldeide o cicloesanone come donatori redox 4. Può anche esserci inibizione dell enzima enzima a causa dell elevato elevato eccesso di substrato ausiliario.

5 Metodi con enzimi accoppiati (coupled( coupled-enzyme enzyme process) I due processi, conversione del substrato principale e riciclo del d cofattore, sono catalizzati da due diversi enzimi. Per ottenere i risultati migliori i due diversi enzimi devono avere specificità sufficientemente diverse per i rispettivi substrati in modo tale che le due reazioni possano procedere indipendentemente e che quindi i due substrati non debbano competere con il sito attivo di un singolo enzima. Sono stati sviluppati diversi esempi eccellenti di rigenerazione del NADH anche a livello industriale mentre per il NADPH sono disponibili metodi a livello laboratorio ma non su larga scala. Il metodo migliore e più largamente utilizzato per riciclare il NADH usa la formiato deidrogenasi (FDH) per catalizzare l ossidazione l del formiato a CO 2 Il vantaggio principale è che sia il substrato ausiliario che il prodotto non sono innocui per l enzima l e facili da rimuovere dall ambiente ambiente di reazione. FHD è commerciale, facilmente immobilizzabile e stabile, se protetta dall autoossidazione autoossidazione. E costosa e ha una bassa attività specifica (3U/mg). Può però essere immobilizzata o trattenuta in membrana. TTM

6 Un altro metodo utilizza l ossidazione l del glucosio, catalizzata dalla glucosio deidrogenasi (GDH) In questo caso l equilibrio l è spostato a destra perché il gluconolattone si idrolizza spontaneamente ad acido gluconico. Il metodo è efficace sia per il NADH che il NADPH. La GHD è piuttosto costosa e la separazione dal gluconato non è particolarmente agevole Etanol e Alcol Deidrogenasi (ADH) sono anche utilizzate per rigenerare il NADH e NADPH. Il basso costo dell ADH e la volatilità dell etanolo etanolo e dell acetaldeide rendono questo metodo attraente per utilizzi su larga scala. A causa del basso potenziale redox possono essere ridotti solo derivati carbonilici reattivi quali aldeidi o chetoni ciclici. Con altri substrati di deve forzare a destra l equilibrio l utilizzando etanolo in eccesso o rimuovendo l aldeide. Quest ultimo ultimo risultato può essere ottenuto ossidando l aldeide l ad acetato con un aldeide deidrogenasi,, con conseguente rigenerazione di un secondo equivalente di cofattore ridotto. Tutti questi sistemi forniscono bassi TTN e richiedono sistemi multim ulti- enzimatici complessi.

7 Riciclo del NADH (forma ossidata) Il miglior metodo per riciclare i cofattori NAD(P) nella loro forma ossidata utilizza la glutammato deidrogenasi (GluDH)) che catalizza la amminazione riduttiva dell α-cheto glutarrato a L-glutammato. L Può anche essere utilizzato il piruvato insieme alla lattato deidrogenasi (LDH). La LDH è economica e ha una più elevata attività specifica. Ha però un potenziale redox inferiore ed accetta solo il NADH. Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli Lo ione idruro (H-) è un nucleofilo ed è in grado di portare un attacco al carbonio elettrofilo del carbonile riducendolo ad alcol I due reagenti più comunemente utilizzati per tale reazione sono il NaBH 4 (sodio boroidruro) ) e il LiAlH 4 (litio alluminio idruro). Il NaBH 4 è un riducente più blando e viene solitamente utilizzato in solventi alcolici acquosi. Il LiAlH 4 è un riducente più energico, si usa in etere o THF e reagisce violentemente con l acqual

8 Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli con NaBH 4 L idrolisi avviene nel mezzo di reazione che contiene acqua

9 Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli con LiAlH 4 Tutti i quattro idruri sono in grado di reagire Riduzione di aldeidi con NaBH 4

10 Riduzione di chetoni Si forma un nuovo stereocentro: : processo stereoselettivo Idruri chirali enantiopuri: complessi del borano con ossoazaborolidine Complessi del borano con ossoazaborolidine: configurazione assoluta del prodotto R>>R (R)

11 Complessi del borano con ossoazaborolidine: Modelli di stato di transizione Complessi del borano con ossoazaborolidine: Processo catalitico Il BH 3 non deve essere in grado di reagire da solo (fornirebbe un processo non stereoselettivo) Ruolo del boro dell ossoazaborolidina come acido di Lewis nell attivare il composto carbonilico

12 Determinazione della configurazione relativa di un alcol: Regola di Prelog O O H 3 C O L S M PhMgBr Ph OH O H 3 C O L S M Idrolisi Ph OH OH H 3 C O (-)-(R)-acido atrolattico Il fenil magnesio bromuro attacca preferenzialmente la faccia del carbonile (Re o Si) ) dalla parte del gruppo Small portando, dopo idrolisi, all acido acido atrolattico (R)) o (S)( ) rispettivamente. Riduzione di aldeidi e chetoni con enzimi isolati Il decorso stereochimico dipende fortemente dal substrato: Regola di Prelog: si basa sulla sterochimica della riduzione che si ottiene con cellule di Curvularia falcata, nella quale si ottiene prevalente riduzione alla faccia Re

13 Strutture preferenziali per le deidrogenasi YADH: yeast alcohol dehydrogenase HLADH: horse liver alcohol dehydrogenase TBADH: Thermoanaerobium brockii alcohol dehydrogenase HSDH: Hydroxysteroid dehydrogenase Regola dell interazione a tre punti (Ogston 1948) Poiché l interazione del substrato con il sito attivo è tridimensionale, il sito attivo deve avere almeno tre punti di contatto per poter raggiungere un elevato livello di stereoselezione R Interazione di A,B,C ottimale Orientazione ottimale di D Elevata stereoselezione D= gruppo reattivo S Interazione di A,B,C non ottimale Orientazione non ottimale di D Bassa stereoselezione

14 Regola dell interazione a tre punti (Ogston 1948) Riduzione del piruvato con liver dehydrogenase per ottener l (S)-acido lattico Nella reazione inversa l (S)-acido lattico viene ossidato selettivamente Risoluzione di chetoni policiclici con HLADH uso combinato di bio e chemo catalizzatori

15 Alcol Deidrogenasi di fegato di cavallo (HLADH) Deidrogenasi commerciale, la più utilizzata in biotrasformazioni. La struttura ai raggi X è stata risolta ed è un dimero con due sub-unità unità quasi identiche contenenti due atomi di zinco. La struttura tridimensionale è simile a quella della alcol deidrogenasi di leivito (YADH) anche se la sequenza primaria è alquanto diversa. E efficace nel catalizzare la riduzione di chetoni ciclici con un anello di dimensioni non troppo elevate Alcol Deidrogenasi di fegato di cavallo (HLADH) Riduzione stereoselettiva di 2-alchiltiopirani2 alchiltiopirani-4-onioni Risoluzione dei due chetoni

16 Alcol Deidrogenasi di fegato di cavallo (HLADH) Asimmetrizzazione di dichetoni achirali Riduzioni di aldeidi e chetoni con lievito di birra (saccharomyces cerevisiae) Il lievito di birra è il microorganismo più utilizzato per la riduzione di stereoselettiva di composti carbonilici. E ideale per i non-microbiologi perché è facilmente disponibile e non richiede fermentatori sterili.

17 Riduzioni di chetoesteri con lievito di birra Riduzioni di chetoesteri con lievito di birra Inibizione dell L-enzima L

18 Riduzioni di chetoesteri con lievito di birra Inibizione del D-enzima D