Analisi di dati RNA-Seq. Alberto Ferrarini

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1 Analisi di dati RNA-Seq Alberto Ferrarini

2 Il dogma centrale della biologia molecolare DNA Replicazione RNA Trascrizione Traduzione PROTEIN Geni sono trascritti da DNA ad mrnache lascia il nucleo e viene tradotto in proteine. 2

3 Il trascrittoma Il set completodi tuttiglimrna di un organismoin un dato momento. Il trascrittoma è dinamico e cambia a seconda delle condizioni considerate. Differenticondizionidannoluogoa differentiprofilidi espressione genica. Trascrittomica: lo studio del trascrittoma; l analisidel trascrittomain diverse condizioni permette di inferire quali geni siano potenzialmente coinvolti in un dato processo di sviluppo, risposta a stress, ecc

4 Analisi di espressione genica Prima delle tecnologie omiche Uno o pochi geni analizzati per volta tramite analisi Northerno PCR quantitativa/semiquantitativa Oggi Dapochemigliaiadigenia trascrittomi completi analizzati in un singolo esperimento. Microarray NextGeneration Sequecing(NGS) 4

5 Evoluzione delle tecnologie di analisi del trascrittoma Sviluppati i primi microarray basati su spotting di molecole di cdna 2002-High density oligo microarrays 2008-RNA-Seq: sequenziamento dei messaggeri basato su tecnologie NGS Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray- Schena et. al.

6 Sequenziamento del trascrittoma Campioni di interesse Tessuto normale Tessuto tumorale Isolamento dell RNA/mRNA Frammentazione chimica Immagine modificata da: Sequenziamento Conversione a cdnae ligazione degli adattatori AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT AGTCGTGGATCCAT Milioni di read paired-end

7 Perché sequenziarel RNA? Studi funzionali:comparazione dell espressione genica tra diverse condizioni (sano-malato, diversi tessuti, risposta ad uno stimolo, ecc ) Studio delle isoforme di espressione Identificazione di trascritti non annotati Studio RNA editing Identificazione di trascritti di fusione

8 Protocollo di analisi dati RNA-Seq reads Allineamento su un genoma di riferimento genome Assegnamento delle read ai geni annotati Known gene Unknown gene Rilevazione di eventuali geni nuovi non annotati Quantificazione dell espressione e analisi statistica Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., & Wold, B. (2008). Mappingand quantifyingmammaliantranscriptomesby RNA-Seq. Nature methods, 5(7), doi: /nmeth.1226.

9 Assegnamento delle readai geni e quantificazione dell espressione genica Il numero di readche mappano su un gene è proporzionale al livello di espressione I valori di espressione ottenuti dall RNA-Seqderiva dalla conta diretta delle readche mappano su un gene: misura digitale Non richiede la conoscenza a priori delle posizioni dei geni Intervallo dinamico più ampio comparato a microarray

10 Disegno sperimentale: numero di replicati Tre o più repliche biologiche Non sono generalmente richieste repliche tecniche della stessa libreria ad RNA La correlazioner 2 (Pearson) trailivellidiespressione degli RNA rilevati in comune tra 2 replicati biologici dovrebbe essere tra 0.92 e Esperimenti con correlazioni inferiori a 0.9 devono venire ripetuti o spiegati.

11 Disegnosperimentale: profonditàdi coperturarichiesta Numero di ORF rilevate al variare della profondità Numero di siti di inizio della trascrizione al variare della profondità Analisi di epressione differenziale: sono raccomandate 30 o più milioni di read paired-end(uomo). Esperimenti destinati alla scoperta e caratterizzazione di nuovi geni/isoforme o finalizzati ad una quantificazione molto solida delle isoforme richiede coperture maggiori (fino a M di frammenti) Wang, Z., Gerstein, M., & Snyder, M. (2009). RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev. Retrieved from

12 Disegnosperimentale: profonditàdi coperturarichiesta Il numerodiread richiestedipendeanchedaltipodirna chevogliamo caratterizzare. Tarazona, S., Garcia-Alcalde, F., Dopazo, J., Ferrer, a., & Conesa, a. (2011). Differential expression in RNA-seq: A matter of depth. Genome Research. doi: /gr

13 Problematiche connesse con l analisi di dati RNA-Seq Allineamento delle readottenute da librerie a cdnasu sequenze genomiche (per metodi basati su genoma di riferimento). Assemblaggio de novodelle readottenute da librerie a cdnain putativi trascritti (per metodi che non utilizzano il genoma di riferiemento). Quantificazione dei livelli di epressione Analizzare l espressione differenziale

14 Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., & Trapnell, C. (2011). Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nature methods, 8(6), doi: /nmeth.1613

15 Metodi di ricostruzione del trascrittoma Metodi guidati dal genoma Metodi indipendenti dal genoma Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., & Trapnell, C. (2011). Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nature methods, 8(6), doi: /nmeth.1613

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17 Nel caso di metodi basati sul genoma il primo passaggio è l allineamento delle read ottenute dai frammenti al genoma di riferimento

18 Allineamento di readrna-seqad un genoma di riferimento esoni genoma mrna introni In un esperimento RNA-Seqle readvengono generate dal sequenziamento delle estremità di frammenti da bpdell RNA messaggero da cui le sequenze intronichesono state rimosse dal macchinario di splicing durante la maturazione dell mrna. Alcuni frammenti saranno a cavallo delle giunzioni esone-esone

19 Allineamento di readrna-seqad un genoma di riferimento esoni genoma mrna introni Readderivanti da frammenti contenuti completamente in singoli esoni mapperanno correttamente con una distanza tra le read compatibile con le dimensioni della libreria

20 Allineamento di readrna-seqad un genoma di riferimento esoni genoma mrna introni Coppie di read mappanti su 2 esoni diversi avranno una dimensione dell inserto non compatibile con le dimensioni della libreria Dimensioni libreria

21 Allineamento di readrna-seqad un genoma di riferimento esoni genoma mrna introni Reada cavallo di una giunzione esone-esone non potranno essere mappate correttamente dagli algoritmi standard.

22 Allineamento di readrna-seqad un genoma di riferimento esoni genoma mrna introni Reada cavallo di una giunzione esone-esone non potranno essere mappate correttamente dagli algoritmi standard.

23 Allineamento di readrna-seqad un genoma di riferimento esoni genoma mrna introni Idealmente la readdovrebbe essere spezzata in uno spliced alignmentche tenga conto dell introne

24 Non mappare le readsovrapposte a giunzioni esone-esone porterebbe alla sottostima dell espressione dei geni con tanti esoni

25 Utilizzo di un database di giunzioni di splicing Un database di giunzioni custom viene costruito unendo le estremità degli esoni. Readsplicedvengono rilevate allineando le readnon mappanti sul database di giunzioni. Una limitazione di questo aproccioè che può rilevare solo giunzioni note. [ ] Database custom di giunzioni note. Wang, E. T., Sandberg, R., Luo, S., Khrebtukova, I., Zhang, L., Mayr, C., Burge, C. B. (2008). Alternative isoformregulationin humantissuetranscriptomes. Nature, 456(7221), doi: /nature07509

26 Metodi computazionali per allineamento splittato di read su un genoma di riferimento Gli approcci per l allineamento delle readsu un genoma di riferimento si dividono in: approccio exon-first approccio seed-extent

27 Approccio exon-first Nell approccio exon-first vengono prima allineate tutte le read sul genoma. Le readche non mappano utilizzate per trovare siti di splicing candidati. Software: Tophat MapSplice SpliceMap Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., & Trapnell, C. (2011). Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nature methods, 8(6), doi: /nmeth.1613

28 TopHat Pipeline scritta in Pythone C++ basata su Bowtiee la libreria SeqAn Versione pubblicata quando le read erano tendenzialmente < 50 bp

29 Identificazione abinitiodei siti di splicing(fino a versione 0.8.3) Bowtiemappa le readsul genoma con un massimo di 2 mismatch nel seede 10 allineamenti multipli (serve a riportare geni con copie multiple). Le readallineate vengono quindi assemblate in un consenso a cui vengono aggiunte 45 basi dalle regioni fiancheggianti. Vengono quindi identificati i possibili siti donatori e accettori di splicingcanonici (GT-AG) verso le estremità di queste regioni. Le readnon mappanti vengono mappate sui putativi siti di splicing.

30 TopHat1.0 Dalla versione 1.0 sfrutta le maggiore lunghezza delle read Maggiore sensibilità Unmappable read Reference genome Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics(Oxford, England), 25(9), doi: /bioinformatics/btp

31 TopHat1.0 Dalla versione 1.0 sfrutta le maggiore lunghezza delle read Maggiore sensibilità Readnon mappate da 75 basi (o più lunghe) vengono splittatein 3 o più subreadda 25 basi che vengono mappate indipendentemente. 25nt Unmappable read Reference genome Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics(Oxford, England), 25(9), doi: /bioinformatics/btp

32 TopHat1.0 Dalla versione 1.0 sfrutta le maggiore lunghezza delle read Maggiore sensibilità Readnon mappate da 75 basi (o più lunghe) vengono splittatein 3 o più subreadda 25 basi che vengono mappate indipendentemente. Read con segmenti che possono essere mappati solo in maniera non contigua Marcati come possibili read intronspanning 25nt Unmappable read Reference genome Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics(Oxford, England), 25(9), doi: /bioinformatics/btp

33 TopHat1.0 Dalla versione 1.0 sfrutta le maggiore lunghezza delle read Maggiore sensibilità Readnon mappate da 75 basi (o più lunghe) vengono splittatein 3 o più subreadda 25 basi mappate indipendentemente. Read con segmenti che possono essere mappati solo in maniera non contigua Marcati come possibili read intronspanning Il set di tutte le possibili combinazioni dondatore-accettore viene descritto da: L1+L2=k; 1 < L1 < k-1; L2 = k-l1 25nt Unmappable read L 1 L 2 Reference genome Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics(Oxford, England), 25(9), doi: /bioinformatics/btp

34 TopHat1.0 Dalla versione 1.0 sfrutta le maggiore lunghezza delle read Maggiore sensibilità Readnon mappate da 75 basi (o più lunghe) vengono splittatein 3 o più subreadda 25 basi mappate indipendentemente. Read con segmenti che possono essere mappati solo in maniera non contigua Marcati come possibili read intronspanning Il set di tutte le possibili combinazioni dondatore-accettore viene descritto da: L1+L2=k; 1 < L1 < k-1; L2 = k-l1 k basia montedel sitodonatore concatenate con k basia valle dell accettore 25nt Unmappable read donor site acceptor site Reference genome Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics(Oxford, England), 25(9), doi: /bioinformatics/btp

35 TopHat1.0 Dalla versione 1.0 sfrutta le maggiore lunghezza delle read Maggiore sensibilità Readnon mappate da 75 basi (o più lunghe) vengono splittatein 3 o più subreadda 25 basi mappate indipendentemente. Read con segmenti che possono essere mappati solo in maniera non contigua Marcati come possibili read intronspanning Il set di tutte le possibili combinazioni dondatore-accettore viene descritto da: L1+L2=k; 1 < L1 < k-1; L2 = k-l1 k basia montedel sitodonatore concatenate con k basia valle dell accettore Unmappable reads Allineamento delle read non allineabilial database di giunzioni Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics(Oxford, England), 25(9), doi: /bioinformatics/btp

36 Limiti dei sistemi exon-first Il genoma umano contiene circa 14,000 pseudogenie molti pseudogenihanno una sequenza simile ad un gene annotato readpossono mappare sia sul gene che sul corrispondente pseudogene L allineamento su pseudogeniprocessati favorito rispetto all allineamento sul gene nel caso di read a cavallo di giunzioni esone-esone. La maggior parte delle read a cavallo di giunzioni assorbite da pseudogeni Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., & Trapnell, C. (2011). Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nature methods, 8(6), doi: /nmeth.1613kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., & Salzberg, S. L. (2013). TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology, 14(4), R36. doi: /gb r36

37 Basato su Bowtie2 (migliore sensibilità per Indel) Attua una serie di strategie per migliorare la sensibilità e la specificità di allineamento. Riduce il problema di allineamenti scorretti dovuti a pseudogeni

38 Workflowdi TopHat2 1) transcriptome mapping Se viene fornita un annotazione (consigliato) TopHat2 allinea le readcontro le sequenze del trascrittoma. aumenta la sensibilità e specificità verso trascritti noti. c c TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology, 14(4), R36. doi: /gb r36

39 Workflowdi TopHat2 1) transcriptome mapping c Le readche non mappano sui trascritti annotati vanno al passaggio successivo TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology, 14(4), R36. doi: /gb r36

40 Workflowdi TopHat2 2) genomemapping c c Nel secondo passaggio le read che vengono mappate in modalità end-toendsul genoma di riferimento solo le readche mappano completamente su un esone vengono allineate TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology, 14(4), R36. doi: /gb r36

41 Workflowdi TopHat2 2) genomemapping c c Readche non mappano completamente sul genoma vanno al passaggio successivo. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology, 14(4), R36. doi: /gb r36

42 Workflowdi TopHat2 Readnon mappate nel secondo passaggio vengono utilizzate per cercare i segnali di splicing(gt-ag, GC-AG, AT-AC). E stato inoltre integrato algoritmo per identificare breakpoint di fusione (da TopHat- Fusion) 3) splicedmapping

43 Workflowdi TopHat2 3) splicedmapping Nell ultima fase di questo passaggio vengono riallineate le readche si sovrappongono minimamente con sequenze introniche

44 Soglia basata sulla edit-distance TopHat2 consente di indicare una soglia (t) basata sulla edit distance: Se una readallinea in un passaggio ma con una editdistance t essa verrà riallineata nei passaggi successivi per cercare un eventuale allineamento migliore. Se viene settata una soglia t = 0 tutte le readche mappano nel passaggio 1 verranno riallineate nei passaggi successivi aumenta la sensibilità e la specificità.

45 Effetto in presenza di pseudogeni Allineamento contro trascrittomanoto assegna tutte le readpossibili ai trascritti noti evitando che allineino contro gli pseudogeni corrispondenti Riallineamento basato su editdistanceconsente di rimapparereadsovrapposte a siti di splicingignoti mappate scorrettamente a pseudogeni nel passaggio 2.

46 Approccio seed-extent Nell approccio seed-extend viene memorizzato un indice di k-mer del genoma. Le readvengono divise in k- mere confrontate con l indice del genoma. I k-mermappati vengono quindi estesi e l allineamento può includere siti di splicing. Software: GSNAP QPALMA Sistemi seed-extentsono accurati ma generalmente molto più lenti di sistemi exonfirst Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., & Trapnell, C. (2011). Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nature methods, 8(6), doi: /nmeth.1613

47 GSNAP Genomic Short-read Nucleotide Alignment Program Allineatore creato per identiticarevarianti complesse e siti di splicingda readngs.

48 Allineamento sul reference space GSNAP utilizza una tabella di hashdei possibili 12-mer sul genoma (spaziati di 3 nt). SNP in un 12-mer genomico vengono rappresentate duplicando le posizioni nella lista per tutte le combinazioni di alleli maggiori e minori nel 12-mer. Alleli maggiori vengono rappresentati in un genoma compresso mentre gli alleli minori vengono rappresentati in un altro genoma compresso. Wu, T. D., & Nacu, S. (2010). Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics (Oxford, England), 26(7), doi: /bioinformatics/btq057

49 Rilevazione di varianti ed eventi di GSNAP può utilizzare 2 tipi di evidenze per identificare i siti di splicing: splicing Wu, T. D., & Nacu, S. (2010). Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics (Oxford, England), 26(7), doi: /bioinformatics/btq057

50 Rilevazione di varianti ed eventi di GSNAP può utilizzare 2 tipi di evidenze per identificare i siti di splicing: 1. Modello probabilistico di siti donatoriaccettori splicing Wu, T. D., & Nacu, S. (2010). Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics (Oxford, England), 26(7), doi: /bioinformatics/btq057

51 Rilevazione di varianti ed eventi di GSNAP può utilizzare 2 tipi di evidenze per identificare i siti di splicing: 1. Modello probabilistico di siti donatoriaccettori 2. Database di estremità esone-introne note splicing Wu, T. D., & Nacu, S. (2010). Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics (Oxford, England), 26(7), doi: /bioinformatics/btq057

52 Rilevazione di varianti ed eventi di GSNAP può utilizzare 2 tipi di evidenze per identificare i siti di splicing: 1. Modello probabilistico di siti donatori-accettori 2. Database di estremità esone-introne note Eventi di splicing possono anche essere intercromosomali (fusioni geniche) splicing Wu, T. D., & Nacu, S. (2010). Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics (Oxford, England), 26(7), doi: /bioinformatics/btq057

53 ControlloqualitàdidatiRNA-Seq RseQC è un pacchetto software che fornisce dei moduli per controllare la qualità delle sequenze RNASeq allineate

54 Livellodiduplicazione read_duplication.py calcola i livelli di duplicazione a livello di allineamento e a livello di sequenza.

55 Readduplicate nei dati RNA-Seq Readduplicate non vengono normalmente rimosse dai dati RNA-Seq: Duplicati di PCR non sono distinguibili da frammenti uguali dovuti a elevati livelli di espressione

56 Distribuzionedelleread Distribuzione delle read tra le diverse feature (CDS,UTR, Introni, ) Distribuzione tra le feature Read intergeniche cds 5'UTR 3'UTR intron intergenic TSS_up_5kb TES_down_1kb TES_down_10kb TSS_up_10kb TSS_up_1kb TES_down_5kb upstream downstream Bias possono intervenire se i rapporti CDS/UTR/Introni non vengono mantenuti

57 Analisidel gene body coverage Permette di rilevare bias nel coverage rispetto alla posizione nel gene body 3 end bias Un bias al 3 potrebbe indicare un campione degradato.

58 Distanzatrapaiadiread Distanza tra due paia di read tenendo in considerazione la posizione degli introni.

59 SaturazionedegliRPKM RPKM_saturation.py Stima dell'errore come percentuale comparata all'rpkm ottenuto da tutte le read. Q1, Q2, Q3, Q4 sono i 4 quartili di espressione.

60 ReadsPer Kilobaseofgene per Million mappedreads(rpkm) Valore di espressione normalizzato dividendo le conte grezze per la lunghezza in kilobasidei geni e per i milioni di readtotali mappate per campione: Geni più lunghi hanno una maggiore probabilità di essere sequenziati Il numero di readottenute può variare a seconda della run di sequenziamento

61 Comparazionedellegiunzionirilevate con l annotazione Total splicing Events: Known Splicing Events: Partial Novel Splicing Events: 3396 Novel Splicing Events:1941 Total splicing Junctions: 4326 Known Splicing Junctions: 3871 Partial Novel Splicing Junctions: 259 Novel Splicing Junctions: 196 splice event: Unaread RNA-Seq, specialmentese lunga, puòvenire splittata2 o piùvolte; ognivoltavienecontata come splicing event splice junction: eventi di splicing multipli riguardanti lo stesso introne.

62 Saturazionedellegiunzioni Fornisce una misura di quanto la profondità utilizzata è stata in grado di saturare le giunzioni di splicing note e novel importante se si è interessati all analisi dello splicing alternativo. Giunzioni note a saturazione Giunzioni note non sono saturate