Trascrizione e maturazione degli RNA

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1 Trascrizione e maturazione degli RNA

2 Trascrizione e traduzione: espressione dell informazione genica

3 L RNA veicola l informazione genica contenuta nel DNA (nucleo) in modo che possa esprimersi per dare proteine (mrna) funzionare direttamente in attività correlate all espressione genica/sintesi proteica (trna e rrna) svolgere funzioni varie (ribozimi, small RNA, micro RNA, )

4 L RNA è sintetizzato a partire dal DNA nel processo della trascrizione Enzima coinvolto: RNA polimerasi DNA-dipendente; un tratto di filamento di DNA ( gene ) funziona da stampo Vengono incorporati nella catena di RNA nascente dei ribonucleosidi attivati in forma trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP) direzione 5 3 prima di niziare la trascrizione l RNA polimerasi riconosce e lega un sito del DNA: promotore

5 RNA polimerasi avanzando sul DNA inserisce ribonucleotidi complementari allo stampo (DNA ss) sulla catena nascente di RNA (direzione 5 3 ) La doppia elica DNA si riforma a valle della RNA polimerasi (regione ibrida RNA- DNA limitata a pochi nucleotidi) L RNA resta associato all enzima durante tutta la trascrizione

6 Nei batteri la RNA polimerasi è di un solo tipo ed è formata da varie subunità proteiche Il riconoscimento del promotore è mediato dalla subunità σ Il promotore presenta sequenze conservate (consenso) a 35 e -10 bp dal sito di inizio di trascrizione

7 Fasi della trascrizione procariotica Riconoscimento del promotore Inizio trascrizione ed allungamento Terminazione determinata da fattore ρ dissociazione dell enzima dallo stampo e dall mrna Nei batteri gli mrna possono essere policistronici: portano informazione per più polipeptidi (o rrna o trna) sullo stesso trascritto

8 La terminazione può essere indotta da strutture stem and loop che rallentano la RNA pol In alcuni casi terminazione indipendente da fattore rho

9 A volte l RNA pol ha bisogno di un attivatore per potersi legare al promotore

10 Maturazione dei trascritti procariotici mrna maturazione quasi assente traduzione contemporanea a trascrizione (solo in Archea fenomeni di splicing) trna e rrna maturazione mediante taglio di precursori

11 Negli eucarioti l apparato di trascrizione è + complesso 3 enzimi che riconoscono promotori diversi e sintetizzano classi diverse di RNA

12 RNA pol II è formata da un core (con attività polimerasica ) e da varie subunità che agiscono di concerto per riconoscere il promotore, legare il DNA e srotolarlo. Sul promotore viene riconosciuta in particolare la seq TATA box Altre sequenze a monte (anche 200 nt al 5 ) possono attivare o inibire la RNA pol mediante interazione con coattivatori o corepressori Altre sequenze ancora più a monte possono attivare/inibire trascrizone (enhancer)

13 Es: il coattivatore CBP induce la trascrizione di tutti i geni con seq attivatrice CREB ( camp responsive element) Trascrizione di geni controllata da livelli intracellulari di camp

14 Terminazione di trascrizione RNA pol II ed altri fattori tagliano l mrna a valle del sito di poliadenialzione rilascio dell mrna, degradazione del segmento di RNA 3 e dissociazione di RNA pol II dallo stampo

15 Maturazione dei trascritti eucariotici trascritto primario o pre-mrna (hnrna) Capping Metilazione Poliadenilazione Splicing Editing NUCLEO mrna maturo

16 La maturazione degli RNA è cotrascrizionale

17 Capping L aggiunta del CAP di metil guanosina (GMP) al 5 P dell mrna ne protegge l estremità evitando degradazione da parte di ribonucleasi e lo posiziona correttamente sul ribosoma durante traduzione

18 Poliadenilazione aggiunta di adenosine (AMP) al 3 OH dell mrna Stabilizza l RNAm La poliadenilazione avviene a valle di sequenza specifica riconosciuta da vari fattori, subito dopo il taglio che termina trascrizione

19 Splicing Rimozione di sequenze prive di significato (non codificanti) o «introni» e risaldatura degli esoni I componenti dello splicesoma riconoscono siti di giunzione esone/introne/esone Tagliano al 5 per dare struttura a cappio (lariat) Taglio al 3 dell introne eliminazione e risaldatura tra i 2 esoni Splicesoma= complesso di proteine e snrna snrnp: small nuclear ribonucleoprotein particle probabilmente ribozimi NB in alcuni casi si ha self-splicing introne è ribozima

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21 RNA Editing Cambiamento nella seq dell mrna a livello post-trascrizionale: aggiunta-delezione di nt o cambiamento di basi azotate (U C) Tipico di geni mitocondriali e di cloroplasti Richiede stampi di RNA guida (grna) originati da introni Es editing tessuto specifico del mrna per apoliporoteinab (ApoB)

22 Sunto dei vari step di maturazione di mrna eucariotico

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24 Durante maturazione da hnmrna ad mrna accorciamento

25 Solo gli mrna maturi lasciano il nucleo: selezione a livello del poro nucleare

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27 Maturazione degli rrna eucariotici rrna 28S, 18S, 5,8S derivano da singolo precursore trascritto da RNA pol I gene ripetuto in tandem centinaia di volte nella zona NOR zona fibrillare del nucleolo, attivamente trascritta in alcune fasi della vita cellulare rrna 5S invece trascritto da RNA pol III cluster di geni ripetuti fuori dal nucleolo e diverso precursore

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29 Maturazione del precursore di rrna 28S, 18S, 5,8S Modificazione di nucleotidi (metilazione e sostituzione di U con Ψ) mediata da snorna Associazione con proteine ribosomali eliminazione degli spaziatori intragenici

30 Maturazione dei trna eucariotici Trascritti da RNA pol III che riconosce promotore interno al gene (su tratto codificante) geni organizzati in cluster Precursori con geni singoli sono accorciati al 5 e 3, subiscono modificazione di basi ed eventuale splicing La maturazione dei pretrna coinvolge il ribozima RNasiP

31 CONCETTO DI GENE anni 40: esperimenti di Beadle & Tatum Si determina la relazione tra geni ed enzimi grazie a ricerche su alcuni ceppi della muffa del pane (NEUROSPORA ) definiti «mutanti nutrizionali». ALTERAZIONE DNA DIFETTO PROTEINA DIFETTO DI CRESCITA Un gene un enzima Un gene un polipeptide

32 Sono possibili varie definizione di gene!! 1) Il gene è una sequenza di DNA contenente l istruzione per la produzione di un polipeptide (fornisce cioè le istruzioni per la sintesi proteica) (questa definizione non tiene conto dei geni per trna, rrna, ribozimi e small RNA) 2) Il gene è un unità trascrizionale (questa definizione esclude le seq regolatrici e la possibilità che gene dia più prodotti mediante splicing e/o inizi/fine di trascrizione alternativi) 3) Gene: segmento di DNA contenente un informazione, non sempre univoca 4) Gene: unità ereditaria promotore e regioni regolative, tratto codificante, terminatore di trascrizione Elementi fondamentali di un gene: Negli eucarioti il tratto codificante è interrotto da introni!! genomi +ampi Nei procarioti + geni sono trascritti insieme ( mrna policistronici)

33 The sequence of a eukaryotic protein-coding gene is typically not colinear with the translated mrna; that is, the transcript of the gene is a molecule that must be processed to remove extra sequences (introns) before it is translated into the polypeptide. The sequence of a prokaryotic proteincoding gene is colinear with the translated mrna; that is, the transcript of the gene is the molecule that is translated into the polypeptide.

34 Il codice genetico stabilisce la corrispondenza tra seq nucleotidica (DNA RNA) e seq. aminoacidica (proteine) Il codice si basa triplette di basi: CODONI le istruzioni che specificano la sequenza di amminoacidi di un polipeptide sono scritte nel DNA (e sull mrna) come codoni 64 combinazioni possibili vs 20aa Il codice genetico è universale! Quasi tutti gli organismi (dai batteri alle piante agli animali) condividono lo stesso codice genetico. Piccole differenze solo per geni mitocondriali e per alcuni protozoi, funghi Prima base azotata U C A G UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG Seconda base azotata U C A G Phe Leu Leu Ile Met o inizio Val UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACC GCU GCC GCA GCG Ser Pro Thr Ala UAU UAC UAA Stop UAG Stop CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Tyr His Gln Asn Lys Asp Glu UGU UGC UGA Stop UGG Trp CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Cys Arg Ser Arg Gly U C A G U C A G U C A G U C A G Terza base azotata

35 Gli esperimenti di Brenner e Crick su fagi mutanti hanno definito le proprietà principali del codice genetico Basato su triplette di basi (perché inserzioni/delezioni multiple di 3 generalm. non alterano/compromettono significato genico) Non sovrapposto (perché mutazioni di singoli nt cambiano significato di un solo aa) Continuo senza virgole (perché mutazioni per inserzione/delezione di basi provocano slittamento della fase di lettura a valle del sito mutato) Degenerato: con più codoni codificanti per lo stesso aa, ma non ambiguo in q. ad ogni codone corrisponde un solo aa (altrimenti nel tratto mutato i codoni di stop sarebbero molto frequenti) degenerazione evidente sulla terza base

36 Il codice è stato decifrato grazie ad esperimenti di sintesi proteica in vitro usando come stampo RNA sintetici a sequenza nota Il messaggio sull mrna è letto in direzione 5 3 il polipeptide è sintetizzato in direzione NH 2 COOH (esp di Dintzis)

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38 Il codice genetico mette in relazione seq nucleotidica con seq amminoacidica Questo codice molecolare consente di decifrare/tradurre in sequenza aminoacidica l informazione genetica del DNA Filamento da trascrivere DNA T A C T T C A A A A T C A T G A A G T T T T A G Trascrizione 5 3 mrna A U G A A G U U U U A G Codone di inizio Traduzione Codone di arresto Polipeptide Met Lys Phe NH 2 COOH

39 La traduzione: trasferimento dell informazione genetica dall RNA alle proteine Il messaggio sull mrna è tradotto in sequenza amminoacidica avviene nel citoplasma sui ribosomi (gli organuli che coordinano le operazioni necessarie per passare dalle sequenze nucleotidiche alle catene polipeptidiche).

40 L apparato di traduzione comprende ribosomi e trna che interagiscono con l mrna per tradurlo in polipeptide

41 I ribosomi sono complessi formati da rrna e proteine: rrna componente strutturale e catalitica più importante Ricerche recenti indicano che gli rrna hanno attività catalitica (ribozimi) 70S 80S

42 Le subunità ribosomali si pre-assemblano nella regione granulare del nucleolo Le subunità magg e min si associano solo durante sintesi proteica Nobel 2009 Chimica a scienziati che hanno studiato la struttura 3D dei ribosomi applicazioni quali disegno di nuovi antibiotici

43 Nobel 2009 Chimica a scienziati che hanno studiato la struttura 3D dei ribosomi applicazioni quali disegno di nuovi antibiotici

44 Il ribosoma ha 4 siti di legame per RNA : 3 per trna (E,P, A) e 1 per mrna Le due subunità associandosi formano un tunnel nel quale scorre l mrna in traduzione (direzione 5-3 ) La subunità maggiore ha attività peptidil-trasferasica (forma legami peptidici tra aa portati dai trna) dovuta ad rrna23s Subunità minore offre piattaforma di appaiamento tra trna e mrna

45 trna È un «adattatore»: lega da un lato l aa (3 OH) dall altro il codone sull mrna (anticodone) 2 regioni cruciali Si ripiega su se stesso e ha 4 regioni di appaiamento interno (doppia elica) Struttura simbolica a trifoglio Struttura 3D ad L

46 Il trna interagisce con il messaggero a livello del suo anticodone che si appaia con il codone complementare sul mrna La terza base dell anticodone è spesso vacillante (wobble) in q puo non essere determinante/stringente per l appaiamento sul codone

47 Vacillamento: la terza base dell anticodone (al 5 ) si può appaiare con più di un nucleotide 2 codoni (mrna) diversi solo per terza base e specificanti stesso aminoacido possono usare/essere riconosciuti dallo stesso trna stesso aa inserito

48 Enzima aminoacil-trna sintetasi lega specifico aa al 3 OH del sito accettore sul trna corrispondente (la reazione consuma ATP) Di regola esistono almeno 20 enzimi (1 per aa), ma numero varia tra le specie Ridondanza del codice wooble: stesso trna (aa) riconosce vari codoni più trna (anticodoni) per stesso aa

49 L enzima aatrna sintetasi riconosce il trna grazie a seq nt specifiche sul trna

50 Le 3 fasi della traduzione Inizio: riconoscimento del codone di inizio ed assemblaggio componenti (ribosoma, trna e mrna) Elongazione: sintesi della catena polipeptidica e scorrimento del ribosoma sull mrna Terminazione: codone di stop e dissociazione tra mrna, ribosoma e polipeptide

51 Inizio traduzione nei procarioti IF si legano a subunità minore Legame di trna iniziatore (formil-met) mrna si posiziona su subunità minore grazia appaiamento tra seq Shine-Dalgarno e rrna 16S Idrolisi di GTP e associazione di subunità maggiore in eucarioti altri IF legano subunità minore; riconoscimento del 5 su mrna grazie a CAP e scorrimento verso 3 fino a primo AUG

52 Un aatrna entra in A e si forma il primo legame peptidico (attività peptidil transferasi di subunità maggiore)

53 Elongazione in 4 step: 1) un nuovo aatrna (scortato da Eftu) si posiziona in A grazie a riconoscimento codone-anticodone;2) la catena polipeptidica in P (C terminale) si lega all aa del trna in A; 3) subunità maggiore scivola ; 3) subunità minore scivola avanti (vs 3 ) di un codone e si libera A il trna scarico passa in E si dissocia Il ciclo di elongazione si ripete più volte per inserire altrettanti aa

54 Terminazione Il codone nonsenso (stop) è riconosciuto da fattori di rilascio La catena polipeptidica si stacca dal trna liberando stremità C; subunità ribosomali si dissociano Consumo di GTP

55 Lo stesso mrna viene letto contemporaneamente da più ribosomi che scorrono verso il 3 poliribosoma

56 Le cellule hanno sistema di sorveglianza che degrada mrna prodotti da geni con mutazioni non senso premature Il complesso EJC resta associato all mrna fino a suo I ciclo di traduzione Se questa si interrompe prematuramente (mutazione nonsenso:stop) EJC resta attaccato a mrna segnale di degradazione dell mrna

57 Nei procarioti trascrizione e traduzione sono contemporanee e avvengono in contiguità spaziale In eucarioti trascrizione e traduzione sono fasi distinte temporalmente e spazialmente

58 Differenze nella traduzione eucariotica Nella fase di inizio il posizionamento sul mrna si basa sul cap e meccanismo di scansione dell mrna fino a trovare il primo AUG (all interno della seq Kozak) Molti + fattori di inizio coinvolti mrna monocistronici vs mrna policistronici tipici di batteri

59 Le differenze nel processo di traduzione eucariotica e procariotica sono alla base dell uso di farmaci antibatterici selettivi Molti antibiotici funzionano come inibitori della sintesi proteica batterica (di origine fungina, perché i funghi occupano stesse nicchie ecologiche dei batteri e competono con questi)

60 Ripiegamento, maturazione e traffico delle proteine Prima di svolgere la sua funzione biologica il polipeptide deve ripiegarsi correttamente e, a volte, subire modificazioni chimiche specifiche (legame cofattori, acetilazione, metilazione, glicosilazione, fosforilazione, aggiunta di lipidi, associazione subunità).

61 Il ripiegamento/folding proteico può essere assistito da altre proteine chaperon Molti chaperon altamente conservati tra procarioti ed eucarioti si attivano in condizioni di shock termico (HSP)

62 Alcune patologie neurodegenerative derivano da ripiegamento proteico difettoso Es Alzheimer, Parkinson, derivano da accumulo di fibrille amiloidi (depositi di proteine insolubili malripiegate) morte neuroni Hungtington disease: aggregati proteici di proteina misfolded a causa di mutazione genica

63 Malattia da prioni: neurodegenerazione dovuta ad accumulo di proteina PrP malripiegata Nella encefalopatia spongiforme le proteine PrP malripiegate assunte con l alimentazione inducono alterazione strutturale delle PrP endogene in una reazione a catena Unico caso noto di agente infettivo di natura proteica