Monitoraggio della contaminazione da Aflatossina M1nel latte bovino

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1 Monitoraggio della contaminazione da Aflatossina M1nel latte bovino nella provincia di Rieti Contributi pratici Mario Ricciardi AUSL Rieti Valeria Moroni TPALL Nazzareno Pizzoli C.LA.R. Introduzione Attualmente sono note più di trecento micotossine e sono stati elencati numerosi generi di funghi produttori di queste sostanze, anche se la maggior parte delle ricerche sono concentrate su aflatossine, ocratossine, patulina, tricoteceni, zearalenone e fumonisina. Anche se identificate e studiate di recente, certamente hanno causato problemi all uomo e agli animali da sempre. Nel corso dei secoli il problema della contaminazione da micotossine ha progressivamente mutato il suo profilo: infatti, mentre nei tempi più antichi questo tipo di contaminazione aveva ripercussioni pressoché limitate alle aree di produzione dei raccolti, con il progressivo incremento della globalizzazione, la presenza di queste sostanze tossiche in una vastissima gamma di derrate alimentari, ha causato ripercussioni in svariati segmenti del mercato internazionale e su un ampia varietà di operatori del settore alimentare. Tutti i Paesi sono interessati dai problemi connessi alla contaminazione da micotossine, in particolare quelli caratterizzati da sistemi agricoli scarsamente sviluppati. I problemi non mancano, anche se a livello più episodico e, almeno parzialmente controllabile, anche nei Paesi con sistemi agricoli avanzati. Tra le micotossine, le aflatossine rappresentano le sostanze più pericolose per la salute umana ed animale. Per l Italia, l aflatossina, è soprattutto un problema connesso con l importazione di derrate da Paesi tropicali e subtropicali, con climi piuttosto caldi e umidi, ma le condizioni di crescita e produzione sono facilmente riscontrabili anche sul territorio nazionale. Infatti, la particolare condizione climatica dell estate del 2003 ha fatto sì che si creassero le condizioni ideali per lo sviluppo, nelle derrate cerealicole, dei funghi responsa- 8 / 353

2 Contributi pratici bili della produzione di aflatossina B1. Tale situazione ha determinato, di riflesso, la presenza ed il ritrovamento dell aflatossina M1 nel latte e nei suoi derivati. Il problema dell aflatossina M1 nel latte ha creato una situazione d emergenza che ha coinvolto tutto il comparto lattiero-caseario causando gravi danni alla filiera del latte. Mentre in passato il problema si era presentato solo sporadicamente, in questo caso il servizio veterinario si è trovato a gestire una situazione in cui erano coinvolti la quasi totalità degli allevatori. Tale fenomeno ha condotto ad un estensione ed intensificazione dei controlli sul latte di massa e su alcuni alimenti di uso zootecnico. Dopo aver governato e superato l emergenza aflatossine, ora è necessario impegnarsi nella prevenzione, che è la vera arma vincente per garantire al cittadino prodotti di qualità. Scopo di questo lavoro è stato quello di monitorare la contaminazione da aflatossina M1 nel latte bovino nella provincia di Rieti, in collaborazione con la Centrale del latte di Rieti. Le aflatossine Tabella - Le alfatossine scoperte fino ad oggi Alfatossine Chi le produce Dove si trovano B1 B2 G1 G2 M1 M2 Gli stessi animali che assumono alimenti contaminati da B1 e B2 Le aflatossine, scoperte negli anni sessanta, sono state per parecchio tempo oggetto di studio da parte di molti ricercatori. I primi casi di aflatossicosi animale risalgono ai primi anni sessanta in Inghilterra con più di tacchini colpiti; la causa era l alimentazione con una farina di arachidi contaminata da aflatossina B1. Tale incidente attirò il mondo scientifico il quale iniziò studi e ricerche che portarono all identificazione dei miceti produttori. Il mutare delle condizioni climatiche sul territorio nazionale, avvicinandosi sempre di più a quelle dei climi tropicali e subtropicali, ha creato le condizioni ideali per lo sviluppo dei funghi responsabili della produzione delle aflatossine, ciò ha indotto gli operatori del settore a concentrare di più l attenzione sugli alimenti destinati all alimentazione degli animali da reddito. Le aflatossine sono metaboliti secondari altamente tossici, prodotti in opportune condizioni microclimatiche, da funghi microscopici appartenenti alla famiglia degli ascomiceti, genere aspergillus, che si sviluppano su numerosi substrati vegetali come cereali (con particolare riferimento al mais), semi oleaginosi (come le arachidi), spezie, granaglie, frutta secca ed essiccata, sia durante la coltivazione che durante il trasporto e l immagazzinamento. Gli aspergilli sono delle muffe ubiquitarie presenti nell ambiente. Le aflatossine ritrovate come contaminanti naturali negli alimenti di origine vegetale sono: la B1, B2, G1 e G2. Le aflatossine B1 e B2 sono prodotte dalle specie aspergillus flavus (maggiormente diffuso) e aspergillus parasiticus (più comune nei climi tropicali e subtropicali), mentre le aflatossine G1 e G2 sono prodotte solo dalla specie apergillus parasiticus. Oltre alle aflatossine del gruppo B e G hanno importanza quelle del gruppo M; le aflatossine M1 e M2 sono metaboliti idrossilati rispettivamente di B1 e B2 che si riscontrano nel latte di lattifere alimentate con mangimi contaminati da aflatossine B1 e B2. L aflatossina M1 è il 4-monoidrossiderivato dell aflatossina B1. Nella tabella sottostante, i principali alimenti zootecnici, sono raggruppati in categorie di rischio di contaminazione da aflatossina B1. Formaggi Mangimi Concentrati Sottoprodotti Latte e i suoi derivati Tabella - Principali alimenti zootecnici per categorie di rischio di contaminazione da aflatossina B1 Classe di rischio > Alto Medio Basso Alimentato Mais (granella) e derivati Pannello in lino Pannello di cocco Arachidi Insilato di mais Pastone di mais Cotone Distillers Polpe Orzo, altri careali e derivati Fieni Soia Crusca 8 / 354

3 Limiti di legge In base alla normativa europea, per quanto riguarda il contenuto di aflatossina M1 nel latte (latte crudo, latte destinato alla fabbricazione di prodotti a base di latte, latte trattato termicamente) e i derivati del latte che siano essiccati, diluiti, lavorati o composti da più di un ingrediente, il tenore massimo ammesso è di 50 ng/kg e di 10 ng/kg sugli alimenti per l infanzia. Per l aflatossina B1 il Decreto Legislativo n.149 del 10/05/2004 in attuazione delle direttive 2001/102/CE, 2002/32/CE e 2003/57/CE, relative alle sostanze e ai prodotti indesiderabili nell alimentazione degli animali, stabilisce che per le bovine da latte il limite nei mangimi è di 5 ppb e nelle materie prime a rischio è di 20 ppb. Disegno - Test Strip Figura - Aflatoxin Test Strip Unità di misura usate Alimenti p.p.m. milligrammi/kg p.p.b. microgrammi/kg p.p.t. nanogrammi/kg Latte destinato ad uso alimentare AFMI < 0,05 AFMI < 50 Tutte le materie prime (semi, farine, panelli, foraggi, freschi e secchi, etc.) Mangimi Complementari (pellettati, miscele di farine e mangimi, etc.) Mangimi completi (miscele di mangimi che bastano ad assicurare una razione giornaliera, unifeed) Monitoraggio della contaminazione da aflatossina M1 nel latte bovino nella provincia di Rieti Lo studio che è stato condotto è quello di monitorare la contaminazione dell aflatossina M1 nel latte bovino nella provincia di Rieti, durante il corso di tre anni, dall anno 2004 all anno Questo studio è stato effettuato in collaborazione con la Centrale del latte di Rieti, in quanto la maggior parte del latte proveniente dagli allevamenti bovini della provincia, confluisce nello stabilimento, dove viene sottoposto ad analisi per verificare la concentrazione dell aflatossina M1, al fine di garantire il rispetto dei limiti di legge, a tutela del consumatore finale. Ogni giorno alla centrale del latte giungono mediamente tre autocisterne che raccolgono complessivamente litri di latte proveniente dagli allevamenti della provincia. Ciascuna autocisterna è costituita da tre aree distinte e su ogni singolo scomparto vengono effettuati i campionamenti del latte. Il prelievo dei campioni di latte consta delle seguenti fasi: - agitazione della massa insufflando aria sterile al fine di avere una massa omogenea tra la parte magra e la parte grassa; AFBI < 0,02 AFBI < 20 AFBI < 0,005 AFBI < 5 AFBI < 0,005 AFBI < 5 Nota bene: i limiti di legge indicati in tabella si riferiscono solo alle bovine da latte - mediante un prelevatore viene raccolto all interno di un contenitore sterile il campione di latte. Da ogni singolo scomparto di ciascuna autocisterna si preleva un campione di latte da 500 ml. Da ognuno dei tre campioni di ogni autocisterna si preleva una quantità di latte per costituire il campione globale da 50 ml, sul quale verranno effettuate le analisi per la ricerca dell aflatossina M1, mediante il test CHARM ROSA READER. Test CHARM ROSA READER Dal campione globale si prelevano 300 microlitri di latte mediante una pipetta e s inoculano nel AFLATOXIN TEST STRIP, il quale viene posto in incubazione per 15 min. a 38 C. Il test strip è costituito da: anticorpi dell aflatossina M1 (palline rosse nel disegno); linea T (test); linea C (controllo). Il test è un saggio immunoenzimatico basato su un legame antigene-anticorpo, con lo stesso principio di funzionamento del test ELISA. Una volta inoculati 300 microlitri di latte, questo migra per capillarità lungo il test strip. Le molecole libere di aflatossina M1 presenti nel campione di latte si legano agli anticorpi presenti sul test strip.gli anticorpi dell aflatossina (palline rosse nel disegno) fluiscono lungo lo strip e si legano alla linea T del test e C del controllo. C T Negative Control line Ab binding reagent Test line detoxified AFAb binding reagent Positive C Quando il campione di latte è negativo, un maggior numero di anticorpi per l aflatossina si lega alla linea T del test e questa appare più scura rispetto alla linea C. Quando il campione di latte è positivo, il legame alla linea T è inibito, gli anticorpi si legano all aflatossina M1 presente nel latte e si forma l immunocomplesso, il quale migra lungo il test strip e nella linea C del controllo avviene una reazione immunoenzimatica (legame immunocomplesso-enzima) determinando una reazione colorimetrica, di conseguenza la linea C risulterà più scura rispetto alla linea T. T 8 / 355

4 Contributi pratici Il legame viene poi interpretato tramite il lettore ROSA READER. Il test strip dà una risposta di tipo qualitativo, mentre il lettore rosa reader quantifica la risposta qualitativa in termini di positività o negatività del campione mettendo a confronto la linea T del test e la linea C del controllo. Al fine di ottenere un controllo di qualità dell aflatoxin test strip l azienda CHARM SCIENCES responsabile della fabbricazione di tali test ha analizzato contemporaneamente 1167 campioni di latte con la metodica HPLC e con l aflatoxin test e sono stati ottenuti dei valori medi con l aflatoxin test ai quali corrispondono valori medi espressi in ppt ottenuti con il metodo HPLC. Tali valori possono essere utilizzati come indicazione per l interpretazione della lettura ottenuta con il rosa reader: Dall analisi di 233 campioni di latte è stato ottenuto un valore medio di -603 con l aflatoxin test al quale corrisponde l assenza di AFM1 nel latte valore ottenuto con la metodica HPLC. Dall analisi di 279 campioni è stato ottenuto un valore medio di +2 con l aflatoxin test al quale corrisponde il valore di 25 ppt ottenuto con la metodica HPLC. Dall analisi di 252 campioni è stato ottenuto un valore medio di +414 con l aflatoxin test al quale corrisponde un valore di 50 ppt ottenuto con il metodo HPLC, limite stabilito dalla legislazione comunitaria. I valori arrivano fino a 100 ppt in quanto il test è fabbricato da un industria che a sede negli Stati Uniti, dove il livello di accettabilità per legge è dieci volte superiore (0,5 ppb) rispetto ai limiti fissati dalla legislazione comunitaria. Quando si eseguono le analisi su campioni di latte per valutare la concentrazione di AFM1 e si riscontrano valori positivi sospetti, si inviano i campioni ai laboratori accreditati per il controllo in HPLC (cromatografia liquida ad alta pressione). Mensilmente sia il lettore rosa reader che il test strip vengono tarati utilizzando 100 ppt di aflatossina pura diluita in 5 ml di latte. Il monitoraggio della contaminazione da AFM1 nel latte bovino è stato effettuato durante un periodo di tre anni, dall anno 2004 all anno I risultati delle analisi a cui sono stati sottoposti campioni di latte bovino durante i tre anni sono stati riportati nei seguenti grafici, dove per ogni mese viene indicato il valore medio di AFM1, il quale è stato ottenuto effettuando per ogni mese una media dei valori di AFM1 ottenuti sottoponendo ogni giorno campioni di latte alle analisi con l aflatoxin test. I valori di aflatossina M1 sono espressi in ppt e corrispondono ai valori ottenuti con l aflatoxin test utilizzato nella centrale del latte. In ciascun grafico si può osservare l andamento della contaminazione da aflatossina M1 nel latte bovino proveniente dagli allevamenti intensivi e tradizionali della provincia di Rieti. Dai grafici possiamo osservare che i due periodi critici caratterizzati da un elevata concentrazione di aflatossina M1 nel latte sono la primavera e fine estate. Durante la primavera c è una ricontaminazione dei prodotti zootecnici contenuti nei silos in seguito all instaurarsi di determinate condizioni ambientali quali temperatura ed umidità elevate, fattori che favoriscono la produzione da parte dei funghi aspergillus già presenti nelle derrate di aflatossina B1. assenza di AFM1-603, SD=233 Andamento della contaminazione da AFM1 nel latte bovino 25 ppt +2, SD = ppt +414, SD = ppt +670, SD = ppt +943, SD = 182 Anno 2004 Anno 2005 Anno / 356

5 Mentre il periodo di agosto-settembre si configurano come un periodo a rischio in quanto: il mais della campagna precedente ancora in uso, sia esso proveniente dagli stoccaggi aziendali, sia esso acquistato sul mercato, è ormai rappresentato solo dagli avanzi (prodotti di qualità inferiore), rimasti nei magazzini o nei silos di stoccaggio, quindi, pur essendo commercializzabile (ovvero con un contenuto di AFB1 inferiore alle 20 ppb) può contenere polveri e rotture delle cariossidi con più alto contenuto di AFB1 che possono poi nella bovina da latte trasformarsi in un contenuto di AFM1 nel latte che rischia di eccedere il limite di legge delle 50 ppt; il primo mais dell annata in corso che arriva sul mercato è rappresentato o da mais precoci, che per loro caratteristiche fisiologiche subiscono maggiormente gli stress ambientali e climatici o proprio da quei mais che, essendo coltivati in zone a ridotta disponibilità idrica o con attacchi parassitari particolarmente severi, raggiungono la maturazione prima degli altri di uguale classe produttiva. Nei grafici emerge che il rischio di contaminazione del latte nell allevamento tradizionale è minore rispetto a quello intensivo per la differente tipologia di alimentazione. Nell allevamento intensivo gli animali vengono alimentati con unifeed, ovvero mais, insilato di mais, fieno di qualità e scadente, farine di graminacee, nuclei proteici e farine di soia, cotone e altri sottoprodotti industriali. Nell allevamento tradizionale gli animali vengono invece alimentati durante la stagione invernale con il fieno e durante la primavera con foraggio fresco (erba) e mangimi. Dall osservazione dei grafici emerge che la concentrazione di AFM1 nel latte rientra al di sotto del limite di legge di 50 ppt e si nota che dall anno 2004 all anno 2006 c è stato un lento ma graduale miglioramento della contaminazione del latte in seguito ad una costante informazione degli allevatori sul rischio aflatossine e sulla corretta gestione degli alimenti. Mentre durante il periodo di agosto-settembre gli animali sono stati alimentati con prodotti di qualità inferiore della campagna precedente, rimasti nei magazzini o nei silos di stoccaggio, che, pur essendo commercializzabile (ovvero con un contenuto di AFB1 inferiore alle 20 ppb) possono contenere polveri e rotture delle cariossidi con più alto contenuto di AFB1 che possono poi nella bovina da latte trasformarsi in un contenuto di AFM1 nel latte che rischia di eccedere il limite di legge delle 50 ppt. Inoltre è emerso che il rischio di contaminazione del latte nell allevamento tradizionale è minore rispetto a quello intensivo per la differente tipologia di alimentazione. Effettuando un confronto tra l andamento della contaminazione di aflatossina M1 nel latte bovino nell anno 2004, 2005, 2006 è stato riscontrato che c è stato un lento ma graduale miglioramento della contaminazione del latte in seguito ad una costante informazione degli allevatori sul rischio aflatossine e sulla corretta gestione degli alimenti zootecnici. Per prevenire il rischio di contaminazione del latte la normativa vigente prevede, per tutti i punti critici della filiera quali stabilimenti e depositi di cereali, granella e farine, mangimifici, allevamento, stabilimenti di lavorazione del latte, l obbligo di adottare un piano di autocontrollo, in cui sia prevista una sezione specifica per il controllo delle aflatossine con l indicazione della periodicità, del metodo d analisi e del sistema di rintracciabilità dei singoli conferenti. Gli organi ufficiali dovranno verificare la presenza, l attuazione e l efficacia delle procedure di autocontrollo e provvedere ad eseguire eventualmente campioni ufficiali. Conclusioni Dallo studio condotto sul monitoraggio della contaminazione da aflatossina M1 nel latte bovino nella provincia di Rieti, durante tre anni, dall anno 2004 all anno 2006, è emerso che la concentrazione di aflatossina M1 rientra al di sotto del valore soglia di 50 ppt. Dall osservazione dell andamento della contaminazione da aflatossina M1 nel latte bovino, sono stati individuati due periodi critici, la primavera e fine estate, caratterizzati da un aumento della concentrazione di aflatossina M1 nel latte; in quanto gli animali sono stati alimentati durante la primavera con prodotti zootecnici contenuti nei silos che hanno subito una ricontaminazione in seguito all instaurarsi di determinate condizioni ambientali quali temperatura ed umidità elevate, fattori che favoriscono la produzione da parte dei funghi aspergillus già presenti nelle derrate di aflatossina B1. 8 / 357