SCHEDA DI PROGETTO (MODELLO A) 4. Tipo di progetto Bando Affidamento diretto Sportello 1 2 X

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1 SCHEDA DI PROGETTO (MODELLO A) 1. Tematica/ Filiera Emergenze fitosanitarie 2. Titolo Interventi di coordinamento ed implementazione alle azioni di ricerca, lotta e difesa al cancro batterico dell'actinidia (Psa) 3. Acronimo INTERACT 4. Tipo di progetto Bando Affidamento diretto Sportello 1 2 X 3 5. Durata (mesi) Importo ( ) Costo totale Costo congruo 4 Finanziamento richiesto Finanziamento 5 concesso Coordinatore di progetto Nome e Cognome Qualifica Istituzione di appartenenza Guido Cipriani Direttore del Centro di Ricerca per la frutticoltura Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura (CRA) Indirizzo Via Fioranello Roma Tel/fax / Istituzione proponente Denominazione: Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura Indirizzo: Via Nazionale Roma Tel.:, Fax:, Enti pubblici: IBAN0 ABI CAB BIC N. di conto di contabilità speciale aperto presso la Tesoreria centrale e provinciale dello Stato ai sensi della legge , N. 720 di "Istituzione del sistema di Tesoreria unica per Enti ed Organismi pubblici". Enti privati: IBAN ABI CAB BIC

2 9. Curriculum 6 del coordinatore e pubblicazioni significative (max ½ pag) Dr GUIDO CIPRIANI Personal details and references Nationality: Italian Place and date of birth: Cividale del Friuli (UD) Education 1987 Degree in Agricultural Science, University of Udine Professional activity PhD student at University of Udine, Fac. Agriculture PhD student at University of Auckland (NZ), Faculty of Biology, 8 months technician at Faculty of Agriculture University of Udine 1997 Visiting scientist at HortResearch, Auckland (NZ), 3 months 2000 present Senior scientist at University of Udine, Faculty of Agriculture Visiting scientist at HortResearch, Auckland (NZ), 4 months, OECD fellowship 2000 present lecturer at Faculty of Agriculture, University of Udine 2010 Head of the Fruit Tree Research Centre Agricultural Research Council - Rome 2010 Honorary Fellow of Plant and Food Research Auckland (NZ) Area of activity / line of research Analysis of plant genomes, high throughput genotyping of fruit crops, development of maps and molecular markers, applied marker assistant selection, functional genomics studies, plant breeding of Actinidia, Vitis and Malus, phylogeny of Actinidia and Vitis, disease resistances, functional mapping in Fragaria. Participation in research projects Il miglioramento della qualità dei frutti di fragola, melo, pesco-nettarina nella filiera produttiva: Fondo Interventi Strategici per la ricerca FISR D.M. 10/5/2000 in G.U. 195 del 22/8/2000 Individuazione di sequenze EST (Expressed Sequence Tags) potenzialmente utili per lo sviluppo di marcatori molecolari associati alle caratteristiche qualitative e per la determinazione del profilo metabolico dei carboidrati in frutti di pesco Programmi di ricerca scientifica di rilevante interesse nazionale PRIN 2002 Metabolismo e percezione degli zuccheri in frutti di pesco e vite: studio dei fattori di regolazione Programmi di ricerca scientifica di rilevante interesse nazionale PRIN 2003 ( Mappa di associazione genomico-funzionale basata su marcatori microsatelliti in Fragaria vesca L. Programmi di ricerca scientifica di rilevante interesse nazionale PRIN 2006 Miglioramento Genetico del Ciliegio dolce (Prunus avium) per ambienti del Centro-Sud Italia Progetto Mipaaf Biodati Miglioramento genetico dell actinidia per la costituzione di nuove varietà commerciali e per l individuazione di fonti di resistenza o tolleranza allo Pseudomonas syringae pv. Actinidiae Progetto Mipaaf Biodati Miglioramento genetico del pesco e delle nettarine per caratteri pomologici, tipici o differenziati e di elevate qualità nutraceutiche Progetto Mipaaf Biodati Liste varietali pesco e albicocco Progetto Mipaaf - Convar Selected publications Cipriani G., Morgante M Evidence of chloroplast DNA variation in the genus Actinidia revealed by restriction analysis of PCR-amplified fragments. J. Genet & Breed. 47: Testolin R., Cipriani G., Costa G Estimate of variance and heritability of characters in kiwifruit (Actinidia deliciosa). Acta Horticoltureae, 403: Cipriani G., Testolin R., Morgante M Paternal inheritance of plastids in interspecific hybrids of the genus Actinidia revealed by PCR-amplified cholroplast DNA fragments. Molecular and General Genetics, 247: Testolin R., Cipriani G., Costa G Sex segregation ratio and gender expression in the genus Actinidia. Sexual Plant Reproduction, 8: Cipriani G., Di Bella R., Testolin R Screening RAPD primers for molecular taxonomy and cultivar fingerprinting in the genus Actinidia. Euphytica 90: Atkinson R.G., Cipriani G., Whittaker D.J., Gardner R.C The allopolyploid origin of kiwifruit (Actinidia deliciosa). Plant Systematics and Evolution 205: Testolin R., Cipriani G., Gottardo L., Costa G Selection and evaluation of late flowering pollinizers in Actinidia deliciosa. Acta Horticolturae 444 Vol 1: Testolin R., Cipriani G Paternal inheritance of chloroplast DNA and maternal inheritance of mitochondrial DNA in the genus Actinidia. Theor Appl Genet 94: Cipriani G., Testolin R., Gardner R.C Restriction site variation of PCR-amplified chloroplast DNA regions and its implication in the evolution and taxonomy of Actinidia. Theor Appl Genet 96: Huang W-G., Cipriani G., Morgante M., Testolin R Microsatellite DNA in Actinidia chinensis: isolation, characterisation, and homology in related species. Theor Appl Genet 97: Testolin R., Huang WG., Lain O., Messina R., Vecchione A., Cipriani G A kiwifruit (Actinidia spp.) linkage map based on microsatellites and integrated with AFLP markers. Theor Appl Genet 103: Li Z.-Z., Kang M., Huang H.-W., Testolin R., Jiang Z.-W., Li J.-Q., Wang Y., Cipriani G Phylogenetic relationships in Actinidia as revealed by nuclear DNA genetic markers and cytoplasmic DNA sequenze analysis. Acta Horticolturae 753: Cipriani G., Testolin R Jintao : a chinese kiwifruit selection grown in Italy. Acta Horticolturae 753:

3 Parole chiave Kiwi, Pseudomonas syringae pv actinidiae, catasto di produzione, indennizzi 10. Descrizione del progetto Sintesi del progetto 7 (abstract max. 1/2pag) Da alcuni anni è comparsa una nuova fisiopatia provocata da un batterio che attacca l actinidia. La massima virulenza appare sulle varietà di frutto a polpa gialla, appartenenti tutte alla specie Actinidia chinensis; a questa specie appartengono anche genotipi con frutto a polpa verde ma non sono attualmente commercializzati. Il classico frutto, noto a tutti, a polpa verde, appartiene alla varietà Hayward, che è la più estesamente coltivata al mondo e appartiene alla specie A. deliciosa. Anche Hayward e altre varietà della stessa specie appaiono suscettibili alla batteriosi anche se in forma meno grave. L agente eziologico che provoca la malattia è stato individuato nel batterio Pseudomonas syringeae pv. Actinidieae. In anni recenti una forma particolarmente virulenta si è diffusa in Italia a partire dalla provincia di Latina per poi diffondersi in tutte le aree actinidicole più importanti del paese. Il progetto prevede il monitoraggio della diffusione della malattia con la creazione di una database sotto forma di catasto dei frutteti e un sito web consultabile liberamente. Dal punto di vista tecnico si prevedono una serie di azioni articolate volte allo studio del germoplasma presente in Italia per valutarne il grado di suscettibilità, lo studio del batterio, con il sequenziamento di diverse razze, la messa a punto di strumenti diagnostici e lo studio delle modalità di diffusione del patogeno. Sono inoltre previste delle analisi volte a comprendere le modalità di attacco del batterio e le interazioni tra ospite e patogeno. Sarano quindi messe a punto tecniche di prevenzione e profilassi utilizzabili entro la fine el progetto a parte degli operatori agricoli Inquadramento del progetto negli obiettivi della programmazione del settore (max 1 pagina) 8 L'actinidia è una delle ultime scoperte vere della frutticoltura mondiale. La specie non è ancora molto diffusa, ma è destinata a diventare una delle specie importanti nel panorama frutticolo delle regioni temperate di tutto il mondo. Le maggiori coltivazioni sono concentrate in Cina, dove recentemente sono stati fatti numerosi nuovo impianti e nei paesi della UE, dove si producono circa 0.5 Mt (Italia 0.36, Francia 0.04, Spagna, Grecia, Portogallo). Il terzo polo di produzione è rappresentato dalla Nuova Zelanda, patria di adozione della specie con 0.3 Mt di prodotto. Il kiwi, nelle due specie Actinidia deliciosa con frutto a polpa verde, ed Actinidia chinensis con frutto a polpa gialla e dal sapore più dolce, è una realtà di primaria importanza della nostra agricoltura. Attualmente in Italia la coltura di actinidia si estende su circa ettari: con quasi tonnellate, rispetto a 1.6 milioni di tonnellate prodotte annualmente in tutto il mondo, l'italia è il secondo paese produttore mondiale (superato di poco dalla Cina) e il secondo paese esportatore (dopo la Nuova Zelanda). La produzione di actinidia rappresenta il 6% circa della superficie frutticola nazionale e il 9% del fatturato totale: il valore agricolo della produzione supera i 3 miliardi di euro, e quello del mercato al dettaglio si aggira intorno ai 10 miliardi di euro. Oltre l'80% della produzione di kiwi è concentrata in quattro regioni (Lazio 32%, Piemonte 21%, Emilia Romagna 15%, Veneto 13%) nelle quali rappresenta un'economia di assoluto rilievo, sul piano agricolo e dell'indotto territoriale. Negli anni recenti, la comparsa e sviluppo epidemico, in Italia e nelle altre aree del mondo, del cancro batterico del kiwi malattia causata dal batterio Pseudomonas syringae pv actinidiae (Psa), ha messo in ginocchio la produzione di kiwi. Tale malattia risulta attualmente la più virulenta e devastante mai riscontrata in frutticoltura: si espande con estrema velocità tra gli impianti causando la morte totale delle piante colpite indistintamente dalla varietà e dall età delle stesse. Il danno economico prodotto è di grande rilevanza riguardando sia la produzione sia l investimento ad actinidieto, che deve essere espiantato completamente per fermare il diffondersi dell infezione. Il progetto si propone di affrontare la problematica della batteriosi attraverso uno studio comparato degli aspetti tecnico agronomici, di sviluppo della malattia sulla pianta e sulle ricadute economiche del settore produttivo.

4 10.2 Stato dell arte generale sull argomento del progetto (max ½ pagina) 9 Attualmente sono in corso tre azioni specifiche di ricerca sul tema Psa dei quali due ad iniziativa regionale, ed un terzo a finanziamento MIPAAF, le cui caratteristiche generali sono a seguire: Convenzione per l attuazione del progetto di ricerca: Cancro batterico dell actinidia (Pseudomonas syringae pv. actinidiae): messa a punto di strategie e difesa Coordinamento: CRA-PAV. Ente finanziatore: Regioni Lazio ed Emilia Romagna. Progetto in atto: durata 3 anni ( ). Il progetto affronta i seguenti ambiti di ricerca: messa a punto e validazione di metodi diagnostici, caratterizzazione molecolare della popolazione di Psa, studio di alcuni aspetti epidemiologici e individuazione di strategie di controllo della malattia. Convenzione per l attuazione delle Linee di ricerca integrative al progetto triennale cancro batterico dell actinidia (Pseudomonas syringae pv. actinidiae): messa a punto di strategie di difesa. Coordinamento: CRA-PAV. Ente finanziatore: Regione Lazio. Progetto in atto: durata 1 anno (2011). Il presente progetto nasce come integrazione del precedente; nella fattispecie affronta le seguenti aree tematiche: individuazione di strategie di difesa integrata, definizione di schede descrittive dei patogeni batterici del kiwi, metodi diagnostici quantitativi, verifica trasmissibilità per polline, caratterizzazione di geni coinvolti nella risposta di resistenza di Actinidia spp., messa a punto di un sistema di telerilevamento per la mappatura del cancro batterico, miglioramento genetico. Progetto ACTISANA - Indagine sullo stato fitosanitario del materiale vivaistico di Actinidia spp. nelle principali aree di produzione nazionali. Coordinamento: CRA-PAV. Ente finanziatore: MIPAAF. Progetto proposto: durata, 2 anni. Col presente progetto si intende effettuare una indagine nei principali vivai di produzione dell actinidia nazionali al fine di garantire e valutare la qualità, in termini fitosanitari, del materiale vivaistico. Progetto ACTINIDIA Azioni di controllo e tecnologicamente innovative nella identificazione di avversità su Actinidia. Coordinamento: Prof. Balestra Università degli studi della Tuscia, Dip.to Protezione delle piante. Ente finanziatore: MIPAAF. Sviluppo di sistemi molecolari di diagnosi qualitativa e quantitativa rapidi efficienti ed economici per verificare la presenza, anche asintomatica, di tre patogeni batterici su Actinidia: Pseudomonas syringae pv. syringae (PSS); P.viridiflava (PV) e P.s.actinidiae (PSA).

5 10.3 Obiettivi generali e specifici (intermedi e finali - max ½ pagina) Il progetto INTERACT si pone come obiettivo generale la messa in opera di una azione di ricerca e sperimentazione ad ampio raggio, per l ottenimento di risultati a breve, medio e lungo termine, focalizzati su tre obiettivi prioritari: A) Coordinare e concretizzare nel minor tempo possibile i risultati attesi dai progetti in corso, puntati ad azioni mirate di contenimento e lotta alla batteriosi del kiwi, ed alla realizzazione di metodi diagnostici preventivi di varie matrici vegetali, dai materiali di vivaio al polline; B) Sviluppare tutte quelle aree della ricerca più avanzata che, traendo vantaggio dalla applicazione delle tecnologie genomiche, mira ad ampliare le conoscenze sul binomio pianta-batterio in modo tale da identificare meccanismi genetici di controllo della interazione dei due organismi; C) Acquisire e caratterizzare, con azioni di collaborazione internazionale, fonte di diversità genetica del genere Actinidia, per poter ampliare con germoplasma differenziato i programmi di miglioramento genetico della specie Enti partecipanti al progetto 10 Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura (CRA) Centro Servizi Ortofrutticoli (CSO) Unità Operative Centro di Ricerca per la Frutticoltura, Via Fioranello Roma Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Centro di Ricerca per la Genomica e Postgenomica Centro Servizi Ortofrutticoli Imprese Collaborazioni esterne Il Centro Servizi Ortofrutticoli prevede di attivare collaborazioni esterne con: Rilevatori sarà costituita un apposita rete di rilevatori, preventivamente addestrati che avranno il compito di rilevare le aziende, nel caso in cui l iscrizione non avvenga on-line e di effettuare la rilevazione campionaria prevista nell ambito del controllo di qualità. Ad alcuni rilevatori sarà inoltre affidato l incarico di inserimento dati aziendali nel database opportunamente predisposto. Università degli studi di Bologna Facoltà di Scienze Agrarie Prof. Pirazzoli - si occuperà dell aggiornamento dei costi di produzione, del calcolo del giudizio sulla convenienza economica al mantenimento della coltivazione in funzione della gravità dell infezione; calcolo degli indennizzi Software House: avrà il compito di creare il sito internet in collaborazione e sotto la gestione di CSO Le collaborazioni esterne delle altre Unità Operative sono previste a titolo non oneroso per il progetto

6 10.5 Piano di attività (max 10 pagine) 11 Coordinamento WP Titolo WP Attività e metodi Risultati UO Indicatori di verifica n 1 coordinamento Riunioni in videoconferenza e una riunione Pubblicazione tecnicoscientifiche 1 Numero di annuale presso una delle strutture di e diffusione dei pubblicazioni e rapporti riferimento del progetto Attività: coordinamento dei gruppi di ricerca Promozione dello scambio di risultati Promozione dei risultati attraverso la stampa tecnica Pubblicazione dei risultati scientifici più rilevanti su riviste ad alto impact factor Promozione di incontri con agricoltori e organizzazioni professionali risultati anche attraverso le tecnologie web tecnici Promozione di attività di scambio di ricercatori e materiale vegetale con paesi esteri 2 Piano di sfruttamento dei risultati e ricadute Coordinamento della diffusione delle conoscenze tecniche utili al controllo o confinamento della malattia ottenute nel corso del progetto. Promozione di eventuali prodotti o metodologie brevettabili Maggiore conoscenza della suscettibilità alla malattia delle diverse linee genetiche e varietà disponibili in Italia o reperibili. Uso delle conoscenze tecniche acquisite per la diffusione di un piano di difesa verso la diffusione del batterio Numero di aziende che utilizzeranno le conoscenze prodotte nel progetto Linee di ricerca che nasceranno da questo progetto che affronterà la batteriosi Elenco delle linee di ricerca e dei relativi WP in cui è suddiviso il progetto: Linea di ricerca 1 Approcci genetici e di difesa fitosanitaria verso l infezione provocata da Pseudomonas syringeae pv actinidiae su A. chinensis e A. deliciosa WP WP titolo 1 Esplorazione della base genetica del germoplasma disponibile o reperibile 2 Induzione di variabilità genetica 3 Caratterizzazion e genetica dei ceppi di Psa mediante sequenziamento 4 Definizione del ciclo della malattia del patogeno 5 Individuazione dei momentichiave in cui effettuare i trattamenti preventivi e curativi 6 Valutazione di parametri ambientali ed agronomici sulla severità della malattia Attività e metodi risultati Indicatori di verifica Inoculo artificiale e osservazioni in aree infette Mutazione su semi e propaguli in vitro sequenziammento Isolamento del batterio Somministrazion e di formulati atti alla prevenzione o cura del cancro batterico Inoculo artificiale su piante allevate in condizioni agronomiche diverse Definizione di una scala di sensibilità alla malattia Infezione artificiale su semenzali Allineamento di sequenze di ceppi batterici Definizione del ciclo della malattia Predisposizione di un calendario dei trattamenti Correzione della concimazione del actinidieto Efficacia ed efficienza della scala di sensibilità prodotta Vitalità semenzali prima e dopo l inoculo verso il controllo non trattato Presenza di mutazioni tipo indels e/o SNP Descrizione del processo di infezione Efficacia in prove sperimentali comparate Efficacia in prove sperimentali comparate

7 Linea di ricerca 2 Analisi trascrittomica della interazione pianta-patogeno WP WP titolo Attività e metodi risultati Indicatori di verifica WP 1 WP 1 WP 1 WP1 WP 1 WP 2 WP 3 WP 4 Analisi trascrittomica della interazione pianta-patogeno (CRA-GPG) Analisi trascrittomica della interazione pianta-patogeno (CRA-GPG) Analisi trascrittomica della interazione pianta-patogeno (CRA-GPG) Analisi trascrittomica della interazione pianta-patogeno (CRA-GPG) Analisi trascrittomica della interazione pianta-patogeno (CRA-GPG) Studio del processo di infezione, colonizzazione e diffusione di Psa in pianta (CRA-GPG) Caratterizzazione molecolare del patogeno (CRA-GPG) Formazione (CRA- GPG) Attività 1: Sequenziamento ILLUMINA GAIIx del trascrittoma di pianta infettata rispetto a pianta sana Attività 2: Analisi trascrittomica differenziale su ILLUMINA GAIIx di pianta sano ed infettata con SAR indotta e controllo non indotto Attività 3: Analisi trascrittomica su ILLUMINA GAIIx di genotipi della collezione di germoplasma caratterizzati per la resistenza/tolleranza da parte di altre UO Attività 4: Marker-discovery con piattaforma bioinformatica attraverso analisi dei database precedentemente ottenuti. Attività 5: Analisi trascrittomica a diversi timing di trattamento e diverse condizioni di crescita Attività 1: Analisi PCR su diversi tessuti vegetali di piante infette Attività 1: sequenziamento di genomi con ILLUMINA GAIIx. Attività 1: attività formativa in bioinformatica e biologia molecolare. creazione di un database di sequenze del trascrittoma di Actinidia ampliamento del database di sequenze, studio di geni implicati nella interazione pianta-patogeno correlati a SAR, valutazione dell efficacia degli induttori di SAR individuazioni di trascritti coinvolti nella resistenza o tolleranza a batterio, individuazioni di trascritti differenziali tra tolleranti e suscettibili l'identificazione di marcatori molecolari (SSR, InDel, SNP) nelle regioni codificanti del genoma di Actinidia. Identificazione di trascritti differenzialmente espressi in relazione alle diverse condizioni di crescita Identificazione di tessuti positivi e negativi al test, comprensione della diffusione di Psa. Sequenze genomiche di diversi ceppi di PSA, definizione della biodiversità/evoluzione dei loci implicati nella virulenza a livello della popolazione del batterio Formazione di esperto in bioinformatica applicata a NGS e esperto in biologia molecolare applicata alla trascrittomica Rilascio di database di sequenze (documenti). Rilascio di database di sequenze (documenti). Rilascio di database di sequenze (documenti). Rilascio di tabelle di marcatori (documenti). Rilascio di database di sequenze differenzialmente espresse (documenti). Rilascio di tabelle (documenti). Rilascio di database di sequenze (documenti). Formazione di due esperti in NGS

8 Linea di ricerca 3 Biologia del patosistema kiwi-psa: diagnosi e aspetti di metagenomica e trascrittomica per lo studio dell induzione di resistenza WP titolo Attività e metodi Risultati Indicatori di verifica 1. Aggiornamento e sviluppo di metodi di diagnosi quantitativa 2. Indagine sulla presenza del batterio su frutti asintomatici (dopo stoccaggio in celle di conservazione per tempi diversi) 3. Analisi metagenomiche 4. Sviluppo di saggi biologici rapidi e ripetibili per lo studio dell induzione di resistenza 5. Screening di fattori (molecole di sintesi, composti commerciali complessi etc.) in grado di conferire resistenza al cancro batterico e/o di comprendere i processi di segnalazione attivi nella Messa a punto e/o confronto fra protocolli di diagnosi molecolare per la verifica dei parametri sensibilità e specificità: analisi di sequenza (allineamenti e filogenesi) finalizzate al disegno e alla scelta di primers e/o sonde specifiche; verifica della specificità e sensibilità di metodi basati su PCR convenzionale e Real-TimePCR; messa a punto di Real-TimePCR quantitativa; verifica dell applicabilità dei metodi per la diagnosi di Psa da materiale vegetale sintomatico e asintomatico; impostazione di prove di validazione dei protocolli; aggiornamento e armonizzazione dei protocolli di diagnosi. Monitoraggio della presenza del batterio associata a frutti asintomatici dopo la conservazione in celle di raffreddamento (climatiche o in atmosfera controllata) applicazione di Real-Time PCR per il rilevamento del batterio da frutti asintomatici; analisi di campioni bulk di frutti asintomatici dopo stoccaggio in celle di conservazione per tempi diversi. Individuazione di piante di actinidia manifestanti fenotipi di resistenza alla malattia; Analisi metagenomica su piante di interesse di actinidia, eventualmente in studio presso altre strutture di ricerca che li rendano disponibili per tale fine; analisi bioinformatica dei dati; Caratterizzazione della popolazione microbica associata alla fillosfera e/o endosfera di piante di actinidia; Applicazione dell analisi metagenomica su genotipi resistenti a confronto con individui suscettibili (nel caso siano reperiti); analisi bioinformatica dei dati; Screening di isolati microbici d interesse per antagonismo o per l induzione di sistemi SAR mediante tecniche di ibridazione su colonia Comparazione di diverse tecniche di inoculazione Inoculazione di differenti tessuti ed organi e di piante a diversi stadi di sviluppo Osservazione della risposta all inoculazione per l individuazione di una idonea scala di valutazione della malattia Modalità di somministrazione dell induttore di resistenza Valutazione di eventuali effetti di fitotossicità degli induttori di resistenza alle concentrazioni stabilite per l uso Effettuazione di saggi biologici basati sul trattamento con induttore di resistenza e successiva inoculazione con Psa su un adeguato numero di ripetizioni Sperimentazione del maggior numero Sviluppo e/o confronto fra metodiche di diagnosi caratterizzate da elevata sensibilità e specificità Scelta dei protocolli più idonei per l identificazione di Psa da materiale vegetale sintomatico e asintomatico Accertamento dello stato sanitario di frutti asintomatici dopo la frigo conservazione Caratterizzazione della popolazione microbica associata all actinidia (endosfera e/o fllosfera) Individuazione di isolati microbici d interesse per l induzione di sistemi SAR o antagonismi Sviluppo di un saggio biologico rapido e ripetibile adeguato per studiare l effetto degli induttori di resistenza Caratterizzazione dell effetto degli induttori di resistenza saggiati sullo sviluppo della malattia ed eventuale individuazione di prodotti/fattori efficaci per il controllo Caratterizzazione di eventuali N di protocolli prodotti N di metodiche validate N di campioni bulk analizzati N di sequenze di microrganismi associati all actinidia (endosfera o fillosfera) N di microrganismi associati all actinidia di interesse per caratteristiche di induzione di SAR o di antagonismo Tempo necessario per la comparsa dei sintomi dopo l inoculazione Intensità dei sintomi riprodotti con l inoculazione Numero di induttori di resistenza con effetto positivo, neutro o negativo sul contenimento della malattia

9 interazione 6. Sequenziamento qualitativo di trascrittomi arricchiti in trascritti correlati alla risposta da stress 7. Basi preliminari per un esperimento di RNAseq quantitativo per studiare i1 fenomeno SAR possibile di induttori di resistenza Prove in vitro di crescita di Psa su terreni addizionati con gli induttori di resistenza risultati efficaci (per verifica effetto batteriostatico/battericida) Estrazione di RNA da piante di kiwi precedentemente trattate con molecole note per attivare il sistema di difesa Costituzione di librerie normalizzate Sequenziamento con tecnologia NGS che produce long reads Analisi bioinformatica dei dati (assemblaggio delle letture per generare sequenze full lenght, identificazione degli ORF con gli strumenti bioinformatici a disposizione (Phytozome, BLAST, PFAM, GeneOnthology etc.) etc. Da definire in base ai risultati ottenuti con l attività sull induzione di resistenza (di concerto con l UO2 e 3) effetti diretti (batteriostatico/battericida) su Psa dei prodotti risultati efficaci. Creazione di una banca dati di riferimento arricchita in trascritti correlati allo stress sensu latu e di supporto per altre analisi di profiling differenziale e marker discovery sviluppate all interno del progetto dalle UO CRA Individuazione di geni differenzialmente espressi Numero di trascritti full lenght ottenuti Lunghezza modale delle letture ottenute Espressione di geni coinvolti nella risposta di resistenza (confronto con specie modello) Individuazione di geni differenzialmente espressi Linea di ricerca 4 Costituzione di un catasto nazionale sul Kiwi quale strumento per il monitoraggio e l impatto economico del Cancro Batterico (PSA) sulla coltivazione in Italia WP WP titolo Attività e metodi risultati Indicatori di verifica 1 Creazione del catasto Database delle analisi statistiche Creazione del catasto Produzione di quanto previsto 2 Sito internet Raccolta dati e produzione del sito web Sito internet Produzione di quanto previsto 3 Studio economico Vedi allegato A3 Studio economico Produzione di quanto previsto 4 Calcolo degli indennizzi Vedi allegato A4 Calcolo degli indennizzi Produzione di quanto previsto 5 Situazione internazionale Studio e analisi bibliografica Situazione internazionale Produzione di quanto previsto 6 Divulgazione dei risultati Creazione rapporti periodici Divulgazione dei risultati Rapporti pubblicati L acquisizione di conoscenze di base sul ciclo della malattia causata da Pseudomonas syringae pv. actinidiae a carico dell actinidia in Italia è un presupposto fondamentale per impostare efficaci piani di difesa. Studio del processo di infezione, colonizzazione e diffusione di Psa Di fondamentale importanza per capire i meccanismi di diffusione del batterio sono gli studi riguardanti le fasi di infezione, colonizzazione della pianta ed evasione. Questo in relazione alle condizioni climatiche e ai diversi tessuti attaccati quali foglie, fusto, piccioli, fiori e relativa presenza di ferite. Allo stato attuale non sono ancora chiari i meccanismi di attacco, i punti di ingresso preferenziali del patogeno ed il suo passaggio ai vasi linfatici (floema e/o xilema), diffusione nella pianta e blocco dei vasi. A tale scopo risulta utile l impiego di tecniche di microscopia laser confocale (CLSM) abbinata all impiego di Psa- gfp recante la proteina reporter fluorescente GFP-uv. Siti di ingresso ed organi colpiti Si vuole chiarire quale sia la via di ingresso del batterio e le dinamiche dell inizio dell infezione. Lo studio prevede l inoculo controllato di Psa-gfp sui vari organi della pianta (foglie, fusto, piccioli, fiori) e l osservazione in vivo in tempo reale a microscopio confocale CLSM del movimento e della crescita del batterio. Si potrà stabilire il ruolo degli stomi e dei tricomi sulle foglie, delle lenticelle sui fusti e dei vari organi fiorali nonché l ingresso tramite ferite naturali (germogliamento, fioritura, caduta foglie e stacco dei frutti).

10 Colonizzazione sistemica acropeta e basipeta Lo studio è volto a determinare il movimento del batterio nella pianta, del punto di inoculo aereo fino alla colonizzazione radicale. A tale scopo verranno monitorate piante in campi neo-infetti con tecniche di valutazione dell infezione basate su analisi molecolari oltre all allestimento di infezioni artificiali in ambiente controllato. Nel primo caso i risultati saranno disponibili in tempi brevi mentre nel secondo caso in tempi medi dell ordine di mesi. Nel caso degli esperimenti condotti in ambiente confinato gioverà usare il batterio Psa-gfp per una osservazione più accurata della colonizzazione. Diffusione nel frutteto Lo studio di impianti neo-infetti esistenti, come pure la diffusione della malattia nei campi sperimentali allestiti (punto 2.2.3) permetterà di comprendere meglio ed in tempi brevi le dinamiche di diffusione del batterio e della comparsa dei sintomi all interno dell actinidieto. Parte di questi dati saranno ottenuti delle attività di monitoraggio condotte con sistemi molecolari sui campi sperimentali (tempistiche di mesi) oltre ad essere integrati da opportuni esperimenti allestiti in ambiente controllato con più piante sane ed infettate (con tempistiche di medio termine). In questo ambito deve essere chiarito il ruolo dei vettori animali (insetti, api, ecc), delle potature (ruolo delle forbici e loro disinfezione), della pioggia e del vento. Presenza sui frutti e ruolo della filiera di lavorazione del prodotto Non è ancora chiaro se il batterio possa persistere vitale sulla superficie dei frutti o alloro interno e quanto questi possano fungere da vettore del batterio. Oltre ad appurata la presenza sulla superficie e la sua capacità infettiva dopo stoccaggio dei frutti in celle frigorifere per tempi diversi, si deve valutare la sua capacità di diffusione attraverso il contatto con i mezzi di trasporto (bins, veicoli) e nelle linee di lavorazione (emissione di residui di lavorazione, scarti e spazzolature). In questo contesto possono essere eventualmente valutati diversi sistemi di disinfezione dei mezzi di diffusione. Efficacia nel contenimento con capitozzatura o reimpianto Una tecnica di contenimento della malattia molto discussa è l asportazione delle piante infette (sintomatiche con essudati) o parte di esse dal frutteto. La capitozzatura, ovvero il taglio della pianta alla base e il suo ri-allevamento, è una pratica che permette la ricostruzione rapida delle piante: si perde 1 anno di raccolto rispetto a 3 anni nel caso di reimpianto. Il sistema è attualmente utilizzato in maniera quasi empirica tuttavia potrebbe avere una valenza notevole nella ricostruzione degli impianti quando questa tecnica venga applicata molto precocemente (prima della colonizzazione sistemica di Psa) e venga accompagnata da una strategia di protezione da Psa secondo i risultati delle sperimentazioni proposte in questo progetto. Attualmente questa drastica operazione non sempre conduce all ottenimento di piante sane, poiché attuata tardivamente e perché attuata in zone spesso altamente infette o senza una efficace protezione delle piante ri-allevate. In questo contesto, deve essere valutata con analisi molecolari quantitative la presenza del batterio nelle varie parti della pianta prima della capitozzatura e dopo la ricrescita a tempi successivi. Questo permetterà di stabilire quando è possibile ancora ri-allevare la pianta o quando è necessaria una sua asportazione completa o addirittura il reimpianto dell intero actinidieto. In relazione a questo possono anche essere gestiti al meglio gli indennizzi agli agricoltori che spesso vengono messi a disposizione a livello regionale. Anche in questo caso potranno essere allestiti esperimenti in ambiente controllato con piante prelevate da impianti neo-infetti. I risultati di queste sperimentazioni prevedono tempi brevi per quanto riguarda le osservazioni su aziende preesistenti, e tempi medi per quanto concerne lo studio di piante neo-infette sia in campo che in ambiente controllato. Ciclo della malattia ed individuazione dei momenti-chiave in cui effettuare i trattamenti per il controllo Lo studio si prefigge di impostare un piano di difesa basato sui momenti in cui il batterio mostra la più alta capacità di colonizzare e moltiplicarsi sulla/nella pianta in modo da ridurre al minimo la sua capacità infettiva. A tale scopo verranno studiate le dinamiche di popolazione del batterio in varie stagioni e fasi fenologiche della pianta. In ciascuno dei momenti fenologici individuati quali più conduttivi per la colonizzazione e moltiplicazione del batterio, verranno somministrati alla pianta specifici prodotti battericidi in modo da constatare, nel contempo, la loro effettiva efficacia nel ridurre la carica microbica in un determinato momento dell accrescimento della pianta. Lo studio sperimentale fornirà il timing preciso per i piani di difesa e contenimento del patogeno. Le attività saranno associate all uso degli strumenti molecolari per il monitoraggio del patogeno nell ambiente e nella pianta), allo sviluppo degli studi della metagenomica della fillosfera per la identificazione di metodi per il biocontrollo con batteri o funghi antagonisti e composti per il trattamento protettivo e a basso impatto ambientale. Controllo e prevenzione a livello di vivaio e del polline E noto che la batteriosi del kiwi diventa epidemica anche a causa dell impiego di materiale infetto asintomatico. Questo può essere dovuto alla propagazione di giovani piante infette in vivaio, ma anche all impiego di polline infetto. La coltivazione del kiwi prevede che l actinidieto sia composto da cultivar femminili e cultivar maschili impollinatrici, tuttavia risulta spesso necessaria anche una impollinazione artificiale, effettuata con polline di provenienza esterna: il polline è ritenuto possibile vettore dell infezione. E quindi importante definire il ruolo del polline nella diffusione della malattia allestendo specifici esperimenti, sia in vitro che in vivo, che simulino l effetto dell uso di polline infetto, od inoculato con Psa, su fiori o altre parti della pianta. Una volta accertato il ruolo del polline ed i meccanismi di infezione si dovranno studiare metodologie di controllo dell infezione da parte del polline ed eventualmente strategie di

11 sanificazione dello stesso. Dovranno essere definiti protocolli di certificazione del polline basati su metodologie molecolari tali da garantire la filiera produttiva nazionale con polline certificato e controllato, esente da Psa ed altri batteri. La linea di ricerca dovrà riguardare la selezione di cloni maschili, valutare la performance nella emissione di polline, stabilire efficaci protocolli per la raccolta di polline sano e rendere operativo un protocollo di verifica e certificazione dello stesso, per la produzione italiana. Egualmente, dovranno essere predisposti protocolli operativi efficaci per la moltiplicazione di materiale vivaistico femminile esente da contaminazione. In questo settore, particolare rilevanza avranno i protocolli di risanamento, i test diagnostici applicabili in materiale asintomatico con particolare riferimento alla sensibilità nei confronti del rilevamento di Psa; a questo proposito è in corso di pubblicazione un protocollo per il rilevamento di Psa da polline (Gallelli et al., 2011) ed è in fase di verifica, nell ambito dell attività dei progetti in essere, un protocollo per la detection di Psa da materiale asintomatico. Si propone inoltre in ring test per valutare tutti i protocolli disponibili per la diagnosi di Psa. Impiego di metodologie diagnostiche molecolari esistenti. Ai fini del monitoraggio della malattia si proporrà un protocollo di analisi basato su PCR da adottare a livello ufficiale per i laboratori accreditati preposti alla certificazione del materiale vivaistico e come diagnostica di materiale infetto. Tali tecniche PCR-based possono inoltre essere adattate per l impostazione di una diagnosi differenziale finalizzata al riconoscimento di diversi isolati di Pseudomonas syringae pv. actinidiae e per altre specie patogene del genere Pseudomonas. L attività dovrà tenere una stretta interfaccia con le linee di azione presenti nel progetto ACTINIDIA e ACTISANA. Recentemente, dalla ditta IpadLab di Lodi è stato messo a punto un test diagnostico basato su reazione PCR (Rees-George et al., 2010), ed è oggetto di valutazione in Italia ed all estero. Ulteriori sviluppi delle tecniche diagnostiche sono previste nel progetto al fine di migliorare sia la specificità verso Psa che altri batteri patogeni sia disporre di analisi quantitative per studi di epidemiologia e di interazione pianta-patogeno. Sistemi di diagnosi rapida non invasiva È noto che le tecniche di analisi nell infrarosso permettono la valutazione di molte sostanze organiche presenti in frutti e tessuti. La batteriosi conduce a modificazioni sostanziali nei fusti delle piante colpite quali accumulo di polisaccaridi (mucillaggini) e disidratazione ed alterazione della fotosintesi. Vi sono già indicazioni che la tecnica di analisi multispettrale nell infrarosso potrebbe essere impiegata anche per caratterizzare parti della pianta colpite dal batterio, per uno screening rapido e non invasivo dello stato sanitario della pianta. Una volta individuati i casi sospetti si potrà procedere con metodi diagnostici più precisi). La tecnica potrà essere testata subito su piante ammalate preesistenti ed eventualmente tarata sulla malattia sfruttando gli esperimenti di inoculo artificiale. La tecnica potrebbe essere impiegata anche a livello di analisi satellitare multispettrale permettendo di rilevare le zone più colpite permettendo si stabilire strategie di intervento di difesa e contenimento. I tempi per l ottenimento dei primi risultati sono dell ordine di pochi mesi. Prove agronomiche a supporto di lotta e difesa dalla batteriosi Attualmente contro Psa non esistono azioni curative se non l asportazione e la bruciatura della piante colpite (per contenere l inoculo ambientale) mentre per quanto riguarda la protezione preventiva delle piante non risultano essere stati individuati in modo definitivo prodotti o strategie efficaci. Appare quindi di estrema importanza ed urgenza la sperimentazione di alcune strategie di difesa al fine di individuare una serie di misure atte a contenere l espansione di Psa ed a permettere la ricostruzione degli impianti già colpiti. Anche i fattori pedoclimatici rivestono un ruolo importante nel determinare una maggiore o minore suscettibilità delle piante a Psa: è noto che alcune pratiche agronomiche favoriscono lo sviluppo di fisiopatie tra cui le batteri osi. Ad esempio un eccesso di concimazione organica e azotata, una forma di allevamento molto espansa con creazione di notevole ombreggiamento e difficoltà di circolazione dell aria, una pratica tecnica irrigua con nebulizzazione di acqua determinano l insorgere di condizioni adatte allo sviluppo e diffusione della malattia. D altro canto vi sono esempi di impianti, situati in zone altamente infette, non ancora ammalati, o in cui l incidenza di Psa è bassa, condotti in maniera meno intensa o situati in zone con terreni particolari (ad esempio ricchi in calcio o con determinati rapporti tra gli elementi). Si propone quindi una sperimentazione articolata su tre diversi livelli di indagine al fine di valutare i prodotti e le strategie migliori per il contenimento della malattia. Ciascun livello delle prove prevede il costante monitoraggio della presenza del batterio nelle piante con test molecolari specifici ed eventualmente analisi dell espressione genica nei casi di riduzione dell incidenza di Psa. Questo permetterà di valutare l efficacia della protezione in maniera precoce anche in assenza dei sintomi sulle piante. Nei vari livelli saranno inoltre raccolti tutti i dati climatici (data loggers) ed eventualmente dati sullo stato nutrizionale delle piante (analisi fogliari e del terreno) onde correlare questi con le tesi sperimentali e l incidenza della malattia. Test di infezione in ambiente controllato Un primo livello consiste in una serie di esperimenti condotti su piante in vaso in ambiente controllato (serra o fitotrone), volti all individuazione di prodotti utili atti a proteggere le piante o all individuazione dei fattori pedologici (tipo di terreno, concimazione ed irrigazione) critici per una maggiore suscettibilità delle piante. Per quanto riguarda i prodotti fitoiatrici questi verranno spruzzati o somministrati alle piante prima dell infezione artificiale, considerando

12 anche diversi tempi dall applicazione. I risultati di tale sperimentazione saranno disponibili entro pochi mesi dall inizio degli esperimenti. Per quanto concerne lo studio dei fattori pedologici, le piante saranno sottoposte a diversi regimi (tipo di terreno, concimazione, irrigazione) per un determinato tempo prima del test di infezione. Per questa ragione i risultati di questa sperimentazione saranno disponibili in tempi leggermente più lunghi. Per studiare il tipo di resistenza o tolleranza data dai trattamenti, i test verranno condotti su plantule erbacee e su astoni utilizzando 2 diversi sistemi di inoculo ovvero infezione fogliare e infezione da ferita. Allestimento campi sperimentali Il secondo livello prevede l applicazione dei prodotti rivelatesi più promettenti, individuati al punto precedente, direttamente in un campo sperimentale allestito ad hoc in zona infetta da Psa. Il campo sperimentale a blocchi randomizzati dovrà essere ripetuto nei vari areali di produzione del kiwi per studiare l effetto dei diversi ambienti. La prova permetterà di avere le prime indicazioni sull efficacia dei trattamenti in tempi dell ordine dei mesi dall inizio della sperimentazione, in relazione agli stadi fenologici delle piante e considerando il tempo di latenza della malattia. Valutazione in campo di diverse variabili Il terzo livello prevede la valutazione in campo di diverse variabili contemporaneamente, quali: 1) Tipo di ambiente pedoclimatico 2) Forma di allevamento: tendone rispetto a pergoletta 3) gestione della vegetazione (potature a verde ed invernali) 4) Impianto originato da piante propagate per talea rispetto a propagate in vitro 5) Irrigazione: micro jet rispetto a goccia in continuo 6) Concimazione: regime a bassa concentrazione di azoto rispetto a standard aziendale 7) Concimazione: effetto microelementi Poiché l allestimento di campi prova per la valutazione di queste variabili richiederebbe tempi lunghi per l ottenimento dei primi risultati (fasi fenologiche annuali e tempi di crescita delle piante), questo livello di sperimentazione potrà essere realizzato grazie al monitoraggio di determinate aziende opportunamente scelte in diverse aree geografiche e con diversa gestione nelle stesse aree. In questa fase potranno essere coinvolti i servizi di assistenza tecnica locali per garantire la corretta esecuzione delle prove. Parallelamente verranno comunque costituite prove parcellari, ripetute in diverse aree del paese, presso aziende pubbliche o private (anche in accordo con istituzioni locali o privati disposti ad ospitare le prove) nell ottica di una sperimentazione di più lunga durata. Ricerca di fonti di resistenza genetica mediante esplorazione della biodiversità esistente del germoplasma di actinidia Collaborazioni nazionali-estere per il reperimento e la collezione di germoplasma La coltivazione dell actinidia si è per moltissimi anni basata su un unica cultivar femminile (Hayward appartenente alla specie A. deliciosa). Solo negli ultimi anni si sono diffuse altre varietà, specialmente della tipologia a frutto giallo, appartenenti alla specie A. chinensis. Rispetto ad altre specie coltivate, anche da frutto, la base genetica delle varietà coltivate è, quindi, estremamente limitata. Fino ad anni recenti le due specie di actinidia coltivate sono state, almeno in Europa, immuni da gravi patologie. Infatti la coltivazione poteva essere svolta senza alcun intervento fitosanitario. La comparsa della Psa ha comportato un radicale cambiamento di prospettiva. L altissima virulenza del patogeno e la sensibilità elevatissima di tutte le cultivar utilizzate pone il problema impellente della ricerca di fonti di resistenza tra il germoplasma presente in Italia e, possibilmente, in quello accessibile nel resto del mondo. Non è noto se, nelle banche di germoplasma disponibili ci sia qualche accessione che mostra minore suscettibilità o tolleranza alla malattia. In Cina, centro di diversificazione del genere Actinidia, sono presenti alcune banche di germoplasma. Il Centro di riferimento più importante è il Wuhan Botanical Garden, dove sono presenti numerose specie selvatiche e un notevole numero di accessioni delle due specie coltivate. Nel mondo sono presenti alcune altre banche di germoplasma in Nuova Zelanda, presso il Plant and Food Research Institute, e in Italia presso l Università di Udine e di Bologna. L esplorazione della base genetica nei confronti della patologia oggetto della presente proposta è di assoluta priorità e richiede un azione di internazionalizzazione attraverso lo stabilirsi di collaborazioni bi- o multilaterali tra i paesi maggiormente interessati alla coltivazione, i già citati Cina, Italia e Nuova Zelanda. Le linee di azione principali proposte sono le seguenti: 1) Valutazione della suscettibilità/resistenza del materiale genetico disponibile in Italia 2) Monitoraggio e raccolta degli individui che non manifestano sintomatologia in aree a forte tasso di infezione. Prova di infezione artificiale in ambiente controllato. 3) Raccolta di materiale attraverso la collaborazione con i sopracitati Paesi interessati alla coltivazione e costituzione di una banca di germoplasma italiana collocata in almeno due siti distinti nel paese. 4) Avvio di un programma di miglioramento genetico assistito con marcatori molecolari per produrre varietà femminili e maschili resistenti al patogeno con buone caratteristiche pomologiche. Tale programma dovrà utilizzare le eventuali fonti di resistenza naturali individuate o quelle ottenute dal programma di induzione di variabilità somaclonale 5) Caratterizzazione pomologia degli individui che manifestino un minore grado di suscettibilità o resistenza

13 La fase di screening del germoplasma prevede tempi abbastanza brevi una volta recuperato il materiale. Tuttavia il materiale deve essere preventivamente moltiplicato per via vegetativa sia attraverso talea che micropropagazione in vitro sia per l allestimento dei campi di collezioni sia perché nei test di infezione la sintomatologia si evidenzia in tempi brevi su plantule ed astoni mentre su piante adulte potrebbe avere periodi di latenza anche di qualche anno. Induzione di variabilità genetica Qualora non si individuassero linee resistenti o tolleranti o queste non fossero disponibili per il nostro paese, si propone di creare nuova variabilità utilizzando le fonti di germoplasma attualmente disponibili attraverso tecniche di coltura in vitro di apici meristematici per lo sfruttamento della variabilità somaclonale (Prado et al. 2007). Inoltre si propone la colture di antere per la rigenerazione di piante a ploidia ridotta, utili sia nei programmi di incrocio sia come base per esperimenti di genetica avanzata. Le piante rigenerate saranno sottoposte a test di infezione e quelle che si dimostreranno tolleranti o resistenti verranno ulteriormente fenotipizzate e genotipizzate onde comprendere la base della resistenza o tolleranza: saranno quindi applicate le informazioni e le metodologie molecolari avanzate sviluppate in questo progetto. Infine sarà verificata l idoneità alla coltivazione diretta delle piante ottenute o potranno essere utilizzate come linee donatrici di resistenti in un piano di miglioramento genetico. In questo contesto una loro genotipizzazione permetterà l applicazione della selezione molecolare con i marcatori molecolari che saranno sviluppati nel corso del progetto. I tempi per l ottenimento dei primi risultati sono di medio temine poiché, mentre l allestimento delle colture in vitro prevede l applicazione di protocolli noti, servono tempi maggiori per la realizzazione di sub-colture e la crescita delle plantule che saranno successivamente testate con l infezione artificiale del patogeno. Analisi della interazione pianta-patogeno Lo studio molecolare dei processi infettivi è di cruciale importanza per l individuazione di meccanismi di resistenza, ovvero dei geni addetti alla percezione e trasduzione del segnale infettivo i quali governano la risposta di resistenza. L analisi del trascrittoma permette di analizzare tutti i geni che la pianta attiva in risposta all attacco del patogeno sia in condizioni di infezione normale che di resistenza sistemica acquisita. In tale contesto le analisi di proteomica rappresentano un ulteriore approccio, potendo indagare anche le modificazioni post-traduzionali delle proteine espresse dalla pianta. I geni individuati possono essere utilmente impiegati anche come marcatori molecolari per studiare e caratterizzare germoplasma naturale o popolazioni di incrocio riducendo i tempi necessari all ottenimento di genotipi resistenti o tolleranti. Analisi del Trascrittoma e Marker Discovery L analisi del trascrittoma è proposto come strumento per ottenere la comprensione più completa degli eventi biologici coinvolti nell'interazione ospite-patogeno Questo permette di stabilire se le attuali varietà di actinidia (ad esempio Hayward) hanno in se il sistema di difesa da Psa ma non lo attivino con la tempistica necessaria a bloccarla, come farebbe un genotipo resistente. L analisi del trascrittoma permette inoltre di individuare geni chiave implicati nell interazione pianta-patogeno e permette di creare una banca dati di sequenze espresse utili da impiegare come marcatori molecolari per studi di genetica e caratterizzare di germoplasma. I tempi previsti per l analisi del trascrittoma sono nell ordine di alcuni mesi una volta preparati i campioni biologici. Poiché questa fase del progetto non richiede la messa a punto esperimenti particolari od il reperimento di germoplasma esotico, può essere iniziata sin da subito e fornire informazioni utili per i successivi esperimenti. In questa sede viene prospettato l impiego dello strumento ILLUMINA per le analisi del trascrittoma, in quanto lo strumento di NGS è in dotazione al CRA. Tuttavia, qualora le condizioni sperimentali portassero a valutare l impiego più appropriato di altra tecnologia NGS (sequenziatore 454), la strategia descritta verrà rivisitata alla luce delle situazioni sperimentali presentate. Sequenziamento del trascrittoma di pianta infettata rispetto a pianta sana L analisi del trascrittoma in condizione di infezione prevede la stretta collaborazione tra esperti di tecnologie genomiche, con esperti di patologia (batteriologia nello specifico) e genetisti della specie Actinidia. Generalmente nelle resistenze patogeno-specifiche di tipo gene a gene (ad esempio la resistenza a P. syringae pv tomato in pomodoro, Pedley et al. 2003) le piante suscettibili attivano una serie di risposte in grado di contrastare la malattia al pari delle piante resistenti tuttavia, mancando in esse il gene per la percezione di quel particolare patogeno, l attivazione è tardiva e conduce alla malattia. La tecnologia di analisi del trascrittoma basata sul sistema ILLUMINA ha la capacità di rilevare tutte le specie di mrna espresse nelle cellule, compresi trascritti di geni non annotati e a basso livello di espressione, come spesso accade per i geni regolatori o attivatori di risposte a patogeno. Questa tecnologia è di tipo quantitativo con un ampia gamma dinamica tale da premettere una accurata quantificazione di tutti i trascritti espressi sia ad alto che basso livello fornendo una misurazione precisa e sensibile in tempi brevi e con costi relativamente contenuti rispetto al grande mole di informazioni ottenute. L uso di questa tecnica ha inoltre il vantaggio di non richiede conoscenze

14 precedenti sulla sequenza dei geni da analizzare, come invece succede per altre metodologie quali i microarrays: si possono infatti analizzare anche organismi con genomi non ancora caratterizzati. L'analisi sarà effettuata confrontando il pattern di espressione genica di piante sane rispetto a piante infette. Possono essere analizzati simultaneamente in una cella di flusso fino a 21 campioni da suddividere in tre repliche biologiche, per un totale di 7 diverse tesi a confronto. L analisi permetterà inoltre la creazione di un database di sequenze del trascrittoma di Actinidia: i dati ottenuti da ILLUMINA GAII (fino a 150 bp, pair-end) saranno assemblati in contig sfruttando una serie di tools di assemblaggio dedicati (ad esempio, Abyss, Velvet, oasi, Rnnotator). Un insieme di EST da varie specie Actinidia (Crowhust et al., 2008) nonché la disponibilità di sequenze genomiche di actinidia verranno considerati come strumenti di riferimento per assistere l assemblaggio. In questo modo sarà creato un catalogo di tutte le specie di mrna espressi in piante sane e infette. I tempi previsti per l analisi del trascrittoma sono nell ordine di alcuni mesi una volta preparati i campioni biologici. Poiché questa fase del progetto non richiede la messa a punto esperimenti particolari od il reperimento di germoplasma esotico, può essere iniziata sin da subito e fornire informazioni utili per i successivi esperimenti. Sulla base degli esperimenti di induzione di risposta sistemica acquisita (SAR) realizzati nel progetto (punto 2.5) verrà analizzata l espressione genica differenziale in piante suscettibili infettate e non infettate in condizioni normali e con SAR indotta. Caratterizzazione di germoplasma, linee in selezione, mutanti Al fine di comprendere le basi genetiche della resistenza o tolleranza del germoplasma fenotipizzato con test di inoculo artificiale, questo verrà studiato dal punto di vista molecolare attraverso l analisi trascrittomica. Si potrà indagare l espressione dei geni coinvolti nella interazione pianta-patogeno in relazione a: diversi timing di infezione, diverse condizioni pedo-climatiche, diversi genotipi, diversi stadi fenologici della pianta, tessuti differenti (foglia, picciolo, tralcio erbaceo o legnoso, fiori e frutti). I tempi necessari per l ottenimento dei risultati di questa fase del progetto sono subordinati all analisi del germoplasma e quindi sono di medio termine. Marker discovery Il confronto di trascrittomi ottenuti da diversi genotipi rende possibile l'identificazione di marcatori molecolari (SSR ed InDel) nelle regioni codificanti del genoma di Actinidia (Fraser et al. 2007). Questi markers potranno essere utili per la costruzione di una mappa genetica una volta identificato un genotipo resistente o tollerante a Psa. Inoltre non appena il genoma di actinidia si rendesse disponibile si aprirebbe un nuovo capitolo sulla possibilità di fare analisi di espressione a livello sub-genico (isoforme di splicing, spicing alternativo, uso differenziale di promotori) oltre ad una più ampia possibilità di identificare altri marcatori molecolari. I tempi necessari per l ottenimento dei risultati di questa fase del progetto sono subordinati all analisi del germoplasma e quindi sono di medio termine. Tuttavia non appena saranno disponibili i dati del sequenziamento del genoma, in corso presso i gruppi di ricerca neozelandesi, i tempi si accorceranno notevolmente. I marcatori legati alla resistenza/tolleranza a Psa, ed eventualmente ad altre malattie, permetteranno di accelerare il processo di breeding attraverso la selezione assistita (MAS). In questo contesto potranno essere selezionati precocemente (stadio di plantula) anche altri caratteri quali caratteri legati alla produzione. Durante il progetto sarà eventualmente possibile individuare le linee da utilizzare negli incroci ed iniziare i programmi di breeding. L applicazione della MAS avverrebbe l anno successivo alla realizzazione degli incroci, I tempi per questa fase sono quindi di lungo temine. Studio dell influenza di condizioni pedo-climatiche sull espressione dei geni coinvolti nella interazione piantapatogeno L interazione pianta-patogeno è spesso influenzata oltre che da fattori climatici anche da fattori pedologici ovvero legati al tipo di terreno ed alla gestione agronomica dell impianto quali concimazioni ed irrigazioni. Questo è particolarmente importante nell actinidia dove l apporto di questi elementi è stato spesso utilizzato come forte leva per l incremento delle produzioni. Sulla base dei risultati che si otterranno, verranno allestiti esperimenti mirati al confronto dell espressione genica, mediante gli strumenti sviluppati nei punti precedenti, di piante sottoposte a condizioni pedo-climatiche diverse. Ciò permetterebbe di confermare il ruolo di questi fattori e comprendere ulteriormente le basi genetiche della risposta a Psa. Biologia e trascrittomica delle interazioni ospite-patogeno mediate da SAR Le piante, anche quelle definite come genotipi suscettibili, hanno la potenzialità di resistere ai patogeni. Tale capacità risiede nei meccanismi della resistenza sistemica acquisita (SAR) i quali, attivandosi in seguito al verificarsi di uno stress o al contatto con taluni microrganismi, mettono la pianta in condizione di rispondere in maniera resistente al successivo attacco di patogeni. Molteplici sono i segnali ormonali endogeni che contribuiscono in diversa misura all instaurarsi dei diversi tipi di SAR e che interagiscono positivamente o negativamente attraverso meccanismi di cross-talk. L azione dei segnali ormonali viene mimata da molecole di sintesi, i cosiddetti induttori di resistenza,

15 utilizzati per il controllo di svariate malattie delle piante. Tale settore rimane pressoché inesplorato nel patosistema kiwi-psa, pertanto le relative investigazioni potrebbero fornire informazioni strategiche per la risoluzione o il contenimento della problematica. Risulta quindi importante stabilire quali sostanze siano più efficienti nell induzione di SAR e nel creare una resistenza nella pianta. Saggi biologici per lo studio dei processi SAR Parallelamente alle analisi molecolari risulta altrettanto importante evidenziare quali siano i processi SAR-like attivi in kiwi ed in grado di bloccare/modulare la malattia e se esistono molecole di sintesi in grado di elicitarli. La modalità sperimentale si basa su saggi biologici basati su trattamenti inducenti (segnali ormonali e altre molecole di sintesi, non-patogeni etc.) seguiti dall inoculazione con Psa. È necessaria una preliminare messa a punto che richiede l identificazione delle concentrazioni a cui i trattamenti vanno effettuati, il tempo necessario affinchè la SAR si instauri e che deve intercorrere tra trattamento e inoculazione. A ciò segue lo screening del maggior numero possibile di trattamenti inducenti, cosa che richiederà una intensa attività di saggi di inoculazione. Non meno importante è appurare con saggi in vitro, se i trattamenti utilizzati abbiano un effetto diretto di tossicità su Psa. Il lavoro prevede anche l utilizzo di inibitori farmacologici per l identificazione dei pathways ormonali che sostengono l instaurarsi dei processi SAR e dunque condizionanti la suscettibilità/resistenza. A questa prima fase, seguirà una fase di sperimentazione in pieno campo con induttori di resistenza efficaci. Le molecole rivelatesi efficaci potranno cominciare ad essere sperimentate in campo. Analisi trascrittomica delle interazioni actinidia-psa mediate da segnali SAR Le analisi di trascrittomica differenziale possono rivelare geni chiave che nella pianta regolano i processi SAR. In altre parole, si potrebbe far luce su alcuni step del complesso network ormonale che è alla base della regolazione ed evidenziare geni recettori coinvolti nella sensibilizzazione SAR. Trascrittoma full length in piante con SAR indotta Poiché il genoma di kiwi non è ancora stato completamente sequenziato, il database di sequenze geniche espresse ottenuto in questo progetto sarà arricchito dall analisi trascrittomica condotta su piante suscettibili infettate e non infettate in condizioni normali e con SAR indotta (per un totale di 4 condizioni base), eventualmente estesa a diversi tempi dall inoculo e dalla induzione di SAR. Il confronto dei dati ottenuti nei diversi trattamenti consentirà anche di individuare geni differenzialmente espressi. Analisi trascrittomica differenziale. Questa analisi è mirata ad individuare differenze tra i trattamenti comparati: piante non in stato SAR (infetta e non) ed in stato SAR (infetta e non). L analisi si basa sul sequenziamento e quantificazione di trascritti derivati dai frammenti genici locati a 3. Le stringhe soggette a deregolazione sarebbe identificate con precisione grazie al confronto con il database di riferimento. La validazione dei trascritti differenzialmente espressi verrà effettuata con Real-Time PCR. Studio dei pathway di trasduzione del segnale La ricostruzione parziale di uno o alcuni pathway di trasduzione del segnale potrà permettere un confronto in silico con Arabidopsis (o altra specie modello). Tale confronto potrà indicare quali geni sono candidati per il completamento del/i pathway. Tali geni possono essere isolati con un approccio di geni candidati e l espressione può essere verificata con tecniche di microarray e/o Real-Time PCR. I geni chiave identificati dagli esperimenti con RNAseq su piante SAR indotte possono poi essere utilizzati per lo sviluppo di marcatori molecolari utili per lo screening di germoplasma resistente. Biologia e metagenomica delle interazioni ospite-patogeno mediate da SAR Analisi delle fillosfere associate ad actinidia Alcuni individui di kiwi riescono a sfuggire alla malattia pur essendo all interno di impianti fortemente colpiti. E possibile che nelle fillosfere, rizosfere o nel tessuto vascolare di tali individui, o di altri all interno di vecchi impianti (anch essi meno colpiti) siano presenti microorganismi in grado di contrastare l insediamento del patogeno in quanto attivatori di SAR o perché antagonisti diretti di Psa. Analisi 16S 454-sequencing L approccio di metagenomica mirato al sequenziamento della regione del DNA ribosomale 16S consentirebbe di caratterizzare le comunità di microrganismi presenti, permettendone una identificazione a livello di genere o specie. Il confronto con le comunità microbiche presenti nelle piante fortemente colpite può evidenziare differenze qualiquantitative indicando quali sono le specie di microrganismi potenzialmente in grado di contrastare il patogeno (per antagonismo diretto o per induzione di processi SAR-like). Le analisi di metagenomica da effettuare con pyrosequencing massivo parallelo 454-sequencing che consente la produzione di reads di circa 800 bp. Il ricorso a tale

16 tecnologia è giustificato dal fatto che non si possono produrre sequenze consenso a partire da stringhe brevi, per la probabilità altissima di produrre sequenze chimeriche interspecifiche. Isolamento delle specie batteriche Parallelamente al punto precedente va effettuato un lavoro di isolamento e collezionamento di tutte le colonie batteriche presenti nei tessuti e negli individui oggetto delle analisi di metagenomica. Tali colonie vanno poi selezionate con tecniche di colony hybridization sfruttando le informazioni di sequenza ottenute con il sequenziamento del metagenoma. Valutazione dell antagonismo verso Psa ed induzione di processi SAR I microrganismi che sono stati selezionati in seguito all attività dei precedenti punti e del punto 2.4.1, sono preliminarmente studiati per la loro capacità di antagonisti nei confronti di Psa o come induttori di processi SAR-like efficaci contro Psa. Analisi del Proteoma della pianta Analisi del proteoma tramite l elettroforesi bidimensionale (2D-GE), abbinata alla spettrometria di massa tandem (MS/MS), permette la caratterizzazione di ampi set di proteine espresse nei tessuti in una data condizione fisiologica (circa 800 specie proteiche); tale tecnologia permette non solo di caratterizzarne i livelli di espressione proteica ma anche le modifiche post-traduzionali, di importanza chiave nei processi di segnalazione scatenati in risposta ai patogeni. Nonostante il ridotto quantitativo di geni esaminati per esperimento, se paragonato a tecniche di trascrittomica globale, l approccio di proteomica ha il vantaggio di poter identificare le proteine di interesse anche se il genoma della specie in studio non è caratterizzato - come nel caso dell Actinidia - poiché le proteine, in quanto maggiormente conservate rispetto alle sequenze geniche, possono essere identificate anche impiegando informazioni di sequenza di altre specie. L analisi del proteoma dei diversi tessuti, sia sani che infetti, viene proposta per una comprensione più completa dei processi fisiologici innescati nei tessuti dell ospite ad opera del patogeno e per creare un data-base di mappe bidimensionali che possa essere di riferimento per ulteriori studi. Successivamente verrà effettuata l analisi di espressione differenziale per confrontare: tessuti infetti/sani; tessuti trattati con induttori chimici di resistenza/non trattati. Creazione di mappe bidimensionali ed espressione differenziale. Verrà impiegata la 2D-GE per generare le mappe corrispondenti ai diversi tessuti e, grazie all impiego della MS/MS per effettuare de novo sequencing, saranno identificati tutti gli spot proteici presenti nelle mappe, così da generare un data-base di mappe ben annotate dei diversi tessuti di Actinidia. Successivamente verrà effettuato il confronto delle mappe ottenute da tessuti sani ed infetti, non trattati e trattati con induttori di resistenza, per effettuare l analisi di espressione differenziale. In tal modo sarà possibile caratterizzare la reazione dell ospite durante le prime fasi di colonizzazione del batterio, e saggiare la risposta di resistenza innescata dagli induttori chimici di resistenza. Un opportuno numero di repliche tecniche e biologiche garantirà la robustezza statistica dei risultati ottenuti. Analisi proteomica shot-gun Una analisi proteomica avanzata più informativa rispetto all'analisi 2D è la tecnica shotgun proteomics che prevede una prima digestione del campione, seguita da analisi cromatografica high performance liquid chromatography (HPLC) e successiva identificazione tramite una tandem mass spectrometry (MS/MS) ed interpretazione del dati attraverso interrogazione di database (Alexey et al. 2005). La tecnica prevede di analizzare virtualmente tutti i peptidi presenti in un campione senza preventiva separazione su gel 2D. Questa tecnica permetterebbe una analisi più ampia di tutte le specie proteiche e relative varianti presenti in campioni infettati e non suscettibili o resistenti/tolleranti o con SAR indotta. Caratterizzazione della diversità genetica e infettiva del batterio Psa e sviluppo di metodologie diagnostiche e di prevenzione Caratterizzazione molecolare del patogeno L attività prevede il sequenziamento con piattaforme NGS (Next Generation Sequencing) di ceppi batterici di PSA provenienti dalle aree infette italiane e da aree infette di altri Paesi, come Nuova Zelanda, Korea, Cina, Cile, Giappone etc. A questi dovrebbero essere aggiunti ceppi di PSA isolati in passato, negli anni 80 e 90, già disponibili nelle principali collezioni. I dati ottenuti potranno inoltre essere confrontati ed integrati con i dati di sequenziamento già disponibili per diverse specie di Pseudomonas (O Brien et al., 2011). Per tale scopo è previsto il sequenziamento e la successiva annotazione di genomi di alcuni ceppi rappresentativi della recente epidemia di cancro batterico in Italia. Sarà possibile utilizzare ceppi isolati da kiwi giallo e kiwi verde,

17 ottenuti dalle regioni italiani in cui è stata segnalata la malattia nel corso del triennio Sarà possibile individuare geni specifici coinvolti nella produzione di tossine batteriche associate alla virulenza del patogeno, effettori specifici determinanti l host range dei singoli ceppi, geni di quorum sensing coinvolti nei processi di comunicazione tra cellule batteriche, geni unici presenti nei singoli ceppi di P. s. pv. actinidiae che conferiscono precisi fenotipi (virulenza, resistenza al rame). Tali conoscenze sono di fondamentale supporto per individuare opportune strategie di contenimento e di difesa che limitino la moltiplicazione del batterio all interno della pianta ospite. Una conoscenza globale del genoma del batterio Psa, della diversità genetica dei patotipi presenti in areale italiano ed estero, è alla base dello sviluppo delle indagini successive sulla interazione pianta-patogeno e per lo sviluppo di metodi diagnostici. Lo studio di caratterizzazione molecolare dei patotipi provenienti dalle aree infette italiane ed estere, dovrà essere affiancato alla caratterizzazione della virulenza degli stessi attraverso opportune prove di patogenicità. Una approfondita caratterizzazione del patogeno permetterà una serie di azioni di seguito riportate. 2. Creazione di una collezione di isolati di PSA di diversa provenienza geografica e temporale; 3. Sequenziamento genomico di 7 diversi isolati di Pseudomonas syringae pv. actinidiae per SNP discovery; 4. Confronto con le sequenze di altri Pseudomonas syringae per trovare differenze tra i geni di patogenicità (ricerca SNP); 5. caratterizzazione con marcatori molecolari (SNP) di un ampio numero di isolati; 6. trascrittoma di alcuni isolati di Psa in diverse fasi di infezione; 7. ricerca di geni coinvolti nella patogenicità; 8. Valutazione del livello di espressione di geni coinvolti nella patogenicità (qrt-pcr); 9. Classificazione dei ceppi in base alla virulenza e alla variabilità molecolare; 10. Knock-out e sovrespressione di geni coinvolti nella patogenicità per valutare il loro coinvolgimento nella virulenza in PSA; 11. Ricerca di Pseudomonas syringae saprofiti e valutazione della loro capacità antagonistica verso Psa per il biocontrollo (impiego dei marcatori SNP); 12. Valutazione dell antagonismo in condizioni controllate e in frutteto (impiego dei marcatori). Messa a punto di protocolli di biologia molecolare per la identificazione dei vari isolati di Pseudomonas e patotipi specifici. Sulla base delle relazioni filogenetiche, si potrà mettere a punto protocolli in real time (rt)-pcr con sonde specifiche, più sensibili rispetto ai metodi di PCR convenzionale. L attività dovrà tenere una stretta interfaccia con le linee di azione presenti nel progetto ACTINIDIA, e con gli altri progetti CRA. Nell ambito dei Progetti triennale ed annuale, finanziati dalla Regione Lazio, è stata messa a punto una metodica specifica per il rilevamento di Psa ed è in fase di messa a punto un metodo di Real-Time PCR per il rilevamento e la quantificazione del patogeno. Sulla base delle nuove conoscenze del patogeno a livello genomico che saranno acquisite nell ambito dell attività descritta nel punto del presente Progetto, potranno essere individuati nuovi marcatori molecolari e di conseguenza nuovi protocolli diagnostici da sottoporre a confronto con quelli già disponibili. I protocolli verranno testati e validati secondo gli standard europei sui ceppi presenti nel territorio nazionale eventualmente a confronto con i ceppi-tipo rappresentativi di altre popolazioni di Psa (coreana, giapponese etc.), e/o patotipi specifici individuati nel corso dell attività descritta nel punto Eventuali punti critici verranno implementati e ottimizzati. A tale scopo per ciascuno dei metodi saranno verificati i parametri specificità, sensibilità, affidabilità, riproducibilità e ripetibilità, attraverso l impostazione di opportune prove di validazione (estratti vegetali naturalmente infetti ed estratti contaminati con concentrazioni calibrate del patogeno). Ciò consentirà di ottenere proposte di aggiornamento per l adeguamento dei protocolli, sia alla luce delle nuove conoscenze scientifiche acquisite,che in relazione alle esigenze dei laboratori di diagnosi. Di fondamentale importanza appare infatti l armonizzazione e la validazione di protocolli diagnostici di tutte le metodologie PCR già disponibili in letteratura, lo sviluppo di nuove metodologie più specifiche e sensibili, nonché metodi di rapida diagnosi di campo. I metodi che risponderanno in maniera ottimale alle prove di validazione (es. sensibilità, specificità etc.) saranno verificati per l applicazione in diagnostica predittiva, al fine di intervenire con metodi di lotta prima della manifestazione sintomatologica della malattia, durante le prime fasi di colonizzazione del batterio nella pianta ospite. Avvalendosi dei risultati ottenibili dalla sperimentazione sopra indicata possono essere affinate diverse tecniche PCR: qrt-pcr Si propone di affiancare alla tradizionale tecnica qualitativa di PCR anche un sistema quantitativo di Real-Time PCR al fine di analizzare in dettaglio le fasi di infezione del batterio e il livello di inoculo presente in pianta, in lotti di materiale vivaistico, in campo: tale tecnica è fondamentale per poter distinguere in pianta la presenza di batterio vivo o morto.

18 BIO-PCR Questa tecnica si avvale di un passaggio preliminare che prevede l isolamento/arricchimento su un terreno, possibilmente semi-selettivo, seguito dall applicazione di metodiche PCR-based. Tale tecnica è fondamentale per poter distinguere la presenza, nei materiali vegetali in analisi, di batterio vivo o morto. LAMP-PCR Parallelamente si rende necessario avere un tool diagnostico molecolare basato su PCR di facile attuazione quale un sistema LAMP-PCR (Loop Mediated Isothermal Amplification) o analoghi, da rendere disponibile a personale tecnico non specializzato. Diagnosi ceppo-specifica e specie-specifica e sviluppo di metodologie diagnostiche. Tali tecniche PCR-based possono inoltre essere adattate per l impostazione di una diagnosi differenziale finalizzata al riconoscimento di diversi isolati di Pseudomonas syringae pv. actinidiae e per altre specie patogene del genere Pseudomonas. Si proporrà un protocollo di analisi basato su PCR da adottare a livello ufficiale per i laboratori accreditati preposti alla certificazione del materiale vivaistico e come diagnostica di materiale infetto. L attività dovrà tenere una stretta interfaccia con le linee di azione presenti nel progetto ACTINIDIA e ACTISANA. Analisi di diffusione della malattia sul territorio nazionale La struttura di CSO prevede una sezione Statistica e Osservatorio di Mercato, attraverso la quale svolge fin dal 1998 un attività di monitoraggio del sistema produttivo e commerciale, relativamente alle principali specie frutticole, kiwi, mele, pere, pesche e nettarine e, da alcuni anni, anche relativamente alle orticole. In questo ambito CSO ha maturato una consolidata esperienza nel campo delle indagini campionarie sulla produzione, sull evoluzione degli impianti, sui costi di produzione e sul monitoraggio dell andamento del mercato estero e del mercato interno. L obiettivo delle attività è quello di fornire un supporto tecnico e un coordinamento per arrivare alla definizione di una strategia nazionale più idonea per contrastare la diffusione del batterio, concordata tra i produttori di kiwi nelle principali regioni italiane. Gli obiettivi specifici delle diverse attività previste sono i seguenti: 1) la creazione del catasto dei produttori di kiwi a livello nazionale ha lo scopo di fornire una reale fotografia della situazione, con aggiornamenti in tempo reale della diffusione e della gravità della malattia, che consenta di adattare di volta in volta le strategie più idonee al sistema produttivo per contrastare la malattia stessa. 2) la creazione del sito internet ha l obiettivo di razionalizzare e coordinare le informazioni disponibili sulla coltivazione e sulla malattia anche al di fuori dei confini nazionali. Il sito permetterà inoltre un interfaccia fra i diversi soggetti coinvolti che metteranno a disposizione le esperienze reciproche. 3) lo studio economico previsto ha come obiettivo quello di calcolare economicamente il danno reale che può provocare lo sviluppo della malattia sugli impianti di kiwi, in termini di abbattimento, capitozzatura, difesa eccetera e conseguentemente calcolare le ricadute economiche dirette sull economia agricola. 4) il calcolo degli indennizzi offrirà agli enti preposti uno strumento per calcolare in modo consono l eventuale indennizzo per abbattimento 5) la raccolta di informazioni sulla diffusione della malattia a livello europeo ed internazionale avrà il compito di ampliare le conoscenze relativamente allo sviluppo del batterio e condividere le esperienze. BIBLIOGRAFIA ESSENZIALE Balestra G.M., A. Mazzaglia, R. Spinelli, S. Graziani, A. Quattrucci, A. Rossetti, (2008). Cancro batterico su Actinidia chinensis. L'Informatore Agrario 38, G.M. Balestra, M. Renzi and A. Mazzaglia, First report of bacterial canker of Actinidia deliciosa caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Portugal. New Disease Reports (2010) 22, 10. Ferrante P. e Scortichini M., (2009). Identification of Pseudomonas syringae pv. actinidiae as causal agent of bacterial canker of yellow kiwifruit (Actinidia chinensis Planchon) in central Italy. Journal of Phytopathology, 1-3 (doi: /j ). Ferrante P., Scortichini M Molecular and phenotypic features of Pseudomonas syringae pv. actinidiae isolated during recent epidemics of bacterial canker on yellow kiwifruit (Actinidia chinensis) in central Italy. Plant Pathology Doi /j x Gallelli A., L Aurora A. and Loreti S., Gene sequence analysis for the molecular detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae: developing diagnostic protocols. Journal of Plant Pathology, in press. Koh JK, Cha BJ, Chung HJ, Lee DH, (1994). Outbreak and spread of bacterial canker in kiwifruit. Korean Journal of Plant Pathology 10:

19 Mazzaglia A., M. Renzi, G. M. Balestra, Comparison and utilization of different PCR-based approaches for molecular typing of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains from Italy. Canadian Journal of Plant Pathology: 33, Scortichini M., Occurrence of Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Italy. Plant Pathology 43: Serizawa S, Ichikawa T, Takikawa Y, Tsuyumu S, Goto M. (1989). Occurrence of bacterial canker of kiwifruit in Japan: description of symptoms, isolation of the pathogen and screening of bactericides. Annals of the Phytopathological Society of Japan 55: Rees-George J., J. Vanneste, D.A. Cornish, I.P.S. Pushparajah, J. Yu, M.D. Templeton, K.R.Everett, Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae using polymerase chain reaction (PCR) primers based on the 16S-23S rdna intertrascribed spacer region and comparison with PCR primers based on other gene regions. Plant Pathology, 59, Takikawa Y., Serizawa S., Ichikawa T. (1989) Pseudomonas syringae pv. actinidiae pv. nov.: the causal bacterium of canker of kiwifruit in Japan. Annals of the Phytopathological Society of Japan 55, Vanneste J.L., Yu J., Cornish D.A., Molecular characterization of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains isolated from the recent outbreak of bacterial canker of kiwifruit in Italy. New Zealand Plant Protection 63: Spinelli F., Donati I., Vanneste J.L., Costa M. and Costa G Real time monitoring of the interactions between Pseudomonas syringae pv actinidiae and Actinidia species. 7th International Kiwifruit Symposium, September Faenza (Italy). Vanneste J.L., Cornish D.A., Yu J, Callum K., Onorato R., Shane M. and Spinelli F Recent Advances in the Characterisation and Control of Pseudomonas syringae pv actinidiae, the Causal Agent of Bacterial Canker on Kiwifruit. 7th International Kiwifruit Symposium, September Faenza (Italy). Vanneste J.L., Giovanardi D., Yu J., Cornish D.A., Kay C., Spinelli F. and Stefani E. (2011). Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae in kiwifruit pollen samples. NZPPs (in press). Prado, M. J., Gonzalez, M. V.,.Romo, S., and M.T.Herrera, M. T Adventitious plant regeneration on leaf explants from adult male kiwifruit and AFLP analysis of genetic variation Plant Cell Tiss Organ Cult, 88, Shi,T., H.Huang, and M.S.Barker Ancient genome duplications during the evolution of kiwifruit (Actinidia) and related Ericales. Ann. Bot. 106: Pedley,K.F., andg.b.martin Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annu. Rev. Phytopathol. 41: Fraser,L.G., M.A.McNeilage, G.K.Tsahg, H.N.De Silvia, and E.A.MacRae The Use Of Est-Derived Microsatellites As Markers In The Development Of A Genetic Map In Kiwifruit. Acta Horticulturae 753: O'Brien,H.E., D.Desveaux, and D.S.Guttman Next-generation genomics of Pseudomonas syringae. Curr. Opin. Microbiol.14:24-30.

20 Ricadute e benefici del progetto 12 L individuazione della probabile diversa suscettibilità del materiale genetico a disposizione nel nostro paese e di quello eventualmente reperibile durante lo svolgimento del progetto consentirà di impostare nuovi programmi di miglioramento genetico volti a produrre liee meno suscettibili se non resistenti a diverse razze del patogeno. Qualora individuate, le resistenze genetiche saranno incluse attraverso un mirato piano di incroci, nelle liee più promettenti dell attuale patrimonio di germoplasma. L aggiornamento delle metodiche di diagnosi per il rilevamento specifico e sensibile di Psa è una esigenza sia delle strutture di ricerca che effettuano studi di tipo epidemiologico (infezione, colonizzazione e diffusione del patogeno), che dei Servizi Fitosanitari che effettuano analisi di materiali sintomatici e asintomatici e che necessitano di metodi robusti e affidabili. Tale esigenza è inoltre fortemente sentita al fine di definire le metodiche più idonee per l analisi di materiale vegetale asintomatico sottoposto a certificazione fitosanitaria. L analisi di frutti asintomatici rappresenta una indagine importante al fine di scongiurare il rischio di commercializzazione di frutti infetti e/o contaminati dal batterio e per salvaguardare la filiera di produzione dell actinidia già fortemente colpita dalla gravità della malattia. Le indagini di metagenomica e trascrittomica proposte in questa ricerca, rappresentano una fase necessaria per comprendere come sfruttare le potenzialità di resistenza presenti in tutte le piante anche quelle definite geneticamente suscettibili. In particolare, l individuazione di induttori di resistenza efficaci per il contenimento dell infezione di Psa nel sistema saggio biologico, aprirebbe la strada ad una sperimentazione in pieno campo e qualora l effetto fosse confermato, sarebbe di grande utilità per integrare le attuali misure di lotta alla malattia. Con le acquisizioni derivate da diagnosi, epidemiologia e sperimentazione su induzione di resistenza, si potranno tracciare interventi tecnico-agronomici atti a prevenire e/o controllare la diffusione del cancro batterico. La costituzione di un database di riferimento arricchito in geni che sono alla base dei sistemi di allarme della pianta è di grande utilità in quanto di supporto per analisi di RNAseq quantitative ed altre analisi molecolari mirate allo studio della interazione pianta-patogeno (micro-array, Real-Time PCR etc.). La creazione del catasto nazionale permetterà inoltre anche la realizzazione di una mappa della malattia, che potrebbe essere di ausilio ai Servizi Fitosanitari regionali per effettuare controlli e visite mirati. In questo modo le Regioni stesse potrebbero prendere come riferimento le aziende inserite nel catasto stesso per gli eventuali indennizzi Ostacoli prevedibili ed azioni correttive Le attività previste dalle linee di ricerca qui esposte consentiranno di ottimizzare gli interventi preventivi e curativi nei confronti del cancro batterico dell actinidia. Infatti, le conoscenze sulla struttura di popolazione del patogeno e del suo ciclo di malattia nei confronti della pianta-ospite permetteranno di intervenire in campo nei momenti-chiave per ridurre notevolmente le capacità di diffusione del patogeno all interno e tra i frutteti. L analisi metagenomica potrebbe non trovare applicazione nel confronto fenotipo suscettibile/resistente qualora non fossero individuate piante di actinidia mostranti fenotipi di resistenza alla malattia. In tal caso l attività del progetto fornirebbe comunque un sistema di analisi metagenomica che troverà immediata applicazione non appena verranno individuati piante fenotipicamente resistenti. Nella attività di screening di fattori in grado di indurre resistenza, un punto cruciale è lo sviluppo di un saggio biologico rapido e ripetibile basato su una tecnica di inoculazione efficace nel riprodurre, in maniera rapida, chiari sintomi di malattia. Infatti, la riproduzione artificiale dei sintomi, in patologia vegetale, non è mai un fatto scontato, anche per le malattie più gravi, poiché ogni patogeno (anche i primari) agiscono di concerto con fattori abiotici noti o non noti. Nel contesto del saggio biologico la riproduzione dei sintomi (pur ampiamente dimostrata per la Psa) deve essere rapida e intensa, quindi devono essere finemente modulate le condizioni di inoculazione in maniera da permettere questo. La messa a punto richiede anche l identificazione delle concentrazioni a cui vanno effettuati i trattamenti, il tempo necessario affinchè la SAR si instauri e che deve intercorrere tra il trattamento e inoculazione. Tutto ciò potrebbe richiedere più tempo del previsto e tale lungaggine riflettersi in una diminuzione del numero di induttori di resistenza sperimentati a valle.

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