Rigenerazione di tessuti in vitro. Ingegneria dei Tessuti 23_10_12

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1 Rigenerazione di tessuti in vitro Ingegneria dei Tessuti 23_10_12

2 Come la Natura costruisce un tessuto Assemblaggio (assembly) della struttura tessutale Insieme disordinato di cellule e molecole morfogenesi Tessuto maturo (tendine, arteria, ) Morfogenesi - Meccanismi responsabili dei cambiamenti strutturali

3 Assemblaggio della struttura tessutale il genoma cellulare contiene le informazioni per l assebly tessutale La struttura tessutale è il risultato di interazioni cellula-ambiente fenotipo strutturale turn over Rigenerazione Riparo In cosa consiste il processo morfogenico? Cosa lo inizia? Cosa lo termina?

4 Rigenerazione e riparo Esistono differenze sostanziali tra rigenerazione e riparo: Il riparo è un processo rapido (chiudere ferite, lesioni, ) Il riparo produce tessuto fibroso che unisce lembi di tessuto; la rigenerazione ripristina nello specifico sito di lesione un tessuto normale La biomeccanica di un tessuto prodotto da un processo di riparo è differente da quella del tessuto nativo, mentre quella di un tessuto rigenerato è perfettamente analoga alla biomeccanica di un tessuto naturale (es. cicatrice del derma, callo osseo) L integrazione di un tessuto riparato con tessuti circostanti è imperfetta. Per contro, non è possibile discernere in confini di un tessuto rigenerato con il tessuto nativo circostante

5 Rigenerazione e riparo La rigenerazione è il meccanismo di recupero predominante in tessuti embrionali La produzione di un tessuto funzionale in vitro necessita la riproposizione dei processi biochimici che avvengono durante lo stadio fetale Utilizzo di cellule staminali (adulte) mesenchimali Ma ciò potrebbe non essere sufficiente

6 Rigenerazione e riparo Cellule non differenziate devono specializzarsi in cellule proprie del tessuto Composizione della matrice extracellulare, presenza di fattori di crescita e citochine sono alcuni tra i prerequisiti per portare e mantenere una cellula nello stato differenziato esprimere geni e produrre proteine tessuto-specifici osteoblasti osso fibroblasti derma e legamenti SMC e cell. endoteliali vasi sanguigni condrociti - cartilagine

7 Self-assembly Molti costituenti della ECM godono della proprietà di possedere sufficienti informazioni per costruire da sole strutture ordinate: self assembly molecolare self assembly supramolecolare Queste due proprietà da sole non bastano a spiegare l incredibile complessità dei tessuti biologici Assembly mediato da cellule

8 Biosintesi del collagene Glese K. et al. Advanced Drug Delivery Reviews 55, , 2003

9 Biosintesi del collagene Glese K. et al. Advanced Drug Delivery Reviews 55, , 2003

10 Strutture In Vitro Gel di collagene ricostituito in vitro [2.3 mg/ml] Velegol D. and Lanni F. Biophysical Journal 81, , 2001

11 Strutture in vivo tendine cornea

12 Derma Strutture in vivo

13 Fascicolo di collagne (da derma) Strutture in vivo

14 Fascicolo di collagene (da derma) Structures In Vivo

15 In Vivo vs. In Vitro 1. Concentrazione 2. Struttura supramolecolare Meccanismo mediato da cellule

16 Plasma Membrane Channels A, B: collagen fibril bundle between two cells at two divfferen z plane. Cell-cell contacts are outlined by open circles. C, D: 3-D rendering from the EMs shown above. Canty E.G. et al. Journal of Cell Biology 165, , 2004

17 Plasma Membrane Channels 3-D rendering EM of 15-d mouse embryo tail tendon. Longitudinal structure of fibripositor Bar 500 nm Canty E.G. et al. Journal of Cell Biology 165, , 2004

18 Plasma Membrane Channels Schematic of a fibripositor and collagen fibril within the lumen Space left by the retracting fibripositor Canty E.G. et al. Journal of Cell Biology 165, , 2004

19 Plasma Membrane Channels Fibril packing. Bar 50 nm TEM of 15-d mouse embryo tail tendon. Bar 500nm Histogram of fibril diameters Canty E.G. et al. Journal of Cell Biology 165, , 2004

20 ECM morphogenesis and development Post nascita le stesse cellule mostrano differente morfologia no protrusioni (i.e. fibripositori) Seed n feed mechanism Fibroblasta in tendine (6 sett.)

21 Matrice extracellulare in vivo Cellule producono ed organizzano la ECM Proteine della ECM possiedono informazioni per il corretto funzionamento ed il mantenimento dei tessuti ECM es.: fattori di crescita e citochine possono legarsi alla ECM tramite eparina. Questi fattori possono essere rilasciati selettivamente a seguito di infortuni o particolari condizioni. Analogamente la ECM può sequestrare questi fattori e non renderli disponibili alle cellule durante specifici stati fisiologici.

22 Generazione di tessuti funzionali in vitro - riproposizione degli eventi biochimici che accadono durante i processi naturali di rigenerazione -- replicare i dettagli strutturali e funzionali a livello nano- e micro-metrico al momento non esiste una tecnologia capace di creare strutture così complesse Fornire alle cellule gli elementi per iniziare e sostenere il processo di rigenerazione sfruttando le naturali capacità rigenerative cellulari.

23 Tessuti generati in vitro - strategia Materiali Scaffold Tessuto in vitro Cellule Processo Staminali Primarie Condizioni di coltura Sostentamento cellulare Favorire specifiche attività biosintetiche

24 Processo Produzione di un tessuto funzionale Generare in vitro un costrutto cellularizzato tridimensionale ed impiantarlo quando ha raggiunto predeterminate proprietà meccaniche e biologiche I bioreattori sono sistemi progettati per formare, in maniera riproducibile, tessuti in grado di soddisfare specifiche funzioni in vivo bioreattori Stabilire una distribuzione spazialmente uniforme di cellule in scaffold 3D Mantenere una concentrazione ottimale di gas e nutrienti nel mezzo di coltura Esporre il tessuto in crescita ad appropriati stimoli fisici

25 Tessuti generati in vitro - strategia Materiali Scaffold Tipo di materiale Struttura Topografia Proprietà meccaniche Presenza di segnali bioattivi Tessuto in vitro Cellule Processo Staminali Primarie Condizioni di coltura Sostentamento cellulare Favorire specifiche attività biosintetiche

26 Tessuti generati in vitro effetto della topografia impartire un ordine al tessuto prodotto Cellule coltivate su substrati scanalati 10µm Il collagene prodotto è orientato e parallelo alle scanalature

27 Tessuti generati in vitro effetto della topografia impartire un ordine al tessuto prodotto Pattern più piccoli citoscheletro fibronectina

28 Tessuti generati in vitro effetto della topografia Applicazione in vivo rigenerazione di tendine

29 Scelta dei materiali caso 3D Target: ECM del tessuto da rigenerare Composizione e proprietà fibre insolubili (Collagene, elastina, ), macromolecole interfibrillari (proteoglicani, HA, ) e fluidi: Costituenti strutturali (garantiscono l integrità meccanica del tessuto) Segnali bioattivi (interazioni cellula matrice, migrazione, )

30 Scelta dei materiali caso 3D Polimeri di sintesi Pro s Riproducibilità e controllo della composizione e proprietà Con s Assenza di segnali bioattivi Proprietà meccaniche modulabili Polimeri naturali Pro s Interazioni cellula materiali favorevoli Facilmente rimodellabili Con s Scarse proprietà meccaniche Proprietà poco riproducibili

31 Proprietà delle matrici 3D in vitro Con le attuali tecnologie non è possibile replicare in vitro la complessità della ECM naturale Sviluppo di modelli semplificati: gel di collagene gel di fibrina

32 Comportamento cellulare in costrutti 2D e 3D Come sentono le cellule la dimensionalità del substrato? integrano gli stimoli lungo tutta la superficie, ricevendo informazioni da tutti i focal adhesion attivati ricevendo informazioni adeguate circa le proprietà meccaniche del substrato che attivano particolari 3D-matrix adhesion

33 Gel di collagene ricostituito Collagene acid extacted Collagene pepsin soluble Formazione di un gel fisico (pochi crosslink) Scarsa possibilità di modulare le proprietà meccaniche Gel di fibrina Combinazione di fibrinogeno e trombina Gel fisico che però può essere crosslinkato enzimaticamente. Maggiore moduladilità delle proprietà meccaniche. Degradazione della fibrina e sostituzione con costituenti della ecm

34 Proprietà delle matrici in vitro Microarchitettura delle matrici Proprietà meccaniche

35 Proprietà delle matrici in vitro Una adeguata conoscenza delle proprietà meccaniche del substrato, della trasmissione degli sforzi/deformazioni tra cellula-substrato e di come le cellule rispondono a particolari stati deformativi costituisce la base per l impostazione dei parametri di processo per la realizzazione di un tessuto funzionale in vitro. meccanica dei gel collegamento matrice cellula - citoscheletro rimodellamento contact guidance

36 Proprietà delle matrici in vitro fibre rilassate contributo entropico contributo entalpico Nei gel (molto idratati) le propr. mecc. sono governate dal trasporto interstiziale di fluidi: una dimunuzione delle dimensioni dei pori provoca una variazione delle proprietà meccaniche Le propr. mecc. dipendono scarsamente dalle caratteristiche delle fibre Uts gel = 10kPa Uts collagen = 1000MPa

37 Proprietà delle matrici in vitro deformazione affine / non-affine La deformazione locale non segue la deformazione macroscopica Fenomeno amplificato in gel 3D piuttosto che in gel 2D (coatings) Lo stimolo meccanico che subiscono le cellule coltivate in 3D gel può non essere correlato alla deformazione macroscopica Possibile soluzione Aumento densità di crosslinks

38 Accoppiamento cellula matrice collegamento citoscheletro-matrice Il collegamento è mediato dalle integrine (proteine transmembranali) All interno della membrana complessi molecolari (cell-matrix adhesion) collegano il citoscheletro alle integrine. Sono state descritte diverse cell-matrix adhesion: - Focal contact - Focal adhesion - Fibrillar adhesion Trasferimento sforzi e rimodellamento matrice Influenzano morfologia e motilità - 3D-matrix adhesion

39 Generazione di stress in relazione al substrato Fibroblasti (e altre cellule) sono in grado di rimodellare gel, sia 2D che 3D, per il tramite dei filamenti di actina-miosina fibroblasti in cui i filamenti di actina-miosina sono sviluppati sottoforma di fasci visibili al microscopio prendono il nome di miofibroblasti In vivo i fibroblasti differenziano in miofibroblasti in particolari condizioni (es. chiusura delle ferite) Alta capacità contrattile

40 Generazione di stress in relazione al substrato Non è necessario esprimere stress fibre per contrarre il substrato generazione di forze senza stress-fibre Modello sperimentale: gel non stressati/vincolati generazione di forze con stress-fibre Modello sperimentale: gel stressati/vincolati; presenza di TGF beta1 Fibroblasti mostrano un fenotipo da miofibroblasti, attivazione delle stress fibre che trasmettono sforzi alla ecm per il tramite delle focal adhesion e 3dmatrix adhesion importanza delle propr. mecc. del substrato

41 Rimodellamento gel in vitro Modello: gel di collagene popolato da cellule Adesione cellulare Cell traction Compattazione del network Vincoli meccanici Allineamento fibre Cambiamento microstruttura proprietà meccaniche

42 Rimodellamento gel in vitro Compattazione isotropa gel non vincolato 1 giorno 3 giorni 6 giorni Compattazione anisotropa gel vincolato Collagene + cellule vincoli

43 Rimodellamento gel in vitro Compattazione isotropa Gel libero Compattazione anisotropa Gel vincolato

44 Rimodellamento gel in vitro Cosa succede al gel quando viene vincolato o deformato? L effetto globale è una polarizzazione delle fibre, causata o dalla trazione esercitata dalle cellule, o dallo sforzo esterno applicato focal adhesion sono vincolati alle fibre allineamento adhesion polarizzazione della locomozione anisotropia strutturale causa anisotropia delle propr. mecc. Maggiore efficienza della locomozione in direzione delle fibre Guida da contatto (contact guidance)

45 Contact Guidance Quali sono gli effetti più visibili prodotti dalla guidance? focal adhesion sono vincolati alle fibre allineamento adhesion polarizzazione della locomozione anisotropia strutturale causa anisotropia delle propr. mecc. Maggiore efficienza della locomozione in direzione delle fibre

46 Contact Guidance Si possono realizzare gel in cui si impone una direzione preferenziale sulla quale le cellule possono muoversi e deporre neotessuto Gel collagene Sostanziale compattazione (fino 85%). No degradazione né deposizione di neomatrice Gel fibrina Struttura simile al gel di collagene Maggiore produzione di collagene de altre proteine I prodotti di degradazione della fibrina provocano un miglioramento delle proprietà meccaniche macroscopiche.

47 Guida per Chemotassi E possibile polarizzare la locomozione e rimodellamento cellulare sfruttando la chemotassi Utilizzo di gradienti di concentrazione di fattori che attraggono le cellule Es.: PDGF naturalmente presente nel fibrin clot ed attrae miofibroblasti per la cicatrizzazione Possibile strategia per direzionare la migrazione cellulare verso specifiche zone dello scaffold

48 Contact Guidance Chemotassi gradienti di concentrazione Fattore attrattivo

49 Ingegnerizzazione delle proprietà meccaniche Le propr. mecc. dei gel cellularizzati, non sono mai adeguate per un impianto in vivo di successo. Si devono trovare strategie per incrementare le prestazioni dei costrutti: Utilizzo di fattori di crescita (TGF beta1 aumenta la rigidezza e resistenza di gel di fibrina)

50 Ingegnerizzazione delle proprietà meccaniche Agenti crosslinkanti (il ribosio crea ponti saccaridici tra le fibrille di collagene con conseguente aumento delle proprietà meccaniche) Apporto di nutrienti e citochine Stimoli meccanici durante la crescita

51 Ingegnerizzazione delle proprietà meccaniche Induzione di stimoli meccanici Molte cellule sono in grado di percepire le proprietà meccaniche del substrato Ad un applicazione di una deformazione del gel corrisponde una ridistribuzione degli sforzi. Le cellule rispondono a questa ridistribuzione aumentando l espressione dei geni di alcune proteine della matrice (collagene, elastina proteogag, HA, ) e depongono questi componenti nelle direzioni principali di deformazione (stress shielding)

52 Tissue Equivalent Strategie per la realizzazione di strutture polarizzate Media equivalent

53 Tissue Equivalent

54 Tissue Equivalent Valvola cardiaca fibrina elastina collagene cellule

55 Tissue Equivalent Cornea

56 Sorting cellulare in vitro Differential adhesion hypothesis Limitata adesione intercellulare (espressione polarizzata di molecole adesive) Minimizzazione dell energia conformazionale Schema di formazione di lume endoteliale come conseguenza di gradienti di adesione intercellulare

57 Sorting cellulare in vitro Sorting in una miscela di cellule (CHO) basate su adesione differenziale - Verde: cellule normali - Rosso: cellule modificate poco adhesive (30% differenza in espressione caderine) Il sistema evolve spontaneamente segregando le cellule meno adesive all esterno

58 Self assembly cellulare in vitro Fusione tissutale 200 micron 17h 42h 73h Nero: cellule epiteliali pigmentate Grigio: cellule neurali retinali

59 Self assembly cellulare in vitro Fusione tissutale Fusione tra sferoidi di cellule embrionali Minimizzazione energia conformazionale Evoluzione del sistema in unico sferoide

60 Self assembly cellulare in vitro 0h 5h 11.5h 17.5h 24h Contrazione spontanea (rounding-up) di espianti bioptici

61 Self assembly cellulare in vitro Sorting e fusione sono simili alla separazione di fase e coalescenza di liquidi Modellazione dell evoluzione delle strutture mediante tensione interfacciale

62 Self assembly cellulare in vitro Tessuti cellulari aventi differenti tensioni superficiali evolveranno in sistemi costituiti da aggregati ad alta tensione sup. circondati da shell di cellule a bassa tensione sup.

63 Attenzione! Self assembly cellulare in vitro La tissue fluidity è solo un analogia. I meccanismi di aggregazione cellulare sono intrinsecamente differenti da quelli dei liquidi Moto liquidi k b T Moto cellule contrazione actina motori molecolari idrolisi ATP La tissue fluidity interpreta bene l evoluzione degli aggregati cellulari in assenza di forze esterne (gravità o interazione con l esterno)

64 Deposizione controllata di aggregati cellulari inkjet printing extruder bioprinting Singole cellule o sospensioni cellulari sono spruzzate su un substrato. + Processo economico e veloce. - Danni alle cellule dovuti agli stress meccanici Un bio-inchiostro formato da aggregari cellulari (sferoidali o cilindrici) viene deposto su una bio-carta fatta da hydrogel + Aggreati cellulari stabili - Pocesso costoso

65 Deposizione controllata di aggregati cellulari preparazione del bio-inchiostro Aggregati cellulari sono estrusi da una pipetta formando cilindroidi. I cilindroidi cellulari sono tagliati ad intervalli regolari. I frammenti sono posti in coltura sotto agitazione Round up spontaneo con formazione di sferoidi cellulari Printing diretto di cilindroidi cellulari in agarosio

66 Deposizione controllata di aggregati cellulari esempi Deposizione di sferoidi layer-by-layer e successiva rimozione della bio-carta. Problemi: instabilità per strutture piccole (collasso), rimozione completa della bio-carta Stacking orizzontale layer-by-layer di cilindroidi cellulari. Configurazione più stabile Problemi: produzione (lunghi tempi di maturzione) e deposizione dei cilindroidi (possibile rottura durante la deposizione.

67 Deposizione controllata di aggregati cellulari esempi CHO cardiomiciti Struttura ramificata capillare 0 h h Rosso: endoteliali Verde: SMC

68 Deposizione controllata di aggregati cellulari Interazioni tra multilayer Le interazioni tra i diversi layer stimolano la maturazione del tessuto e la biosintesi di ECM deposizione random EC/SMC deposizione ordinata EC/SMC