Progetto ESPLORA. Le innovazioni di ESPLORA nel settore frutticolo ed arboricolo

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1 Progetto ESPLORA Le innovazioni di ESPLORA nel settore frutticolo ed arboricolo Ignazio Verde Centro di Ricerca per la Frutticoltura Roma 6 Novembre

2 Peculiarità specie arboree: Ciclo lungo Grandi dimensioni Strumenti disponibili: Genoma di riferimento (Tutte, tranne olivo) Tools genetici (microarray, chip SNP) Approcci utilizzati: Popolazioni biparentali Geni candidati Mappatura per associazione 05/12/2013 2

3 Attività svolta dall'u.o. Centro di Ricerca per la Viticoltura di Conegliano (CRA-VIT) 3 Ricerca di marcatori funzionali in vite per i caratteri apirenia e tolleranza a giallumi da fitoplasmi. Responsabile: Dr.ssa Manna Crespan 05/12/2013

4 4 Vite colpita da giallumi 05/12/2013

5 5 Allevamento ed infezione degli insetti vettori 05/12/2013

6 Strategia applicata 6 per l apirenia ricerca di SNP putativamente associati al carattere apirenia sequenziamento di 8 geni candidati MADS-box coinvolti nello sviluppo del gametofito femminile, dell'endosperma e dell'embrione e putativamente associati a QTL minori per l apirenia per la flavescenza dorata (FD) ricerca di geni candidati per la resistenza/tolleranza a FD analisi di Next Generation Sequencing (RNA-Seq) di varietà di vite sensibili (Chardonnay) vs tolleranti (Tocai friulano) in esperimenti di infezione controllata in laboratorio 05/12/2013

7 Risultati ottenuti 7 Per l apirenia Marcatori associati a uno dei geni MADS-box (VvAGL11) sono utili ma non sufficienti alla MAS. Altri MADS-box sequenziati in 48 vitigni e 48 individui di una popolazione da incrocio (varietà con semi x varietà apirena - F1_RVexSU); analisi dei dati in corso. Produzione dati SSR e SNP per costruire una mappa di associazione della F1_RVexSU in corso. Completata la fenotipizzazione della F1_RVexSU. 05/12/2013

8 8 Risultati ottenuti Per la resistenza/tolleranza ai giallumi Il complesso esperimento di inoculo del patogeno tramite vettore infetto in ambiente controllato è riuscito (12 tesi x 3 repliche biologiche). Le prime analisi dei dati di RNA-Seq mostrano una sovraespressione di geni legati ai meccanismi di difesa nella varietà tollerante. Prodotte 3 popolazioni da incrocio (varietà sensibile x tollerante a GY) per studiare le basi genetiche del carattere. L unione dei dati derivanti dai due approcci dovrebbe fornire indicazioni sui geni candidati e marcatori associati. 05/12/2013

9 Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale (CRA-PAV) Unità Operativa: Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale CRA-PAV Roma Responsabile scientifico: Graziella PASQUINI Sintomi di Legno Nero sulla varietà Chardonnay Titolo della Ricerca: Sviluppo di sistemi molecolari per la caratterizzazione genomica del fitoplasma Stolbur

10 10 OBIETTIVO: sviluppo di tools genetici per l individuazione di marcatori molecolari nel genoma di Stolbur Strategia 1: MLST (Multilocus Sequence Typing) (genoma patogeno) Strategia 2: Studio della interazione vite/stolbur (genoma pianta ospite) Prodotto atteso: markers molecolari

11 Strategia 1: MLST 203 campioni da diversi areali 2 genotipi tuf: tuf a tuf b RISULTATI: I geni più interessanti per la caratterizzazione del fitoplasma: tuf, secy e stamp Definizione di una precisa distribuzione geografica dei genotipi Sicilia: presenta monomorfismo genetico su tutti e tre i geni PRODOTTO: Genotipi definiti = markers genetici per tracciabilità delle infezioni studio evoluzionistico del fitoplasma 11

12 Strategia 2: Studio della interazione vite/stolbur RISULTATI: Individuate vie metaboliche differenzialmente espresse nei vari status infettivi. In particolare sono state evidenziate alterazioni di espressione nelle piante recovered potenzialmente utili nell induzione esterna del fenomeno (considerato un importante metodologia di controllo delle malattie da fitoplasmi) PRODOTTO: Geni di vie metaboliche differenzialmente espressi = markers genetici per diagnosi Studio meccanismi patogenetici Induzione status recovery 12

13 Partecipazioni a convegni e pubblicazioni CONVEGNI: F. Punelli, P. Uva, A. Ferrarini, L. Ferretti, G. Pasquini (2011) Validation of microarray expression profiles with Real Time-PCR and GO classes study in Stolbur-affected grapevine plants. 2 nd IPWG (International Phytoplasmologist Working Group) Meeting settembre 2011, Neustadt an der Wienstraβe, Germania). F. Punelli, P. Uva, A. Ferrarini, L. Ferretti, G. Pasquini (2011) Real Time-PCR validation of microarray expression profiles obtained in comparing healthy, recovered and Stolbur-affected grapevine plants. 2 nd European Bois Noir Workshop. 27 febbraio-1 marzo 2011, Castelbrando (TV). PUBBLICAZIONI: F. Punelli, F. Martinelli, P. Uva, L. Ferretti, G. Pasquini (2013) Elucidating transcriptomic responses to Stolbur phytoplasma in Vitis vinifera in relation to infected and recovered status. Plant Science (submitted). F. Punelli., P. Uva, A. Ferrarini, F. Faggioli, M. Barba, G. Pasquini (2010) Differential Gene Ontology Classes Expression in Grapevine Affected by Stolbur Phytoplasma. V Convegno Nazionale Fitoplasmi settembre 2010, Ancona - Petria 20(3): F. Punelli., F. Faggioli, P. Uva, A. Ferrarini, G. Pasquini (2010). Expression of gene clusters in grapevine cultivars affected by bois noir and several viruses. [extended abstract] 13 th Congress of the Mediterranean Phytopathological Union giugno 2010, CRA-PAV - Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Roma, S Petria 20(2):

14 Mappaggio di QTL di interesse agronomico e caratterizzazione del germoplasma di Fragola UO: CRA-FRF, Forlì Responsabile: Dr. Walther Faedi Partecipanti: Dr. Gianluca Baruzzi Dr.ssa Federica Brandi Dr.ssa Maria Luigia Maltoni 105 individui F 1

15 Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca Identificazione di associazioni tra marcatori molecolari e loci responsabili di caratteri di interesse agronomico in fragola ottoploide 1) Costruzione di una mappa di linkage su ottoploide 2) Fenotipizzazione per caratteri qualitativamente importanti (dolcezza e colore del frutto) 3) Avvio della genotipizzazione di germoplasma diploide e ottoploide utilizzando i marcatori già sviluppati e ampliamento della collezione di marcatori

16 Risultati raggiunti (1/2) Testati 89 SSR monodose, 58 sono risultati polimorfici e hanno prodotto da 2 a 8 amplificati con 14 configurazioni alleliche In generale F. chiloensis ha un profilo allelico molto più semplice F. chiloensis F. x ananassa Sono state caratterizzate numerose accessioni del germoplasma CRA-FRF Tipo di segregazione Segregazione attesa aaxab 1:1 4 aaxbn 1:1 1 abxaa 1:1 4 abxab 1:2:1 19 abxan 2:1:1 5 abxbn 1:1:2 5 anxab 2:1:1 5 anxbn 1:1:1:1 15 anxnn 1:1 105 bbxab 1:1 2 bnxab 1:1:2 8 bnxan 1:1:2 11 nnxan 1:1 92 anxan 3:1 108 Tot. Alleli 384 N di alleli per tipo di segregazione

17 b* (blu-giallo) Risultati raggiunti (2/2) Distribuzione in classi di residuo secco rifrattometrico Brix <7 Alba 7,4 Brix 7-8 8,1-9 9, , , ,1-13 F. chiloensis 11,1 Brix > F. chiloensis Alba Distribuzione della popolazione per coordinate colorimetriche del colore dei frutti a* (verde-rosso)

18 Impatto dell attività di ricerca Verrà resa disponibile una struttura di mappa ottoploide ottenuta con la popolazione Alba x F. chiloensis (frutto bianco) La disponibilità della mappa di linkage favorirà l individuazione di marcatori molecolari per applicare la MAS per caratteri di grande interesse commerciale come il colore e la dolcezza. Prospettive future E presumibile che la costruzione della mappa di linkage richieda l utilizzo di ulteriori marcatori. A questo scopo sono stati presi contatti per l utilizzo del chip Affymetrix Axiom su questa popolazione Ottenuto lo scheletro di mappa si vorrebbe proseguire con l inclusione dei caratteri semplici a ereditabilità mendeliana e, in seguito, con l analisi di caratteri ad ereditabilità quantitativa (QTL).

19 Centro di Ricerca per la Frutticoltura (CRA-FRU) Analisi della biodiversità in pesco tramite approcci di Association Mapping Ignazio Verde, Valeria Aramini, Sabrina Micali, Elisa Vendramin, Maria Teresa Dettori

20 Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca Individuazione di un set di circa 1000 SNP funzionali uniformemente distribuiti nel genoma Validazione di SNP tramite l analisi di un panel di 10 accessioni. Utilizzo degli SNP su un subset della collezione di pesco per l analisi della struttura della popolazione RIMODULAZIONE Utilizzo del chip IPSC 9K SNP array per valutare la struttura della popolazione di un subset di accessioni di pesco (412) appartenenti alla collezione (~1000) mantenuta al CRA-FRU Verde et al 2012 PLoS ONE 7(4): e35668.

21 Risultati ottenuti: Struttura della Popolazione N accessioni analizzate 412 SNP tot (chip 9K): 8144 SNP N % tot (8144 chip 9K) SNP polimorfici Structure: K saggiati da 1 a 6 Evanno Method 3 sottopopolazioni

22 Risultati ottenuti: Costruzione di una Core Collection Costruire una «Core Collection» (CC) significa estrarre dalla collezione completa un numero minimo di accessioni pur massimizzando il numero di alleli rappresentati(cioè la variabilità) 412 accessioni analizzate con il 9K Peach IPSC Array. Tramite il software Power Marker, 165 scelte a costituire la CC

23 Risultati ottenuti: fenotipizzazione della CC (elaborazione dati in corso) Fenotipizzazione delle 165 accessioni della CC Caratteri: Data di fioritura e maturazione e 9 caratteristiche relative alla qualità del frutto L analisi dei dati verrà effettuata con il programma Tassel al fine di individuare le regioni genomiche coinvolte nel controllo dei caratteri studiati e i marcatori SNP associati

24 Centro di Ricerca per l Agrumicoltura e le Colture Mediterranee (CRA-ACM) Fenotipizzazione e genotipizzazione di accessioni di arancio pigmentato. Sequenziamento di geni coinvolti nella biosintesi delle antocianine UO: CRA-ACM Responsabile: Giuseppe Reforgiato Recupero Partecipanti: Concetta Licciardello, Maria Patrizia Russo, Giuseppe Russo, Santo Recupero

25 Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca 1)Individuazione delle accessioni con caratteristiche fenotipiche differenziali nella collezione CRA-ACM, ricerca di polimorfismi SNP e loro verifica; 2)Individuazione di marcatori ed estensione dei risultati più significativi ottenuti a tutta la collezione di arance pigmentata del CRA-ACM; 3)Risequenziamento di alcuni mutanti somatici ed allineamento della sequenza con la sequenza del clementine dell International Citrus Genome Consortium (ICGC); 4)Genotipizzazione di alcuni mutanti indotti per irraggiamento con raggi g.

26 Risultati raggiunti (1/4) 1 Obiettivo: Individuazione delle accessioni con caratteristiche fenotipiche differenziali nella collezione CRA-ACM, ricerca di polimorfismi SNP e loro verifica Individuati bioinformaticamente tramite analisi EST migliaia di SNP teoricamente discriminanti tra arancio e clementine. 163 SNP validati con il metodo di genotipizzazione Kaspar su 50 diverse accessioni di arancio e clementine. Di questi, 37 sono stati validati anche mediante sequenziamento Sanger. L analisi di genotipizzazione ha individuato 78 siti polimorfici, di cui 36 eterozigoti. Le variazioni in termini di SNP sono state trovate soprattutto tra le specie, dimostrando una bassa diversità genetica in arancio e clementine e confermando una più elevata eterozigosità in arancio rispetto a clementine. Gli SNP derivanti dalle EST oggetto di studio, anche se non verranno utilizzati come marcatori molecolari (considerata la mancanza di associazione con caratteristiche agronomiche evidenti) potranno servire negli studi di filogenesi e come marcatori delle singole accessioni.

27 Risultati raggiunti (2/4) 2 Obiettivo Individuazione di marcatori ed estensione dei risultati più significativi ottenuti a tutta la collezione di arance pigmentate del CRA-ACM La regione 3 LTR che regola l espressione del gene Ruby (Myb Transcripion Factor coinvolto nella sintesi delle antocianine - Butelli et al., 2012) è stata utilizzata come marcatore della pigmentazione antocianica in frutti di arancio e suoi ibridi Genotipizzata una collezione di circa 100 accessioni di arancio pigmentato, arancio biondo e diversi ibridi. L amplificazione della 3 LTR ha confermato la presenza dell inserto nelle accessioni caratterizzate dalle antocianine nella polpa ed è quindi marcatore diagnostico del carattere L amplificazione della regione di Tcs1 (parte integrante del promotore/retrotrasposone) ha mostrato una presenza non costante dell inserto nei vari cloni di arancio Tarocco, Premio SIGA 2013

28 Risultati raggiunti (3/4) 3 Obiettivo: Risequenziamento di alcuni mutanti somatici ed allineamento della sequenza con quella del clementine (International Citrus Genome Consortium - ICGC) Risequenziate (in collaborazione con il prof. Morgante) 3 varietà di clementine (Caffin, precoce e apireno; Rubino, tardivo e apireno; Monreal, medio e con semi) su piattaforma Illumina. La disponibilità on-line del genoma del clementine aploide (http://www.phytozome.net/clementine.php) ha consentito le operazioni di allineamento dei genomi delle tre clementine con il riferimento. I primi dati hanno prodotto una copertura molto bassa, variabile tra 2.8x (Rubino) e 12x (Monreal). E stato avviato un nuovo risequenziamento, i cui dati di copertura sono decisamente migliori dei precedenti. Questo è presupposto per un analisi più approfondita da avviare in termini di individuazione di elementi trasponibili, delezioni, «depth of coverage» e «loss of heterozigosity.

29 Risultati raggiunti (4/4) 4 Obiettivo: Genotipizzazione di alcuni mutanti indotti per irraggiamento con raggi g Tre cicli di irraggiamento con raggi γ (2008, 2009 e 2010) del Tarocco Scirè D2062 hanno prodotto fenotipi mutanti. Sono state già osservate interessanti mutazioni a carico della forma del frutto e del contenuto di antocianine. Forma del frutto Pigmentazione Peduncolo e consistenza buccia La possibilità di un risequenziamento dei mutanti ottenuti, aggiunti ai dati di risequenziamento di 10 mutanti somatici naturali di arancio già a disposizione del CRA- ACM, potrebbe aiutare a comprendere meglio la base genetica dei caratteri fenotipici in questione. SOI 2013

30 Centro di Ricerca per l Olivicoltura di Rende (CRA-OLI) Sviluppo di nuovi tool genetici e molecolari a supporto del breeding in olivo Responsabile UO: Samanta Zelasco

31 Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca 1) Riordino del germoplasma olivicolo Attività Sviluppo di un metodo efficiente per l identificazione genetica in olivo 2) Individuazione e selezione di materiale genetico interessante a supporto del breeding Attività Selezione materiale genetico di interesse per la tolleranza al freddo Saggi di radicazione e valutazione di potenziali portinnesti nanizzanti

32 Ottenimento di tool molecolari Riordino del germoplasma olivicolo Sviluppo di un metodo efficiente per l identificazione genetica in olivo 300 Loci SSR N alleli individuati Sinonimie riscontrate altamente correlate con i dati morfologici Mission = Picholine Marocaine Ascolana dura = Ascolana semitenera Dolce d Andria = Termite di Bitetto Carpinetana = Bosana Moraiolo=Paesana Nera Leccino=Palmarola Tondina = Provenzale Giarfara=Tonda Dolce di Partanna Grossale = Santomauro DCA 3 13 DCA 8 17 DCA DCA DCA DCA EMO GAPU71B 9 Tot alleli 117

33 Struttura del database molecolare con i dati standardizzati (esempio) Loci SSR Autore collezione Posizione varietà sinonimie DCA3 DCA3 DCA 8 DCA8 Sarri et al., 2006 Baldoni al., 2009 Koehmstedt et al., 2011 et Beghe' et al., 2011 Bandelj al., 2002 et WOGB Arbequina nessuna WOGB Arbequina NCGR,Davis Dole 39 Arbequina CRA-OLI Slovenia Arbequina Arbequina Doveri2008 WOGB Arbequina nessuna nessuna nessuna nessuna nessuna Zelasco et al.,2013 NCGR Dole 39 Arbequina nessuna

34 Individuazione e selezione di materiale genetico interessante breeding Selezione materiale genetico per la tolleranza al freddo Culitvar Radicazione % Istituzione Provenienza a supporto del Degli 23.8 UNI-PR 5 campi collezione Emilia Romagna Montericco 26.3 UNI-PR Montelocco 33 UNI-PR 5 campi collezione Emilia Romagna 5 campi collezione Emilia Romagna Orbetana 24.1 Privato Campo sperimentale Aviano (PN) Leccino clone 18 Bartolini 57.5 UNI-PR 5 campi collezione Emilia Romagna Leccio del Corno nessuna CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS) Frantoio? ecotipo Privato Campo sperimentale Aviano (PN) Frantoio? ecotipo 2 37 Privato Campo sperimentale Aviano (PN) genotipo non noto 19.3 Privato Campo sperimentale Aviano (PN) Dolce Agogia (Par.Incr) 15 CNR-IGV-PG CNR-IGV-PG Ascolana tenera 11.5 CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS) Bianchera 11.8 CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS) Nostrana di brisighella 43.3 CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS) Nostrale di Rigali 6.8 CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS) Carolea CRA-OLI Campo Collezione Rende (CS) Coratina CRA-OLI Campo Collezione Rende (CS) Ghiacciolo CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS) Ortice 1.9 CRA-OLI Campo Collezione Mirto (CS)

35 Saggi di radicazione e valutazione di potenziali portinnesti nanizzanti Testate per la radicazione 49 varietà e 3 ecotipi spontanei Variazione nella % di radicazione Trattate con miscela di Ormoni Radicazione da 0 a 78% Non trattate da 0 a 60% Varietà /ecotipi potenzialmente interessanti Capena: 78 % trattata; 60% non trattata Ecotipo 110: 65% trattata 36 % non trattata Capena Presunto Oleastro

36 Valutazione del germoplasma di Populus nigra e ricerca di determinanti di resistenza all afide lanigero (Phloeomyzus passerinii). Unità di ricerca per le produzioni legnose fuori foresta (CRA-PLF). Carletti Giorgia, Carra Andrea, Gianni Allegro, Vietto Lorenzo, Calligari Paolo, Rossino Renzo, Nervo Giuseppe

37 Afide lanigero: Phloeomyzus passerinii Secrezione bianca dovuta alla presenza di colonie di afide lanigero del pioppo Piante di pioppo con evidente infestazione di afide lanigero 39

38 Obiettivi previsti dalla scheda di ricerca Identificazione e localizzazione del/dei Quantitative Trait Loci (QTL) associati alla resistenza all afide lanigero attuabile attraverso: Fenotipizzazione della progenie F1 derivante da incrocio interspecifico tra un parentale femminile di P. deltoides (resistente) ed un parentale maschile di P. nigra (suscettibile) ed analisi di segregazione per la resistenza all afide lanigero (Phloeomyzus passerinii). Sviluppo di una mappa genetica in pioppo utilizzando marcatori SSR (individuati tramite ricerca bioinformatica) e marcatori SNP (ottenuti attraverso tecniche NGS high-throughput)

39 N. Individui Risultati raggiunti (1/3) Valutazioni fenotipiche per la resistenza all afide lanigero in un vivaio di due anni = suscettibile 5 = resistente Classi Fenotipiche

40 Risultati raggiunti (2/3) Validazione di marcatori SSRs e sviluppo di una mappa preliminare partendo da 113 microsatelliti polimorfici e segreganti. P. nigra P. deltoides Pochissimi marcatori sono stati ancorati, sono quindi necessarie tecniche high-throughput per poter sviluppare una mappa di linkage in pioppo

41 Risultati raggiunti (3/3) Sono in corso le analisi genetiche di 8653 marcatori SNP polimorfici e segreganti nella popolazione ottenuti attraverso la tecnica RAPiD-Seq, basata su piattaforma Illumina, Genotyping by Sequencing (GBS). Da una prima analisi genetica i marcatori hanno una segregazione 3:1, 1:2:1, 1:1, come atteso. Prospettive A breve una mappa genetica di Populus nigra e Populus deltoides sarà disponibile. Correlando i dati di mappa e i rilievi fenotipici sarà possibile identificare i/il QTL responsabili/e della resistenza genetica all afide lanigero

42 Impatto dell attività di ricerca Considerando l importanza economica del genere Populus e gli ingenti danni colturali che l afide lanigero può provocare, lo sviluppo di una mappa genetica e la localizzazione dei QTL legati alla resistenza a tale patogeno risultano strategici per un efficiente conduzione dei programmi di breeding per il pioppo. Fino ad ora nessuna regione cromosomica portante la resistenza all afide lanigero è stata identificata ed è per questo che la ricerca svolta dal CRA-PLF è di notevole interesse scientifico ed economico

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