Studi genomici nei microorganismi

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1 Studi genomici nei microorganismi Edoardo Puglisi Istituto di Microbiologia Facoltà di Agraria Università Cattolica del Sacro Cuore Piacenza, Italy BioDNA Workshop La genomica al servizio dell agricoltura Piacenza, Università Cattolica del Sacro Cuore, 25 Maggio 2012

2 SCHEMA La genomica dei microorganismi e la sua importanza in agricoltura Cenni a tecniche di sequenziamento, assemblaggio, annotazione Applicazioni della genomica microbica/casi studio: Biodiversità in Lactobacillus rhamnosus Degradazione dei contaminanti e resistenza al freddo in Pseudomonas Patogenicità e resistenza agli antibiotici: Enterococcus faecium ed Escherichi coli O157:H7 La genomica come anticamera delle scienze omiche Trascrittomica (DNA-microarrays, RNASeq) Metagenomica Metatrascrittomica Sviluppi futuri

3 L IMPORTANZA DELLA GENOMICA MICROBICA Superamento degli approcci riduzionistici Quadro completo dei geni di un organismo Biodiversità e mining genomico Studi di trasferimento genico laterale (e.g. antibiotico resistenze, metabolismo degli xenobiotici) Ricostruzione di vie metaboliche (KEGG) Un ponte per le scienze omiche Biologia dei sistemi it is like being given the operating manual for your car after you have been trying to trouble-shoot a problem with it for some time David Relman, Stanford University, intervistato nel 2011 dal New York Times

4 (BREVE) STORIA DEL SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI MICROBICI 1977 primo genoma completamente sequenziato: batteriofago φx174 (5386 bp) Primo sequenziamento utilizzando frammenti random di DNA: batteriofago λ (48502 bp) 1986 sequenziamento dei genomi mitocondriali (187 kbp) e cloroplastici (121 kbp) di Marchantia polymorpha 1995 primo sequenziamento genomico completo di un organismo libero Haemophilus influenzae (1.83 Mbp) Studi di trasferimento genico laterale (e.g. antibiotico resistenze, metabolismo degli xenobiotici) Fine anni 90 diversi microorganismi di interesse, tra cui archaea (Methanococcus jannaschii 1996) ed eucarioti (Saccharomices cerevisiae 1996) Sanger et al. (1977) Nucleotide sequence of bacteriophage φx174 Nature 265:

5 OGGI 3173 genomi completi: 153 archaea, 2487 batteri, 173 eucarioti Informazioni genomiche incomplete per 248 archaea, batteri, 1805 eucarioti Lagesen et al. (2010) Genome update: the 1000 genome a cautionary tale Microbiology 156:

6 SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE

7 Glenn TC (2011) Field guide to next-generation DNA sequencers Mol Ecol Res 11: SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE

8 Stein LD (2010) The case of cloud computing in genome informatics Genome Biology 11:207 SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE

9 INNOVAZIONE E MINIATURIZZAZIONE Piastra microtiter usata nel sequenziamento Sanger Vetrini utilizzati in tecniche di seconda generazione Piastra pico-titer usata nel sequenziamento 454 Nanostrutture e membrane di silicio per sequenziamento a livello di singola molecola Ståhl and Lunderberg. (2012) Towards the single-hour high-quality genome Annu Rev Biochem 81:

10 TECNICHE PER LO STUDIO DELLA GENOMICA MICROBICA Prima del deep sequencing Clonaggio di frammenti Vettori BAC e PAC PCR Primer walking Anni prima di arrivare ad un singolo genoma Dopo il deep sequencing Frammentazione ed analisi Due giorni per il genoma completo di E. coli O104:H4

11 APPROCCIO ORDERED CLONES Grosso frammento di DNA Digestione e clonaggio Intero genoma Frammenti sequenziati casualmente Copertura dei gaps Ripetere per l intero genoma

12 APPROCCIO DI SEQUENZIAMENTO RANDOM ( SHOTHGUN ) Intero genoma Frammentazione e clonaggio Sequenziamento random dei frammenti Copertura dei gaps

13 Contig 1 Contig 2 CONTIGS E COPERTURA DEL GENOMA

14 CONTIGS E COPERTURA DEL GENOMA Contig 1 Contig 2 Ri-sequenziamento Allineamento su un genoma noto (riferimento)

15 CONTIGS E COPERTURA DEL GENOMA Contig 1 Contig 2 Gap Sequenziamento de novo Chiusura dei gaps

16 DEEP SEQUENCING ED ASSEMBLAGGIO DEI GENOMI Assembly: unordered set of contigs Ordered sets of contigs (scaffolds) PCR product pri1 pri2 16 Clone walk PCR - sequence

17 ANNOTAZIONE DEI GENOMI MICROBICI Prima dell annotazione, un genoma appare come una sequenza di 4 basi distribuite casualmente Occorre una interpretazione che permetta una comprensione delle funzioni biologiche Steps fondamentali: identificazione di ORF (opening reading frames), CDS (coding sequences) e zone di regolazione L annotazione (=previsione della collocazione e della funzione di tutti i geni nella sequenza genomica di un organismo) è comunque solo il punto di partenza per la caratterizzazione e la comprensione di un organismo

18 ANNOTAZIONE DEI GENOMI MICROBICI Sequence Gene prediction Proteins Similarity searches against reference databases Calculations & predictions (MW, structure, location etc) Annotated Proteins Pathway prediction Annotated Proteins & pathways Manual editing Data visualization

19 L ONTOLOGIA DEI GENI Ontologie: rappresentazioni di oggetti misurabili o direttamente osservabili, e delle relazioni che avvengono tra essi (a livello logico, ogni cosa esistente è un sottotipo di qualcos altro) L ontologia dei geni è organizzata in tre gruppi separati: Funzioni molecolari Processi biologici Componenti cellulari Occorre tenere conto del fatto che ogni gene può: avere più di una funzione molecolare essere coinvolto in più processi biologici agire in più componenti cellulari

20 ANALISI E RICOSTRUZIONE DI VIE METABOLICHE ieri oggi

21 (ALCUNE) CARATTERISTICHE DEI GENOMI MICROBICI Giovannoni et al. (2005) Genome streaming in a cosmopolitan oceanic bacterium Science 309:

22 GENOMICA MICROBICA E PATOGENICITA : IL CASO ESCHERICHIA COLI O157:H7 Doppio habitat: Intestino, retto: caldo, costante, ricco di nutrienti, crescita vigorosa Acqua, suoli, sedimenti: freddo, fluttuante, nutrienti limitati E. coli O157:H7 ha circa 1000 geni in più rispetto a E. coli K12 Circa il 7.5% del genoma di E. coli O157:H7 è costituito da geni di virulenza Aree in rosso: geni presenti solo in E. coli K12 upregulated with epithelial cells 12% upregulated with norepinephrine 9% adhesion 23% Aree in arancione: geni presenti solo in E. coli O157:H7 Aree in blu: presenti in entrambi toxins 1% secretion systems 14% regulator 1% pathogen island 4% iron acquisition 3% defense from host barriers 8% hemolysin 2% effacing 1% effector 14% antigen 3% upregulated in human clinical isolates 5%

23 Eppinger et al (2011) Genomic anatomy of Escherichia coil O157:H7 PNAS 13: BIODIVERSITA MICROBICA E PATOGENICITA : IL CASO ESCHERICHIA COLI O157:H7

24 SCIENZE OMICHE E PROSPETTIVE FUTURE

25 UNA VISIONE DI INSIEME Biologia molecolare Scienze omiche Biologia dei sistemi

26 STUDI OMICI: TRASCRITTOMICA ug/kg PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 114 PCB 138 PCB 153 Total HPCD RE HPCD BA PCB 180 BP GLU SPIKED PCB NON CONT CONT Puglisi et al (2010) Transcriptional response of R. aetherovorans I24 to PCB-contaminated sediments Microb Ecol 60:

27 PROSPETTIVE PER IL FUTURO: TRASCRITTOMICA A SINGOLA CELLULA Kang et al (2012) Transcript amplification from single bacterium for transciptome analysis Genome Research 21:

28 METAGENOMICA AMBIENTALE Suoli& Oceani& Ghiacciai& Acidobacteria" Firmicutes" Bacteroidetes" Ac=nobacteria" Chloroflexi" Gemma=monadates" Nitrospira" Planctomycetes" Proteobacteria" Verrucomicrobia" Cyanobacteria" Unclassified" (869)& (900)& (4127)& (4884)& (4638)& (1556)& (8138)& (10230)& (383115)& (82783)& (182084)& (252218)& 0" 5000" 10000" 15000" 20000" numero"di"sequenze"16s"depositate"in"rdp"(totali)"

29 METAGENOMICA AMBIENTALE soil% human% ocean% gut% freshwater% plants% other% bacteria( soil% human% ocean% gut% freshwater% plants% other% archaea& Tamames et al. BMC Microbiology 2010, 10:85 RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) database query among (bacteria) and (archea) total sequences

30 Brul et al (2012) Omics technologies in quantitative microbial risk assessment Trends Food Sci Technol doi: /j.tifs

31 METATRASCRITTOMICA

32 CONCLUSIONI Avanzamento tecnologico fornisce strumenti sempre più potenti Necessità di una ancor maggiore comprensione dei processi biologici Opportuni strumenti bioinformatici accompagnati da solide ipotesi di ricerca Non scordarsi di altri approcci (e.g., coltivazione e studi fisiologici) Genomica come ponte per le scienze omiche Ampissime potenzialità di applicazione nei settori dell agricoltura, degli alimenti, dell ambiente e della salute

33 RINGRAZIAMENTI Prof. PierSandro Cocconcelli Dott. Fabrizio Cappa Dott.ssa Simona Gazzola Dott.ssa Daniela Bassi Dott.ssa Cecilia Fontana Dott.ssa Ester Pietta Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza Prof. Marco Trevisan Dott. Sotirios Vasileiadis Istituto di Chimica Agraria, Università Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza

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