Coltivazione dei microrganismi

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1 Coltivazione dei microrganismi

2 ! 1. ENERGIA Esigenze nutrizionali Fototrofi: utilizzano l energia radiante Chemiotrofi: utilizano l ossidazione di composti chimici! 2. CARBONIO Fotoautotrofi Autotrofi: richiedono solo CO2 Chemioautotrofi Eterotrofi: richiedono una forma organica di C Dipendono dagli organismi autotrofi per la produzione di carboidrati ed altre sostanze organiche

3 Esigenze nutrizionali (cap. 5.1)! 3. AZOTO! Costituente di proteine, acidi nucleici e coenzimi Azoto atmosferico Proteine Composti organici e inorganici dell azoto! 4. ZOLFO! Costituente di proteine, CoA Composti organici ed inorganici dello zolfo! 5. FOSFORO! Costituente di DNA, RNA, fosfolipidi, coenzimi Fosfati

4 Esigenze nutrizionali (cap. 5.1)! ELEMENTI METALLICI! Sodio, potassio, calcio, magnesio, manganese, ferro, zinco, rame, cobalto! Fattori! di! crescita:! VITAMINE! H 2 O

5 Tipi nutrizionali di batteri

6 Batteri autotrofi! Hanno un elevata capacità di sintesi e possono trasformare composti semplici in carboidrati, grassi, proteine, acidi nucleici e vitamine.! I batteri autotrofi sono importanti nel riciclaggio degli elementi attraverso i sistemi biologici.! Terreni di coltura sintetici! Sono terreni costituiti da composti! chimici noti

7 Batteri eterotrofi! Sono stati studiati più di quelli autotrofi in quanto comprendono tutte le specie patogene come anche la maggior parte della popolazione microbica nel nostro ambiente.! Tutti i batteri eterotrofi necessitano di una fonte di C organica, ma hanno esigenze nutrizionali molto diverse.

8 Batteri eterotrofi! Nei terreni di coltura si deve usare una miscela bilanciata dei nutrienti richiesti, a concentrazioni che permettano una buona crescita! Se i terreni sono sterilizzati in autoclave, il glucosio deve essere sterilizzato separatamente e aggiunto sterilmente al terreno. Infatti quando gli zuccheri vengono riscaldati in presenza di altri ingredienti, in particolare i fosfati, sono parzialmente decomposti e formano sostanze che sono molto tossiche per alcuni microrganismi! Notare la differente esigenza per quanto riguarda la fonte di azoto: per E. coli è sufficiente il fosfato

9 Terreni batteriologici! Per l ordinaria coltivazione in laboratorio dei batteri eterotrofi si impiegano dei terreni costituiti da complesse materie grezze che promuovono l accrescimento di molti dei microrganismi eterotrofi LB: Triptone 1% NaCl 1% Yeast extract 0.5% YPD: Glucosio 2% Peptone 2% Yeast extract 1% SOC: Triptone 2% NaCl 0.05% Yeast extract 0.5% Glucosio 20mM KCl 20mM MgCl 2 0.1M

10 Tipi di terreni colturali! Terreni arricchiti Es. aggiunta di componenti (come il sangue) che consentono la crescita di microrganismi esigenti! Terreni selettivi Es. Un terreno che contenga come unica fonte di carbonio il maltosio consentirà di isolare solo quei microrganismi in grado di metabolizzarlo! Terreni differenziali Es. in presenza di sangue solo i batteri emolitici formeranno colonie circondate da una zona limpida In realtà il terreno agar-sangue può servire nello stesso tempo da terreno arricchito e da terreno differenziale

11 Preparazione dei terreni di coltura! Ogni ingrediente viene disciolto nell appropriato volume di acqua! Si determina il ph (ed eventualmente si aggiusta)! Si distribuisce il terreno nei contenitori! Si sterilizza il terreno (autoclave)

12 Fattori di crescita! Vengono indicati con questo termine tutti quei metaboliti che la cellula non può sintetizzare perché priva delle relative catene biosintetiche o perché le ha perse in seguito ad una mutazione.! Un microrganismo con un esigenza di questo tipo viene detto AUXOTROFO (microrganismo che non può sintetizzare alcuni nutrienti essenziali).! Spesso i fattori di crescita rientrano in queste categorie. vitamine del gruppo B aminoacidi acidi grassi basi puriniche o pirimidiniche

13 Effetto della Temperatura sul tasso di crescita Temperature cardinali Figura 6.16

14 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento! 1. TEMPERATURA Figura 6.17

15 Condizioni fisiche necessarie per! 1. TEMPERATURA l accrescimento Effetto della temperatura sull accrescimento di una specie psicrofila

16 Figura 6.18

17 Adattamenti molecolari alla psicrofilia! Maggiore quantità di!-eliche, minore quantità di foglietti " Maggiore flessibilità in ambiente freddo! Efficiente trasporto attivo grazie alla notevole quantità di acidi grassi insaturi, responsabili del mantenimento della fluidità delle membrane a basse temperature

18 Figura 6.20 Yellowstone National Park

19 Tabella 6.1 Limiti superiori di temperatura Group Animals Fish 38 Insects Crustaceans Plants Vascular Plants 45 Mosses 50 Eukaryotic Microorganisms Protozoa 56 Algae Fungi Prokaryotes Bacteria Cyanobacteria Anoxygenic phototrophs Chemotrophs 95 Archaea 113 Upper temp limit ( C) 70-73

20 Adattamento alle alte temperature Cap e 18.11! PROTEINE la sequenza primaria non differisce di molto dalle altre proteine, tuttavia presentano un nucleo idrofobico che diminuisce la tendenza della proteina ad aprirsi (unfolding). poiché la capacità di avvolgimento (folding) è essenziale, sono sufficienti minime variazione della sequenza primaria per rendere una proteina più resistente alle alte temperature. aumentano i legami ionici tra le cariche positive e quelle negative di vari aminoacidi. soluti quali di-inositolo fosfato, diglicerolfosfato e manosilglicerato stabilizzano le proteine contro la degradazione termica. chaperonine

21 Adattamento alle alte temperature Cap e 18.11! DNA 2,3-difosfoglicerato di potassio ciclico: previene danni chimici al DNA causati dalle alte temperature(es. depurinazione) DNA girasi inversa: induce superavvolgimenti positivi proteine simili agli istoni consentirebbero l apertura delle eliche per la trascrizione Sac7 (Sulfolobus): questa proteina si lega al solco minore del DNA e ne aumenta la temperatura di fusione di 40 C

22 Adattamento alle alte temperature Cap e 18.11! LIPIDI Presenza di acidi grassi saturi, tetraeteri di bifitanile

23 Adattamento alle alte temperature Cap e 18.11! MONOMERI ATP e NAD si idrolizzano rapidamente ad alta temperatura, nonostante ciò la vita sembra compatibile a temperature superiori a 120 C (Pyrodictium) Se si riuscisse ad isolare un organismo in grado di crescere oltre i 150 C, questo dovrebbe avere un metabolismo energetico basato su qualche cosa di diverso dall ATP.

24 Aspetti biotecnologici della termofilia! DNA polimerasi isolata dal termofilo Thermus aquaticus! Taq polimerasi. PCR! Enzimi termostabili per applicazioni industriali

25 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento: ph Fig. 6.22

26 ! 2. Ph Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento! Il ph del terreno può variare durante la crescita. Per questo motivo si può usare incorporato nel terreno un tampone.! Es. Tampone fosfato! KH 2 PO 4 +K 2 HPO 4! K 2 HPO 4 +HCl KCl + KH 2 PO 4! KOH+ KH 2 PO 4 H 2 O+K 2 HPO 4

27 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento! Acidofili: Thibacollus, Solfolobus, Thermoplasma, Ferroplasma. La membrana plasmatica lisa a ph vicini alla neutralità in quanto gli ioni H+ sono necessari per mantenere la stabilità della membrana plasmatica.! Basofili: Bacillus, alcuni Archea. Usati per la produzione di enzimi da usare come additivi ai detersivi (es. proteasi, lipasi). Interessanti problemi bioenergetici.! ph intracellulare: neutrofili: 6-8 acidofili:4,6 basofili: 9,5

28 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento: osmolarità! Attività dell acqua:! E il rapporto tra la pressione di vapore dell aria in equilibrio con una sostanza, o con una soluzione, e la pressione di vapore dell acqua pura! Normalmente le cellule sono in equilibrio idrico positivo, ma se si trovano in un ambiente in cui l attività dell acqua è bassa, tenderanno a perdere acqua. Ambiente ipertonico

29 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento: osmolarità Fig. 6.23

30 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento! 3. OSMOLARITA! Osmotolleranti: sono in grado di mantenere una concentrazione interna di soluto sufficientemente elevata per trattenere l acqua.! Meccanismi Batteri: ++ concentrazione amminoacidi (es. Pro, Glu) Funghi: ++ concentrazione di saccarosio e polioli (arabitolo, glicerolo e mannitolo) Ambiente ipertonico! Alofili: richiedono per la crescita concentrazioni di sale comprese tra 2.8M e 6.2M! Meccanismi Significative modificazioni strutturali delle proteine e della membrana.

31 Soluti compatibili - Aminoacidi e loro derivati - Zuccheri altamente solubili in acqua - Alcoli derivato ciclico dell acido aspartico Fig. 6.24

32 Soluti compatibili Fig. 6.24

33 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento: esigenze gassose

34 Condizioni fisiche necessarie per! 4.ESIGENZE GASSOSE l accrescimento! Le forme tossiche dell O 2, formati come prodotti secondari della respirazione, sono:! perossido d idrogeno H 2 O 2! anione superossido O 2 -! radicale ossidrile OH.

35 Tabella 6.4 Relazioni con l O 2 di vari microrganismi Gruppo Relazioni con Tipo di l O 2 metabolismo Aerobi Obligati Necessaria Respirazione aerobica Facultativi Microaerofili Anaerobi Aerotoleranti Obbligati Non necessaria, ma crescono meglio in presenza di O 2 Necessario ma a livelli più bassi di quello atmosferico Non necessario, non crescono meglio in presenza di O 2 Pericoloso o letale Respirazione aerobica, anaerobica, fermentazione Respirazione aerobica Fermentazione Fermentazione o respirazione anaerobica Esempio Micrococcus luteus Escherichia coli Spirillum volutans Streptococcus pyogenes Methanobacterium formicicum Habitat Pelle, polvere Intestino di mammiferi Acque lacustri Parte alta delle vie respiratorie Fanghi attivati sedimenti anossici lacustri

36 Metodi per visualizzare lo stato di ossidazione o eliminare l O 2 Il tioglicolato è un buon agente riducente La resazurina è un indicatore redox (rosa quando ossidata, incolore quando ridotta Figure 6.25 aerobico anaerobico facultatiovo microaerofilico aerotollerante

37 H 2 CO 2 Fig. 6.26

38 Fig. 6.26

39 ROS, specie tossiche dell ossigeno flavoproteine, chinoni, tioli, proteine ferro-zolfo Il più reattivo. Fonte: radiazioni ionizzanti, perossidi Figura 6.27

40 Enzimi che agiscono sui composti tossici dell ossigeno Gli anaerobi obbligati sono tali perché non hanno questi enzimi. Alcuni anaerobi obbligati usano la superossido reduttasi Figura 6.28

41 Figura 6.29 test per la presenza della catalasi H 2 O 2 + H 2 O 2 # 2 H 2 O + O 2

42 Anaerobi obbligati! Privi di superossido dismutasi! Uso della superossido reduttasi: riduce il superossido a H 2 O 2 senza la produzione di O 2! Assente la catalasi! H 2 O 2 rimossa dall attività di enzimi perossidasi-simili cheproducono H 2 O come composto finale

43 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento! Precauzioni per eliminare l ossigeno atmosferico! 1. aggiunta di tioglicato di sodio! 2. rimozione meccanica dell ossigeno! 3. reazione chimica all interno del recipiente (es. una caldela converte l ossigeno in anidride carbonica)! Influenza dell ossigeno nei processi di produzione! Acido citrico ++++ O 2! Aspergillus niger! Amilasi + O 2

44 Condizioni fisiche necessarie per l accrescimento! 5. PRESSIONE! Normalmente la pressione è di 1atmosfera! Barotolleranti! Barofili Batteri abitanti delle profondità marine