Next-generation sequencing, annotazione, ed espressione genica. Giulio Pavesi Dip. Bioscienze Università di Milano
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- Marcello Marchesi
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1 Next-generation sequencing, annotazione, ed espressione genica Giulio Pavesi Dip. Bioscienze Università di Milano
2 Il primo passo... Abbiamo la sequenza completa del DNA di un organismo: Quanti geni contiene in tutto? Dove sono localizzati i geni? A cosa serve ciascun gene (ovvero, qual è la funzione della proteina codificata, ammesso che effettivamente codifichi per una proteina)? A quale livello è espresso ciascun gene nelle diverse condizioni?
3 Che cosa è un gene? Definizione genetica: Unità ereditaria degli organismi viventi Definizione molecolare: regione di sequenza genomica, corrispondente a un unità ereditaria
4 Il Dogma dei Geni (Eucariotici)
5 Start End DNA La sequenza dell RNA è idencca a uno dei due filamenc di DNA Dopo lo splicing, l mrna maturo esce dal nucleo della cellula ed entra nel citoplasma UTR Trascrizione SPLICING mrna (cdna) CDS UTR UTR : Regioni non trado/e: 5 UTR e 3 UTR CDS : CoDing Sequence (trado/a) RNA I gialli (introni) se ne vanno Rimangono i rossi (esoni) Traduzione in proteina
6 La trascrizione L RNA polimerasi, scorre lungo uno dei due filamenti (in direzione 3 5 ), costruendo una sequenza di RNA complementare al filamento su cui sta scorrendo In pratica, la polimerasi realizza una copia di uno dei due filamenti del DNA Per definizione, sul DNA il gene è annotato sul filamento UGUALE all RNA prodotto (nell esempio, sul filamento nero)
7 La struttura dell mrna (maturo) 5 3 AAAAAA Cap Coda di poly- A Codone di start (ATG) Codone di stop (UGA, ecc.) Regione non trado<a (5 UTR) Regione codificante (coding sequence - CDS) Regione non trado<a (3 UTR)
8 Leggere le sequenze E possibile determinare anche la sequenza di un trascritto (RNA) Quindi, se conosco la sequenza di un RNA, posso localizzare lungo la sequenza genomica la regione che lo produce (che è - a tratti - uguale al trascritto!) Se conosco anche la sequenza dell eventuale proteina codificata, allora ho completato l annotazione del gene
9 Dall mrna (maturo) al DNA 5 3 AAAAAA L mrna (maturo) è cosctuito dalla giunzione degli esoni. Quindi, mappando l RNA sul DNA corrispondente si trovano delle interruzioni Nota: non necessariamente la sequenza dell RNA è al 100% idencca a quella genomica trascri/a. Come mai?
10 Struttura del gene Gli esoni sono regioni di un gene che vanno a costituire il trascritto maturo (risultante dallo splicing) Gli introni sono le regioni di un gene che vengono trascritte, ma che successivamente vengono rimosse dal trascritto primario (pre-mrna) e non vanno a costituire il trascritto maturo (mrna) Le regioni non tradotte (UTR) sono le regioni del trascritto maturo (mrna) che non sono tradotte, a monte del codone ATG (5 UTR) e a valle del codone di stop (3 UTR)
11 Dall mrna (maturo) al DNA 5 3 AAAAAA In questo caso, dove vanno a cadere codone di start, di stop, CDS e UTR? 5 3 Esone1 Esone2 Esone3 3 5
12 Dall mrna (maturo) al DNA 5 3 AAAAAA In questo caso, dove vanno a cadere codone di start, di stop, CDS e UTR? ATG STOP!
13 Dall mrna (maturo) al DNA 5 3 AAAAAA Cosa succede se il trascri/o, invece di essere copia del filamento superiore (senso, o posicvo ) è copia del filamento inferiore (ancsenso, o negacvo )?
14 Dall mrna (maturo) al DNA 3 5 AAAAAA 5 3 Esone3 Esone2 Esone1 3 Basta... girarlo!!!!!!!!!!!!! Trascri/o e gene e numeri degli esoni devono essere sempre lew nello stesso senso, da 5 a 3! 5
15 Un gene umano semplice
16 Un gene umano più complicato... In questo caso, lo stesso gene produce 3 trascriw alternacvi
17 Un gene umano MOLTO complicato
18 Quanti geni (regioni trascritte che codificano per una proteina)? Osservando il risultato della mappatura dei trascritti sul genoma, è possibile contare in quanti geni si suddividono, nelle diverse specie: E.coli (4,7 milioni pb) geni S.cerevisiae (12 milioni pb) geni D.melanogaster (169 milioni pb) geni C.elegans (97 milioni pb) geni Uomo (3,2 miliardi pb) geni Topo (2,9 miliardi pb) geni D.rerio (zebrafish, 1,5 miliardi pb) geni A. thaliana (pianta, 120 milioni pb) geni Riso (488 milioni pb) geni
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20 Geni e sequenziamento Genoma Sequenziamento Trascrittoma e RNA-Seq Proteoma
21 Annotazione old-generation Mentre sequenziare un intero genoma è (relacvamente) semplice, lo è molto di meno sequenziare un intero trascri/oma, ovvero il corredo di tuw i trascriw sinteczzac dal genoma di una data specie L espressione (e in primo luogo, la trascrizione) dei geni dipende da diversi fa/ori, quali: Stadio di sviluppo o tessuto Risposta a scmoli Patologie Fa/ori diversi individuo- specifici Difficile o/enere ragionevole certezza di avere raggiunto un livello di copertura del trascri/oma adeguato, ovvero, di avere effewvamente sequenziato la quasi totalità dei possibili trascriw
22 Annotazione old-generation La completezza o meno di un annotazione dipende dalla disponibilità di trascriw Fino a pochi anni fa, le annotazioni venivano compiute a parcre dalle sequenze disponibili (es. database GenBank - NucleoCde NCBI) prodo/e da laboratori di tu/o il mondo Campionamento del trascri/oma biased, ovvero per i geni più studiac (es. TP53, DMD in uomo) erano disponibili molc più trascriw rispe/o a geni poco studiac o poco cara/erizzac Campionamento del trascri/oma biased a seconda della tecnica uclizzata per estrarre/isolare gli RNA (es. poly- A), Cpicamente isolac/sequenziac trascriw che codificano per una proteina (mrna) Campionamento del trascri/oma biased dai cosc necessari al sequenziamento (un trascri/o per gene può bastare?)
23 Annotazione next-generation Con l introduzione delle tecniche di sequenziamento de/e next- generacon sequencing la possibilità di sequenziare - a cosc relacvamente contenuc - interi genomi o trascri/omi è diventata accessibile anche a laboratori di dimensione/disponibilità economica piccolo/media Con RNA- Seq si intende l applicazione di un metodo di sequenziamento next- generacon al sequenziamento di un campione di RNA
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28 RNA (cdna) > 1000 bp Sanger sequencing (700 bp)
29 RNA (cdna) > 1000 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp 50 bp
30 RNA-Seq: single end e paired end Frammento RNA (cdna) Single end: viene sequenziata una delle due estremità (scelta a caso) Paired end: vengono sequenziate entrambe le estremità Direzionale: viene specificato quale dei due filamenti era l RNA originale, ovvero se è stato sequenziato l RNA o il suo complemento
31 RNA-Seq Retrotrascrizione in cdna Frammentazione Sequenziamento frammenc ( read ) Mappatura dei frammenc sulla sequenza genomica
32 mrna e RNA-Seq
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34 Campione di RNA Sequenziamento (RNA-Seq) Assemblaggio trascritti originali Confronto con annotazione genica già disponibile
35 Esone incluso RNA-Seq Esone NON incluso
36 RNA-Seq confronto con annotazione Esone NON incluso 5 3 In rosso: frammenti che mappati sul genoma si spezzano in due 5 3 Esone incluso
37 RNA-Seq: identificare nuovi trascritti alternativi confrontando con annotazione Mappando i read si sequenza sul genoma vanno a cadere in un introne tra due esoni già annotati E possibile si tratti di un esone che nessuno ha ancora visto A 5 3?? D A- D
38 RNA-Seq: identificare nuovi trascritti alternativi Mappando i read si sequenza sul genoma vanno a cadere in un introne tra due esoni già annotati E possibile si tratti di un esone che nessuno ha ancora visto 5 3 A GT AG GT AG
39 RNA-Seq: sequenze PAIRED- END 200 bp
40 RNA-Seq: sequenze PAIRED- END Più facile individuare nuovi esoni dal confronto con annotazioni già esistenti 5???? Novel exon 3
41 RNA-Seq: sequenze PAIRED- END 5???? 3
42 RNA-Seq e genomi Wang et. al., Nature 456(2008): tessuti umani 5 linee cellulari tumorali Trascritti cdna divisi in frammenti di 30 bp milioni di frammenti per tipo di cellula Circa 500 milioni di frammenti in tutto Scopo: verificare innanzitutto se si è perso qualche gene, e per I geni già annotati quanto e come è diffuso lo splicing alternativo
43 Asse x: numero di sequenze per gene Asse y: frazione di geni in cui è idencficato almeno un trascri/o alternacvo Frazione di geni con una isoforma minore (y) che appare nell (x)% dei trascritti del gene
44 La stessa cosa dimostrata 6 mesi prima.. usando sequenze di EST invece di sequenze RNA- Seq
45 Pervasive tissue-specific regulation of alternative mrna isoforms.
46 Morale... Il dogma iniziale: UN GENE UN TRASCRITTO UNA PROTEINA... è ora diventato.. UN GENE TANTI TRASCRITTI (POTENZIALMENTE) TANTE PROTEINE Potenzialmente, perché... non è assolutamente detto che tutti i trascritti prodotti da un gene siano necessariamente codificanti Lo splicing alternativo deve essere considerato una caratteristica normale dei geni eucariotici, piuttosto che un eccezione
47 Morale... (2) In origine gli RNA erano o Codificanti (mrna) e uno per gene Non codificanti, e coinvolti nella traduzione dei mrna (trna, rrna) In realtà, esistono centinaia di RNA non codificanti prodotti da un genoma (mirna, snorna, smallrna, lncrna) e così via, con svariate funzioni
48 Progetto ENCODE (ENCyclopedia of Dna Elements) 62% of the human genome is transcribed into sequences >200 bp long 5.5% of this is exon 31% is intergenic no annotated gene Remaining: intronic CAGE-seq: 62,403 TSS 44% within 100bp of the 5 end of a GENCODE gene Others: exons and 3 UTRs, significance unknown Lots of short ncrnas: trna, mirna, snrna etc.
49 ENCODE: quanti geni? GENCODE human reference gene set 20,687 Protein-coding 6.3 alternatively spliced transcripts on average (*= 3.9 protein isoforms on average Protein-coding exons: 1.22% of the genome Still more to come: unidentified peptides in massspec ci sono geni che mancano?!?!? 18,441 ncrna genes 8801 short ncrna (es. microrna) 9640 long nc RNA ( simili a mrna, ma non codificanti) 11,224 pseudogenes 863 transcribed
50 Espressione genica
51 Espressione genica Con il termine espressione genica si intende il processo attraverso cui l'informazione contenuta in un gene (costituita di DNA) viene convertita in una macromolecola funzionale (tipicamente una proteina) Sequenziando i trascritti possiamo sapere se/quando un gene viene trascritto E possibile quantificare il livello di espressione (o meglio, di trascritto ) di un gene?
52 RNA-Seq ed espressione genica Il pool di RNA (cdna) viene frammentato I frammenti da sequenziare vengono scelti a caso con probabilità uniforme (sono un sottoinsieme di tutti i frammenti) Più alto sarà il livello di un dato RNA nel pool, più alto sarà il numero di frammenti che produce, più alta sarà la probabilità di sequenziarlo!
53 RNA Sample Fragmented RNA Sample Sequenced reads
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55 RNA-Seq: riassumendo Con poche migliaia di euro e un po di manodopera bioinformatica è possibile Sequenziare un trascrittoma completo eucariotico, mrna, RNA non coding, piccoli RNA Annotare i geni sul rispettivo genoma, e/o integrare le annotazioni già esistenti Stimare il livello di trascritto di ciascun gene, separatamente per ogni trascritto alternativo Confrontare le variazioni di espressione (trascrizione) in condizioni diverse Applicate al sequenziamento di trascritti le tecnologie NGS hanno portato ad avanzamenti di enorme portata sia dal punto di vista della ricerca di base (come funziona un genoma?) sia da quello applicativo (cosa funziona diversamente, in caso di patologie come i tumori?)
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