XIII CORSO RESIDENZIALE DALLA DIAGNOSI PRENATALE ALLA TERAPIA POSTNATALE NEFROLOGIA, DIAGNOSI PRENATALE NON INVASIVA, GENOMICA

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1 XIII CORSO RESIDENZIALE DALLA DIAGNOSI PRENATALE ALLA TERAPIA POSTNATALE NEFROLOGIA, DIAGNOSI PRENATALE NON INVASIVA, GENOICA Carrara ottobre 2014 Sindrome di Alport Alessandra Renieri U.O. Genetica edica, Università di Siena

2 ASHG American Society of Human Genetics ASHG 1995 Oct, inneapolis

3 ASHG American Society of Human Genetics Renieri A. Bruttini, Galli L, Neri, T..De archi. utation scanning of the entire COL4A5 coding sequence in Alport syndrome and genotype phenotype correlation. ASHG 1995 Oct, inneapolis encarelli A., Hedet L, Storey H, van Geel Renieri A. Digenic inheritance in Alport syndrome.

4 24 anni di attività consulenze genetiche in oltre 500 famiglie arrivo sangue e dati di altre 500 famiglie oltre 1000 famiglie per un totale di individui

5 BiobancaGenetica di Siena BiobancaAlport campioni di DNA 261 campioni di sangue RD-Connect: GBS GeneticBiobank of Siena 213 campioni di plasma 45 linee cellulari Cell linesand DNA bankof Rett syndrome, X-linkedmental retardationand othergeneticdiseases Cell linesand DNA bankof hereditarycancers

6 Registro Italiano Sindrome di Alport Scientificboarddel Registro Ghiggeri arco Nefrologia Ist Gaslini Genova Giani arisa Nefrologia Policlinico ilano assella Laura Ospedale Bambino Gesù Roma anno Carlo Nefrologia Bari La anna Angela Pediatria Sec Univ di Napoli Pecoraro Carimine Nefrologia A.O.Santobono Napoli Pennesi arco Pediatria Trieste Peruzzi Licia, Nefrologia, Ospedale InfR Torino oltre 1000 famiglie

7 Sindrome di Alport (ATS) Nefropatia ereditaria progressiva eterogenea dal punto vista clinico e genetico

8 Collagene alfa eterotrimero 4. Network del Collagene Componente essenziale della embrana Basale Glomerulare matura Prodotto esclusivamente dai podociti

9 Tipi di eredità monogenica nella ATS legata al cromosoma X - COL4A5 autosomica recessiva -COL4A3 e COL4A4 autosomica dominante - COL4A3 e COL4A4 Gubler C (2008) Inherited diseases of the glomerular basement membrane Nat Clin Pract Nephrol 4: 24 37, 2007

10 Alport X-legata 65% COL4A5 I 64aa IRC lieve icroematuria intermittente II III ESRD a 22aa ipoacusia ESRD a 18aa ipoacusia ESRD a 33aa ipoacusia

11 Alport Autosomica Recessiva 4% 3209insA w 3386del27 w 43 y icrohematuria acrohematuria Creatininemia 0,9 mg% w w 3209insA 3386del insA 3386del27 17 y icrohematuria macrohematuria CRF (creatininemia 2 mg%) Bilateral mixed hearing loss Delayed groh COL4A3 9 y icrohematuria macrohematuria Creatinininemia 0,4 mg% Longo I, et al. Nephrol Dial Transplant 2006;21(3):

12 Alport Autosomica Dominante 30% 67 y icrohematuria-proteinuria CRF (creatininemia 1,4mg%) Bilateral neurosensory hearing loss 88 y death Dialysis since the age of 84 Bilateral neurosensory hearing loss 54 y CRF w G1045V y icrohematuria COL4A3 w G1045V Pescucci C, et al. Kidney Int. 2004;65(5):

13 Test Genetico con Sequenziamento Tradizionale Fino a Settembre 2010 Clinical evaluation X-linked Autosomal COL4A5 COL4A3 COL4A4 DHPLC LPA DHPLC DHPLC Sequencing Sequencing Sequencing Analizzato un gene alla volta = Tempo risposta 12 mesi

14 Test Genetico con Sequenziamento massivo parallelo da Ottobre2010 COL4A5 COL4A4 COL4A3 Tutti e 3 i geni analizzati insieme = Tempo risposta 15 gg!!

15 Sequenziamento massivo parallelo

16 Sequenziamento massivo parallelo

17 Sequenziamento assivo Parallelo COL4A4 COL4A5 COL4A3 c g>t COL4A3 COL4A4 c.1553g>a

18 Famiglia 1 45 y icrohematuria 7 y icrohematuria acrohematuria since 4y p.gly518glu forma digenica c g>t

19 Famiglia 2 e 3 Famiglia 3 2 Famiglia y Preemptive renal transplantation 2 1 I I:1 2 I: y CRF SNHL I icrohaematuria II I:1 2 II:1 1 I:2 icrohaematuria 36 y icrohaematuria II 2 II:1 28 y Haematuria II:2 23 y Intermittent haematuria 1 2 II:3 20 y Intermittent haematuria 1 = COL4A4 p.gly1151ala 2 = COL4A3 p.gly300arg 1 = COL4A4 p.cys1566trpfs*37 2 = COL4A3 p.gly520arg

20 Ipotesi: Ereditarietà Digenica L eterogeneità clinica nella ATS è dovuta a varianti polimorfiche con effetto modificatore??? European collaborative study 12 Famiglie con Ereditarietà Digenica COL4A5 + 4 mutations COL4A4 12 mutations + 8 COL4A3 mutations

21 Eredità digenica autosomica con mutazioni concatenate in trans 60 y ESRD 55 y CRF SNHL 28 y icrohematuria rischio di ricorrenza come autosomica recessiva = 25% COL4A4 p.cys1566trpfs*37 COL4A3 p.gly520arg

22 Eredità digenica autosomica con mutazioni concatenate in cis rischio di 40 y ricorrenza CRF at come 20 autosomica dominante = 50% 40 y ESRD 32 y intermittent hematuria 45 y hematuria proteinuria CRF, SNHL COL4A4 p.ser969x COL4A3 p.cys1665tyr COL4A4 del ex1-4 COL4A3 del ex1

23 Eredità digenica mista autosomicae X-legata 54 y ESRD at y Hematuria rischio di ricorrenza complesso da valutare caso per caso 69 y icrohematuria 45 y Hematuria proteinuria SNHL COL4A4 c g>t COL4A5 p.gly953val COL4A4 Gly692Val COL4A5 Gly644Asp

24 Eredità triallelica Hematuria Proteinuria ESRD Hematuria Hematuria Hematuria Hematuria Hematuria Proteinuria rischio di ricorrenza complesso da valutare caso per caso COL4A4 c g>t COL4A4 p.pro1587arg COL4A5 p.gly684val

25 Combinazioni di tripla elica con collagene alfa mutato Normale Doppio Eterozigote 1 1 Eterozigote 50% delle molecole di tripla elica sono difettose 75% delle molecole di tripla elica sono difettose Omozigote 2 100% delle molecole di tripla elica sono difettose

26 La forma digenica ha gravità intermedia tra la dominate e la recessiva Inheritance AD DI AR % triple helix disrupted ESRD age 56 y y 31 y

27 sommario 1 Abbiamo dimostrato per la prima volta Ederità Digenica nella sindrome di Alport

28 sommario 2 Eredità digenica autosomica con mutazion concatenate in trans ha RR come la forma recessiva ma è più lieve? 25% Eredità digenica autosomica con mutazioni concatenate in cis ha RR come la forma dominate ma è più grave? 50%

29 sommario 3 Ereditò digenica non concatenata mista autosomica/xl X A X? 0 ---> 50% A Eredità triallelica X A X A? 0 ---> 50%; età di questi fenotipo grave

30 sommario 4 Alport digenico ha gravità intermedia rispetto a dominate e recessivo L analisi di tutti e 3 i geni insieme in un pannello next gen è fortemente raccomandato per stabilire il corretto rischio di ricorrrenza e la corretta prognosi

31 DIAGNOSI PRENATALE 1. Amniocentesi 2. Villocentesi 3. NIPT (Non invasive prenatal test) presenza del cffdna nel plasma materno; concentrazione progressiva: da 3,4 % al 6,2%; origine: 1. Placentare; 2. Cellule fetali; 3. Diffusione passiva.

32 Estrazione DNA da plasma donne in gravidanza Plasma

33 NextGeneration Sequencing CC TT CT c.1721 C>T (p.p574l) nell esone 25 di COL4A3

34 Reference Variante Esone Variante dopo mappatura Patogenicità Ref. DNA madre (%) DNA padre (%) COL4A C>T 25 c.1721c>t p.p574l polimorfismo Slajpah* 100 (46) 0 (41) adre Padre

35 Reference Variant3 Esone Variante dopo mappatura Patogenicità Ref. DNA da plasma F (%) DNA da plasma R (%) COL4A C>T 25 c.1721c>t p.p574l polimorfismo Slajpah* 95,5 (222) 91,95 (87) 94,5% allele T 5,5 % allele C cffdna

36 ATS e terapia cellulare feto affetto feto sano Dic 2013 Feto con mutazione COL4A5 Cellule del liquido amniotico Feb 2014 Feto con mutazione COL4A4 Impossibile visualizzare l'immagine. La memoria del computer potrebbe essere insufficiente per aprire l'immagine oppure l'immagine potrebbe essere danneggiata. Riavviare il computer e aprire di nuovo il file. Se viene visualizzata di nuovo la x rossa, potrebbe essere necessario eliminare l'immagine e inserirla di nuovo. Sorting Impossibile visualizzare l'immagine. La memoria del computer potrebbe essere insufficiente per aprire l'immagine oppure l'immagine potrebbe essere danneggiata. Riavviare il computer e aprire di nuovo il file. Se viene visualizzata di nuovo la x rossa, potrebbe essere necessario eliminare l'immagine e inserirla di nuovo. AKSCs Differenziazione in podociti Presursori renali AKSCs

37 ATS e terapia cellulare Affected podocyte Control podocyte Comparison RNASeq Immunofluorescence & western analysis RNASeq Immunofluorescence & western analysis Data analysis

38 Cellule staminali dal liquido amniotico Cell culture Cellule staminali del liquido amniotico Exome Sequencing GBS GeneticBiobankof Siena 10 controls Exome Sequencing II

39 Ringraziamenti Donazionein favoredi Grazianoand arco Laurini Banca di DNA e linee cellulari da pazienti con syndrome di Rett, ritardo mentale X-linked e altre malattie genetiche nell ambito del Telethon Network of Genetic Biobanks

40 Genetica edica Siena

41 Ereditarietà Digenica utazioni Patogenetiche COL4A3 NPHS2 COL4A3 COL4A4 COL4A5 COL4A3 Clinical revaluation COL4A3 Segregation analisys

42 Variazioni Polimorfiche COL4A3 4 COL4A4 1 c.2996g>a p.gly999glu COL4A4 c.1634g>c p.gly545ala COL4A5 1 COL4A3 2 COL4A5 + COL4A3 1 AF 0.007/16 AF /57 Varianti Funzionali?