CONSUNTIVO DELLA RICERCA SCIENTIFICA

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1 UNIVERSITÀ DI MILANO CENTRO DINO FERRARI PER LA DIAGNOSI E LA TERAPIA DELLE MALATTIE NEUROMUSCOLARI E NEURODEGENERATIVE FONDAZIONE I.R.C.C.S. CA GRANDA OSPEDALE MAGGIORE POLICLINICO FONDAZIONE DI RICOVERO E CURA A CARATTERE SCIENTIFICO DI NATURA PUBBLICA CONSUNTIVO DELLA RICERCA SCIENTIFICA 2014 DIRETTORE PROF. NEREO BRESOLIN Via F. Sforza, Milano Tel Fax

2 SEZIONI DEL CENTRO DINO FERRARI LABORATORIO RADIOISOTOPI DI BIOCHIMICA E GENETICA Pag. 3 LABORATORIO DI NEUROIMMUNOLOGIA CLINICA Pag. 29 LABORATORIO CELLULE STAMINALI NEURALI Pag. 41 U.O.S.D. MALATTIE NEURODEGENERATIVE Pag. 55 LABORATORIO DI CELLULE STAMINALI Pag. 69 U.O.S.D. MALATTIE NEUROMUSCOLARI E RARE Pag. 81 SEDE DISTACCATA DEL CENTRO DINO FERRARI PRESSO U.O.NEUROLOGIA STROKE UNIT E LABORA- TORIO DI NEUROSCIENZE UNVERSITA DEGLI STUDI DI MILANO I.R.C.C.S. ITITUTO AUXOLOGICO ITALIANO Pag. 95 SEDE DISTACCATA DEL CENTRO DINO FERRARI PRESSO IL LA BORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE, CITOGENETICA, ANALISI BIOCHIMICO-CLINICHE, BIOINFORMATICA I.R.C.C.S. E. MEDEA Pag. 117

3 LABORATORIO RADIOISOTOPI DI BIOCHIMICA E GENETICA Responsabile: Prof. Giacomo P. Comi, Professore Associato Medici: Dott.ssa Stefania Corti Dott.ssa Francesca Magri Dott. Alessio Di Fonzo Dott.ssa Sara Bonato Dott.ssa Michela Ranieri Dott.ssa Alessandra Govoni Dott.ssa Giulietta Riboldi Dott.ssa Simona Brajkovic Dott.ssa Roberta Brusa Biologi: Dott. Roberto Del Bo Dott.ssa Sabrina Lucchiari Dott.ssa Sabrina Salani Dott.ssa Gianna Ulzi Dott.ssa Domenica Saccomanno Dott.ssa Daniela Piga Biotecnologi: Dott. Dario Ronchi Dott.ssa Serena Pagliarani Dott.ssa Mafalda Rizzuti Dott.ssa Valentina Melzi Tecnici: Sig.ra Andreina Bordoni Sig. Francesco Fortunato 3

4 PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA 2014 STUDIO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI Nel corso del 2014 il Laboratorio di Biochimica e Genetica del Centro Dino Ferrari diretto dal professor Giacomo Pietro Comi ha continuato le indagini molecolari e biochimiche in pazienti pediatrici e adulti affetti da malattie riconducibili a un difetto nel metabolismo ossidativo. In particolare, è stata riesaminata l intera casistica di pazienti affetti da miopatia caratterizzata da accumulo di DNA mitocondriale parzialmente difettivo (sindromi da delezioni multiple del DNA mitocondriale). Questa revisione delle caratteristiche cliniche, biochimiche e molecolari ci ha consentito di evidenziare elementi peculiari associati a mutazioni negli stessi geni o nelle proteine appartenenti ai medesimi pathways. Il database che ne è derivato, costituisce la base per la ricerca razionale (gene candidato) oppure unbiased (next-generation sequencing) per la ricerca di ulteriori cause molecolari. Un altro dei temi affrontati riguarda come la disfunzione mitocondriale contribuisca alla patogenesi di malattie neurodegenerative dell adulto come la Sclerosi Laterale Amiotrofica o l Atrofia Multisistemica. 1) Malattie mitocondriali associate ad accumulo di delezioni multiple del mtdna: patogenesi molecolare e variabilità fenotipica Le malattie mitocondriali presentano una grande eterogeneita nelle manifestazioni fenotipiche e nei meccanismi eziopatogenetici a essi sottesi. La variabilita della clinica e la non specificita della maggior parte dei marcatori disponibili rendono difficoltoso per il clinico la definizione della diagnosi e della prognosi sia nell adulto che nel bambino. Negli ultimi 20 anni numerosi difetti in geni nucleari codificanti per proteine coinvolte nell omeostasi del DNA mitocondriale (mtdna) sono stati associati a reperti peculiari, come l accumulo muscolare di delezioni multiple del mtdna, osservabile mediante specifici saggi di Southern blot e di PCR. In questo lavoro, sono stati studiati 133 pazienti di eta compresa tra i 15 e 85 anni afferenti presso il Centro Dino Ferrari negli ultimi 20 anni con una clinica suggestiva di malattia mitocondriale e documentato accumulo di delezioni multiple nel muscolo. I dati clinici, genetici, biochimici e istologici disponibili sono stati organizzati in un database per valutare l eventuale presenza di correlazioni genotipo-fenotipo. E stato poi eseguito uno studio approfondito del DNA mitocondriale muscolare attraverso metodiche tradizionali e quantitative per identificare dei pattern tipici predittivi di coinvolgimento di un singolo gene o gruppo di geni. Quest analisi ha consentito di correlare specifiche alterazioni del DNA 4

5 mitocondriale a specifici difetti molecolari. Questi risultati potrebbero essere utili per individuare mutazioni causative in nuovi geni anche nel gruppo di pazienti attualmente privi di diagnosi. Infine, le informazioni raccolte nel database hanno guidato la selezione di un gruppo di pazienti in cui effettuare lo screening dei geni SPG7 e CHCD10, recentemente associati a malattie neurodegenerative con alterata omeostasi del DNA mitocondriale, individuando una mutazione recessiva in SPG7 in uno di essi. Pubblicazioni su riviste internazionali Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Donati A, Minetti C, Moggio M, Mongini T, Servidei S, Tonin P, Toscano A, Uziel G, Bruno C,Ienco EC, Filosto M, Lamperti C, Catteruccia M, Moroni I, Musumeci O, Pegoraro E, Ronchi D, Santorelli FM, Sauchelli D, Scarpelli M, Sciacco M, Valentino ML, Vercelli L, Zeviani M, Siciliano G. The m.3243a>g mitochondrial DNA mutation and related phenotypes. A matter of gender? J Neurol Mar;261(3): doi: /s Abstract presentati a congressi internazionali Ronchi D., SciaccoM., Bordoni A., Colombo I., Piga D., Fortunato F., Moggio M., Comi G.P. The novel non-sense mutation m.4214g>a in MT-ND1 results in mitochondrial myopathy with severe complex I deficiency 19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin, Germany. Abstract presentati a congressi nazionali Ronchi D., Ahmed N., Di Fonzo A., Bordoni A., Piga D., Rizzuti M., Melzi V., Corti S., Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. The application of next-generation sequencing in the discovery of novel genetic defects in adult patients affected by mitochondrial disorders featuring muscle mtdna instability. Il sequenziamento di nuova generazione in genetica umana e medica. Convegno nazionale della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU), Ottobre 2014 Bologna. Ronchi D., Di Fonzo A. Ahmed N., Piga D., Bordoni A., Rizzuti M., Corti S., Bresolin N., Comi G.P. In-depth analysis of muscle mitochondrial DNA in adult onset disorders featuring mitochondrial genome instability. 2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano. 2) Il ruolo del metabolismo del Coenzima Q10 nell Atrofia Multisistemica (MSA) L atrofia multisistemica (MSA) è una malattie neurodegenerativa ad eziologia ignota, caratterizzata dalla perdita delle funzione autonome in combinazione con parkinsonismo poco 5

6 responsivo alla Levodopa, disfunzione cerebellare e segni piramidali. Mutazioni recessive nel gene COQ2, che codifica per un enzima coinvolto nella biosintesi del Coenzima Q10, sono state recentemente descritte in un singolo studio come possibili cause nelle forme familiari e sporadiche di MSA. Abbiamo deciso di analizzare il gene COQ2 in una corte di 14 pazienti con diagnosi di MSA probabile (tipo P: 2 casi familiari e 12 apparentemente sporadici) e 6 pazienti sporadici con MSA di tipo C. Questo screening ci ha consentito di individuare uan nuova variante omozigote (p.a43g) in un paziente italiano sporadico con MSA-C, assente nei controlli. In più abbiamo evidenziato la variante eterozigote p.n180s in un singolo paziente con MSA-P. Questa variante cade in un dominio transmembrana precedentemente implicato in malattie con alterato metabolismo del Coenzima Q10. Un set di saggi molecolari, proteici e biochimici (in collaborazione con il Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie dell Universita di Bologna, prof.sa Fato) ci ha permesso di analizzare le conseguenze di queste varianti in tessuti umani patologici e di controllo. Siamo arrivati alla conclusione che la variante omozigote identificata non ha particolari effetti funzionali sulla espressione del gene COQ2, la maturazione della proteina o la biosintesi di Coenzima Q10. La nostra esperienza ci porta a dire che mutazioni nel gene COQ2 non rappresentano una causa comune di MSA nei pazienti familiari e sporadici con MSA nella popolazione italiana, parimenti a quanto osservato da altri ricercatori in altri gruppi di pazienti. Abstract presentati a congressi internazionali Ronchi D., Bonato S., Di Biase E., Melzi V., Trezzi I., Corti S., Bresolin N., Comi G.P., Di Fonzo A. Mutational analysis of COQ2 in Italian patients with MSA. American Academy of Neurology 66th Annual Meeting, April 26 to May 3, 2014 in Philadelphia, PA, USA. ASPETTI GENETICI NELLE AMIOTROFIE SPINALI (SMA) Il Laboratorio di Biochimica e Genetica è un punto di riferimento nazionale per la diagnosi dell Amiotrofia Spinale 5q (SMA5q) e ha partecipato negli ultimi anni anche alla definizione di nuovi difetti molecolari associati ad altre forme di amiotrofia spinale. Nel corso del 2014 abbiamo descritto una nuova e rara variante di splicing nel gene SMN1 e abbiamo concluso lo studio, iniziato nel 2010, sul coinvolgimento del gene MAPT (proteina Tau) in una forma ad esordio adulto di amiotrofia spinale. 1) Una nuova mutazione di splicing in SMN1 determina un fenotipo di SMA-I molto grave in un paziente italiano. 6

7 In questo case report abbiamo identificato un genotipo piuttosto insolito nella SMA5q che è classicamente associata a delezioni omozigoti nel gene SMN1 oppure alla presenza di una delezione in eterozigosi composita con una variante missense. Gli effetti delle varianti puntiformi sono difficilmente prevedibili e ancora più rari sono i contributi che hanno per oggetto varianti di splicing. Abbiamo descritto una nuova mutazione nel gene SMN1 che interessa il sito donatore di splicing dell esone 7. Analisi del trascritto condotte su RNA estratto da linfociti hanno permesso di chiarire il grave effetto di questa variante che impedisce in modo quasi assoluto l inclusione dell esone 7 nell mrna del paziente. La presenza di una sola copia di SMN2 non è in grado di compensare di questo difetto e porta ad una forma aggressiva di SMA con esordio o precoce e esito fatale a 4 mesi. Pubblicazioni su riviste internazionali Ronchi D, Previtali SC, Sora MG, Barera G, Del Menico B, Corti S, Bresolin N, Comi GP. Novel Splice-Site Mutation in SMN1 Associated with a very Severe SMA-I Phenotype. J Mol Neurosci Jan 9. [Epub ahead of print] Abstract presentati a congressi internazionali Ronchi D., Ripolone M., Barca E., Berardinelli A., Mora M., Morandi L., Bordoni A., Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Vallejo D., Corti S, Toscano A., Sciacco M., Di Mauro S., Comi G.P., Moggio M.. Defective muscle mitochondrial biogenesis in spinal muscular atrophy American Academy of Neurology 66th Annual Meeting, April 26 to May 3, 2014 in Philadelphia, PA, USA. Ronchi D., Previtali S., Magri F., Corti S., Comi G.P. A novel splice-site mutation in SMN1 resulting in a very severe SMA1 phenotype 19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin, Germany. Abstract presentati a congressi nazionali Ronchi D., Ripolone M., Rizzuti M., Bordoni A., Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Corti S., Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. Defective muscle mitochondrial biogenesis and delayed muscle maturation in spinal muscular atrophy 2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano Ripolone M., Ronchi D., Violano R., Vallejo D., Fagiolari G., Lucchini V., Barca E., Berardinelli A., Ballottin U., Morandi L., Mora M., Toscano A., Grimoldi N., Tiberio F., Bordoni A., Fortunato F., Corti S., Di Mauro S., Comi G.P., Sciacco M., Moggio M. Muscle mitochondrial dysfunction due to defective mitochondrial biogenesis in SMA patients. 7

8 XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione ) Una nuova mutazione nel gene MAPT associata ad una forma ad esordio adulto di amiotrofia spinale senza demenza in una grande famiglia italiana. Le probande da cui è partito lo studio sono due sorelle, ampiamente caratterizzate da un punto di vista clinico. Cause molecolari in geni noti potenzialmente responsabili della loro condizione sono state escluse mediante sequenzialmente diretto. Attraverso un analisi di linkage effettuata con microarray genomici, abbiamo individuato una regione del cromosoma 17 quale locus candidato principale. In questa regione trova sede il gene MAPT, codificante per la proteina TAU. La proteina TAU integra la struttura dei neuroni, stabilizzando il sistema dei microtubuli. Mutazioni nella proteina TAU sembrano perturbare l'architettura dei neuroni, interferendo con i fenomeni di comunicazione e scambio fra le cellule nervose. Mutazioni nel suo gene codificante sono state associate a numerosi fenotipi ma in particolare a demenza frontotemporale (FTD, MIM#600274), una forma relativamente rara di demenza, che colpisce in genere pazienti con una fascia di età precoce rispetto alla malattia di Alzheimer e generalmente compresa fra i 50 ed 60 anni di età. La sequenza del gene MAPT nei soggetti affetti della famiglia attualmente studiata ha portato alla identificazione di una nuova variante nell esone 12 del gene MAPT. Questa variante segrega con la malattia ed è assente in più di 300 cromosomi controllo della popolazione italiana. Abbiamo allestito linee cellulari di neuroblastoma e cellule NSC34 che sono state stabilmente trasfettate con un vettore per l espressione di MAPT (4R e 3R) wildtype e mutata. Dopo l induzione di un fenotipo neuronale abbiamo eseguito analisi proteiche mediante western blot e studi di immunocitochimica. Le cellule che esprimono la forma mutata sembrano manifestare una riduzione del processo di accrescimento dei neuriti e una ridotto localizzazione tra Tau e microtubuli. Un saggio per studiare il binding tra la proteina mutata e il network microtubulare non ha evidenziato particolari effetti in presenza della mutazione mentre lo studio di specifici marcatori proteici ci ha consentito di ipotizzare la riduzione della clearence mediata dal proteasoma della proteina mutata. Lo studio neuropatologico di una delle probande ci ha consentito di definire meglio gli aspetti qualitativi e quantitativi della morte moto neuronale osservata in questa peculiare forma di taupatia. Reference Pubblicazioni su riviste internazionali Di Fonzo A, Ronchi D, Gallia F, Cribiù FM, Trezzi I, Vetro A, Della Mina E, Limongelli I, Bellazzi R, Ricca I, Micieli G, Fassone E, Rizzuti M, Bordoni A, Fortunato F, Salani S, Mora 8

9 G, Corti S, Ceroni M, Bosari S, Zuffardi O, Bresolin N, Nobile-Orazio E, Comi GP. Lower motor neuron disease with respiratory failure caused by a novel MAPT mutation. Neurology Jun 3;82(22): ASPETTI GENETICI NELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA 1) Screening del gene CHCHD10 in pazienti familiari e sporadici con SLA, FTD e SLA- FTD. Alcuni recenti lavori hanno identificato mutazioni nel gene CHCHD10 causative di vari tipi di malattie del motoneurone e, in particolare, di SLA con segni di demenza. CHCHD10 codifica per una proteina dello spazio mitocondriale transmembrana, coinvolta nell assemblaggio della catena respiratoria. Lo studio originale identifica una mutazione in una famiglia francese con SLA-FTD, segni cerebellari e ipoacusia neurosensoriale. Ulteriori mutazioni sono state poi osservate in casi familiari tedeschi, finlandesi e nord americani così come in pazienti sporadici, prevalentemente bulbari. CHCHD10 è stato anche coinvolto in una forma ad esordio adulto di amiotrofia spinale e in un caso familiare di miopatia mitocondriale apparentemente pura. Dato che alcuni anni fa abbiamo evidenziato come la disfunzione mitocondriale muscolare sia un reperto comune nella SLA sporadica (talvolta in grado di precedere la disfunzione motoneuronale), abbiamo deciso di investigare CHCHD10 in 222 pazienti sporadici (11 dei quali con SLA-FTD), 16 casi familiari di SLA e 1 caso familiare di SLA-FTD. Abbiamo identificato la nuova variante eterozigote c.239c>t (p.pro80leu) in un paziente con fenotipo SLA flail arm con esordio a 25 anni che è evoluto nel corso di 8 anni in una tetraparesi grave con coinvolgimento respiratorio. L analisi del muscolo bioptico ha evidenziato una grave riduzione dei complessi della catena respiratoria, il deficit istologico di Citocromo C Ossidasi ma inalterato DNA mitocondriale. Questa variante è stata anche osservata in un paziente con una forma classica di SLA. Infine abbiamo identificato la variante p.p34s in una donna di 75 anni con SLA e deficit cognitivo. Il nostro studio conferma la modesta ma non trascurabile incidenza delle mutazioni nel gene CHCHD10 anche nei pazienti italiani con SLA o SLA-FTD sporadica. Questa incidenza è lievemente inferiore rispetto a quella descritta in altri lavori (1,4% contro 2,6%). Inoltre varianti nel gene CHCHD10 rafforzano il legame tra disfunzione mitocondriale e malattia del motoneurone e, di fatto, costituiscono la prima causa diretta di danno mitocondriale nella SLA. Altri studi sono necessari per capire come questi difetti producano la morte del moto neurone e possano originare fenotipi anche molto differenti. Pubblicazioni su riviste internazionali 9

10 Ronchi D, Riboldi G, Del Bo R, Ticozzi N, Scarlato M, Galimberti D, Corti S, Silani V, Bresolin N, Comi GP. CHCHD10 mutations in Italian patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Brain Jan 8. pii: awu384. [Epub ahead of print] 2) Identificazione del nuovo gene malattia TUBA4A Lo studio condotto su 363 casi indice affetti da SLA familiare mediante analisi exome wide di varianti rare ha evidenziato un numero di varianti in TUBA4A, gene codificante per la proteina Tubulina Alpha 4A. L'exome sequencinq ha rivelato un totale di 5 mutazioni non sinonime in TUBA4A, tutte localizzate nell'esone 4 e confermate da sequenziamento diretto in Sanger, nessuna di esse identificata nei controlli e tutte localizzanti in posizioni altamente conservate della proteina. Tra le mutazioni vi sono due mutazioni missenso nello stesso residuo (R320C/H) ed una mutazione nonsenso (W407X) che determina la assenza degli ultimi 41 amminoacidi: tale regione C-terminale prende contatto con la subunità beta-tubulina così come con il dominio delle chinesine e con altre proteine associate ai microtubuli. Solamente tre cambiamenti non sinonimi sono stati osservati nei 4300 controlli, tutti stimati essere benigni. Analisi mediante sequenziamento di ulteriori 272 casi di SLA familiare e 5510 controlli interni ha rilevato un eccesso significativo di portatori della mutazione fra i pazienti: la analisi combinata sulle coorti di identificazione e di replicazione ha rivelato una overespressione statisticamente significativa di rare varianti; delle due mutazioni osservate nella coorte di replica, la variante T145P ha segregato con la malattia in una famiglia, mentre una variante K430N non è stata identificata in un primo cugino affetto del probando sequenziato, suggerendo che questo è anche un polimorfismo neutro. Non sono state identificate mutazioni in TUBA4A in 131 campioni SLA con mutazioni/espansioni di repeats noti. Tutti i pazienti recanti le mutazioni TUBA4A avevano un onset spinale, classica SLA, con segni del primo e del secondo motoneurone; due casi hanno anche sviluppato declino cognitivo di tipo frontale, in linea con una diagnosi di FTD. La capacità di aggregazione dei mutanti di TUBA4A è stata valutata mediante l'espressione di costrutti di TUBA4A emoagglutinina (HA)-tagged in motoneuroni primari (PMNs) e in cellule HEK293: la variante W407X non si incorpora nel network di microtubuli e forma piccole inclusioni citoplasmatiche ubiquitinate in circa il 40% dei PMNs e in circa l'85% delle HEK293; l'immunoistochimica di tessuto cerebrale e di midollo spinale derivanti da pazienti SLAs (senza mutazioni) non ha identificato aggregati di TUBA4A. Non è nemmeno stata osservata co-aggregazione in cellule coesprimenti un frammento C-terminale di TDP-43 prono all'aggregazione insieme a TUBA4A wild type. Mentre gli altri mutanti di TUBA4A 10

11 formano aggregati nel 10-30% delle HEK293, non si hanno aggregati di tali mutanti nei PMNs ma solo alterazioni nella loro distribuzione (come ad esempio un più diffuso staining rispetto alla proteina wild-type, che è principalmente incorporata nel network di microtubuli). E' stata dunque indagata la capacità di TUBA4A mutante di formare efficientemente microtubuli mediante un sistema cell-free, per quantificare la sua incorporazione in dimeri di alfa-beta tubulina. Ogni mutante è stato sottoposto a traduzione in vitro (lisato di reticolociti di coniglio); i prodotti sono poi stati analizzati su gel elettroforesi in condizioni denaturanti per misurare l'incorporazione della proteina in dimeri di tubulina: la variante TUBA4AW407X non ha prodotto dimeri distinguibili, mentre la A383T e R320 hanno mostrato livelli significativamente più bassi di assemblaggio rispetto alla proteina wild-type; gli altri mutanti non hanno differito dal controllo. In parallelo è stata testata l'incorporazione di TUBA4A mutante in microtubuli in cellule in coltura (cellule astrogliali primarie), effettuando un'analisi dell'incorporazione dei costrutti TUBA4A (HA)-tagged; la frazione fra le intensità di fluorescenza dei filamenti rispetto allo staining totale, che va da 0 a 1, è stato usato per categorizzare ogni cellula come affetta da fenotipo normale (1-0,75), moderato (0,75-0,5), o grave (0,25-0). La proteina wild-type ha prodotto circa il 70% di cellule con alto livello di incorporazione di microtubuli, a differenza dei diversi mutanti di TUBA4A che hanno mostrato alterata incorporazione in microtubuli, in particolare la TUBA4AW407X, che ha anche determinato la produzione di multiple inclusioni simil-aggregati. Dalle analisi funzionali emerge che le TUBA4A mutate destabilizzano il network dei microtubuli, diminuendo la capacità di ri-polimerizzazione. Queste evidenze enfatizzano ulteriormente il ruolo patogenetico dei difetti del citoscheletro nella SLA e la potenzialità di analisi gene-based di varianti rare in situazioni in cui geni causali non riescono ad essere identificati tramite le tradizionali analisi di segregazione. In conclusione, quindi, le varianti di TUBA4A associate alla malattia interessano residui conservati della proteina; risultati ottenuti dalla caratterizzazione biologica hanno fornito una forte evidenza che supporta l'effetto deleterio della maggior parte delle varianti: in particolare, le varianti SLAf-associate hanno la caratteristica di formare in modo non efficiente dimeri di alfa/beta tubulina in vitro, vi è una diminuzione di incorporazione nei microtubuli in colture cellulari, inibizione dell'assemblaggio del network di microtubuli e riduzione della stabilità strutturale. Sulla base di queste informazioni, dunque, mutazioni in TUBA4A sembrano distruggere la dinamica dei microtubuli e la stabilità attraverso un meccanismo dominantenegativo, come dimostrato attraverso la valutazione della abilità di cellule COS7 trasfettate di ripristinarsi dopo depolimerizzazione transiente di microtubuli. Per questo saggio sono state 11

12 comparate le proteine wild-type, mutante R320C e mutante W407X, queste ultime due associate rispettivamente a fenotipo intermedio e severo. Mentre l'80% delle cellule trasfettate con TUBA4A wild-type hanno formato centrosomi positivi per la proteina TUBA4A (HA)- tagged entro 5 minuti dalla rimozione di noncodazolo, solo il 20% di cellule trasfettate con TUBA4AR320C hanno formato nuovi microtubuli contenenti la proteina mutante a 15 minuti. L'espressione di TUBA4A mutante ha anche interferito con la capacità da parte della proteina endogena di formare microtubuli; risultati simili si sono osservati in cellule contenenti aggregati TUBA4AW407X-positivi, mentre, al contrario, cellule esprimenti il mutante TUBA4AW407X senza la presenza di aggregati non hanno mostrato alcun difetto nel rate di ripolimerizzazione dei microtubuli. Questi risultati suggeriscono che la TUBA4A mutante può distruggere la dinamica dei microtubuli attraverso un meccanismo dominantenegativo (tramite incorporazione nei microtubuli). Tuttavia, la mutazione troncante TUBA4AW407X conferisce incapacità nel formare i dimeri o nell'incorporarli nel network di microtubuli: questo è evidenziato dalla osservazione secondo cui in cellule esprimenti la mutazione troncante TUBA4AW407X senza aggregati non sembra esserci un evidente difetto nella ripolimerizzazione dei microtubuli, suggerendo che questo può avere una diminuita capacità di agire come dominante-negativo. Comunque, dal momento che la variante TUBA4AW407X mostra tendenza all'aggregazione analogamente ad altre proteine mutanti associate a SLA, il suo effetto deleterio potrebbe esprimersi attraverso un diverso meccanismo, come ad esempio il sequestro in aggregati di proteine tubulina-binding o attraverso sovraccarico del sistema ubiquitino-proteasoma. Mutazioni in almeno sette altri membri della famiglia di tubuline (TUBA1A, TUBA8, TUBB2B, TUBB4A e TUBG1) sono state descritte causare diversi disordini del neurosviluppo e neurodegenerativi. La proteina TUBA4A è ubiquitariamente espressa nei tessuti umani, ma in modo maggiore nel cervello (Rustici et al., 2013). Nonostante sia stata evidenziata una downregolazione dei geni della subunità alfa tubulina nei motoneuorni di pazienti SLA sporadici (Jiang et al., 2005), fino ad ora non è stato descritto un ruolo specifico per TUBA4A nei motoneuroni. TUBA4A si aggiunge quindi ad altri geni associati a SLA codificanti per proteine del citoscheletro, come PFN1, DCTN1, PRPH e NNEFH, rafforzando così l'ipotesi che alterazioni che interessano l'architettura e la dinamica del citoscheletro esercitano un importante ruolo nella patogenesi della SLA. Pubblicazioni su riviste internazionali 12

13 Smith BN, et al. Ticozzi N, Fallini C, Gkazi AS, Topp S, Kenna KP, Scotter EL, Kost J, Keagle P, Miller JW, Calini D, Vance C, Danielson EW, Troakes C, Tiloca C, Al-Sarraj S, Lewis EA, King A, Colombrita C, Pensato V, Castellotti B, de Belleroche J, Baas F, Ten Asbroek AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, McLaughlin RL, Polak M, Asress S, Esteban- Pérez J, Muñoz-Blanco JL, Simpson M; SLAGEN Consortium, van Rheenen W, Diekstra FP, Lauria G, Duga S, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G, Morrison KE, Williams KL, Nicholson GA, Blair IP, Dion PA, Leblond CS, Rouleau GA, Hardiman O, Veldink JH, van den Berg LH, Al-Chalabi A, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, García- Redondo A, Wu Z, Glass JD, Gellera C, Ratti A, Brown RH Jr, Silani V, Shaw CE, Landers JE. Exome-wide Rare Variant Analysis Identifies TUBA4A Mutations Associated with Familial ALS. Neuron Oct 22;84(2): ) Analisi della variabilità polimorfica del gene KIFAP3 Recentemente il polimorfismo rs è stato descritto come un importante fattore genetico in grado di modulare la sopravvivenza nei pazienti affetti da SLA. In particolare, nello studio condotto da Landers e collaboratori la presenza del genotipo CC si associava ad una sopravvivenza aumentata di 14 mesi nei pazienti rispetto alla presenza dei genotipi TT e TC. Il nostro gruppo ha partecipato con la propria coorte di pazienti SLA sporadici in uno studio multicentrico atto a confermare tale evidenza sperimentale. Sono stati reclutati un totale di 2362 pazienti (di origine belga, tedesca, irlandese, italiana, olandese e svedese) dei quali 1220 portatori del genotipo TT, 949 del genotipo CT e 192 (pari al 8.1%) portatori del genotipo CC. Attraverso l analisi di sopravvivenza con il modello Kaplan-Meier le frequenze genotipiche CC sono state confrontate con quelle degli altri genotipi CT e TT. L analisi Log-Rank (Mantel-Cox) non ha evidenziato alcuna differenza significativa in termini di sopravvivenza tra i genotipi (p=0.26). Anche gli hazard ratio aggiustati per sesso, età di insorgenza e sito i insorgenza non hanno mostrato alcuna differenza statisticamente significativa. La sopravvivenza è stata inoltre valutata tenendo conto dei singoli paesi d origine. Anche in questo caso non è emerso alcun dato statisticamente significativo. Presi nella loro totalita i dati di questo studio multicentrico condotto su un ampia coorte di pazienti escludono dunque che la variabilità genotipica del gene KIFAP3 rappresenti un fattore di modulazione nella SLA sporadica. Pubblicazioni su riviste internazionali van Doormaal PT, Ticozzi N, Gellera C, Ratti A, Taroni F, Chiò A, Calvo A, Mora G, Restagno G, Traynor BJ, Birve A, Lemmens R, van Es MA, Saris CG, Blauw HM, van Vught 13

14 PW, Groen EJ, Corrado L, Mazzini L, Del Bo R, Corti S, Waibel S, Meyer T, Ludolph AC, Goris A, van Damme P, Robberecht W, Shatunov A, Fogh I, Andersen PM, D'Alfonso S, Hardiman O, Cronin S, Rujescu D, Al-Chalabi A, Landers JE, Silani V, van den Berg LH, Veldink JH. Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter survival study. Neurobiol Aging Oct;35(10):2420.e13-4. ASPETTI GENETICI NEI DISORDINI DEL MOVIMENTO I disordini del movimento comprendono un gruppo di patologie caratterizzate da alterazioni del movimento volontario e presenza di movimenti involontari. Tali disordini vengono clinicamente classificati in due grandi categorie: disordini di tipo acinetico-rigido, di cui fa parte la malattia di Parkinson, e disordini di tipo ipercinetico, che comprendono le distonie. 1) Una nuova variante omozigote di PLA2G6 causa dystonia-parkinsonismo. La neurodegenerazione associata PLA2G6 (PLAN) è una malattia autosomica recessiva dovuta a mutazioni nel gene che codifica per la fosfolipasi A2. E la seconda forma più frequente di neurodegenerazione con accumulo cerebrale di ferro (NBIA) e solitamente e associata a Distrofia Neuroassonale Infantile (INAD). Il fenotipo dell adulto e generalmente caratterizzato da parkinsonismo, distonia, deficit cognitivo e psichiatrico e atrofia ottica. In questo studio abbiamo descritto il caso di una donna di 29 anni che si presenta con una progressiva compromissione della deambulazione da 2 anni dovuta a rigidita dell arto inferiore destro e incontinenza. Successivamente ha sviluppato distonia generalizzata, bradicinesia, ipomimia, disartria e segni piramidali. L esame neuropsicologico ha rivelato disforia, ansia e anosognosia. Il trattamento con Levodopa ha migliorato i segni motori, ma ha peggiorato i sintomi psichiatrici. La risonanza magnetica cerebrale mostra depositi di ferro nella sostanza nera e atrofia subcorticale. Il DAT-SCAN mostra denervazione dopaminergica bilaterale. Abbiamo quindi effettuato uno screening molecolare dei principali geni associati a distonia-parkinsonismo, come FBXO7, PARK2, PINK1, DJ-1, ATP13A2 e PLA2G6. Questo screening ha permesso di individuare la nuova variante missenso omozigote c.1547c>t nel gene PLA2G6 (NM_003560), che determina il cambiamento aminoacidico p.ala516val. Tale variante è assente in un ampio numero di controlli sani di origine caucasica ed interessa un residuo aminoacidico altamente conservato tra gli ortologhi; inoltre numerosi algoritmi, tra cui Polyphen2 e SIFT, ne predicono la patogenicita. Pertanto l identificazione della nuova variante A516V in un caso di dystonia-parkisonismo ad esordio precoce consente di ampliare lo spettro mutazionale associato al gene PLA2G6. 2) Identificazione di una nuova mutazione di BPAN e evidenze di eterogeneita genetica in casi di NBIA 14

15 La neurodegenerazione con accumulo di ferro (NBIA, Neurodegeneration with brain iron accumulation) comprende un gruppo di patologie clinicamente e geneticamente eterogenee caratterizzate da disturbi extrapiramidali del movimento, declino cognitivo e un caratteristico deposito di ferro nei gangli della base. In questo lavoro riportiamo due casi di pazienti con NBIA, su cui sono state effettuate analisi genetiche. La paziente 1 ha esordito a 2 anni con ritardo psicomotorio ed ha mantenuto caratteristiche cliniche stabili durante l'infanzia e l'adolescenza. A partire dai 24 anni, è iniziato un declino delle sue capacità motorie e intellettive e, tre anni dopo, l'esame neurologico ha rilevato un rallentamento psicomotorio globale con linguaggio quasi assente, demenza, oftalmoplegia, spasticità e iperreflessia. La risonanza magnetica cerebrale (MRI) ha rivelato atrofia cerebellare e cortico-sottocorticale sopratentoriale. Le sequenze T2 mostrano una significativa ipointensità dei nuclei pallidi e della sostanza nera. Le immagini in T1 evidenziano una iperintensità mesencefalica. Il sequenziamento del gene WDR45 ha permesso di individuare una nuova mutazione di splicing (c.519+1_3delgtg het). La paziente 2 si presenta a 10 mesi con ipotonia, accompagnata da ritardo motorio e del linguaggio. A 7 anni è stata diagnosticata con un moderato ritardo mentale e una sindrome cerebellare. A 32 anni mostra disturbi del linguaggio, lieve oftalmoplegia laterale, riflessi vivaci, marcato tremore intenzionale e distonico, dismetria e andatura a livello base con distonia bilaterale del piede. Le sequenze T2 alla risonanza magnetica mostrano ipointensità dei nuclei dentati, dei nuclei rossi, della sostanza nera e dei nuclei pallidi. Sono stati analizzati tutti i geni finora associati a NBIA senza pero individuare delle varianti patogenetiche. Anche se i risultati del neuroimaging di entrambi i pazienti risultatano coerenti con una diagnosi di NBIA, la mancanza di diagnosi molecolare della paziente 2 suggerisce un'ulteriore eterogeneità genetica. ASPETTI GENETICI NELLE MALATTIE CEREBROVASCOLARI Le malformazioni cerebrali cavernose (CCM) sono delle rare malformazioni vascolari del sistema nervoso centrale. Questa condizione è geneticamente eterogenea ma tradizionalmente associata a varianti eterozigoti nei geni CCM1/KRIT1, CCM2/malcavernin e CCM3/PDCD10. In questo studio abbiamo analizzato le caratteristiche cliniche, neuroradiologiche e molecolari in una famiglia italiana con maformazioni cavernose che interessano anche il midollo spinale. L analisi del DNA ci ha consentito di trovare una nuova variante nell introne 3 del gene CCM1 (c a>g), che segregava con il fenotipo ma assente in un gruppo di 340 cromosomi controllo. Abbiamo quindi caratterizzato gli effetti a livello di trascritto di questa variante, scoprendo che essa consente la parziale ritenzione di una parte dell introne 3 in 15

16 grado di produrre un codone di stop prematuro che comporta la perdita dell espressione dell allele. La conoscenza del difetto molecolare nelle forme familiari e sporadiche di CCM è di grande importanza, anche per l inclusione dei pazienti in trial clinici di prossimo avvio. Articoli pubblicati Lanfranconi S, Ronchi D, Ahmed N, Civelli V, Basilico P, Bresolin N, Comi GP, Corti S. A novel CCM1 mutation associated with multiple cerebral and vertebral cavernous malformations. BMC Neurol Aug 3;14:158. doi: /s Abstract presentati a congressi internazionali Lanfranconi, S. Ronchi, D. Ahmed, N. Basilico, P. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. A novel mutation in KRIT1 gene associated with familial cerebral cavernous malformations Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, Turkey STUDIO DELLE MALATTIE DA ACCUMULO DI GLICOGENO Il nostro laboratorio da molti anni porta avanti lo studio delle malattie dovute all'accumulo muscolare di glicogeno. 1) Estesa descrizione fenotipica e nuovi difetti molecolari in un gruppo di pazienti del Nord Italia con glicogenosi di tipo 2 ad esordio adulto. Nel corso del 2014 i risultati conseguiti negli ultimi anni di studio sulla glicogenosi di tipo 2 (deficit di enzima maltasi acida) sono confluiti in una pubblicazione che rivede la nostra intera casistica alla luce di studi clinici, biochimici e molecolari. La glicogenosi di tipo II (Glycogen Storage Disease type 2, GSDII o malattia di Pompe, OMIM *606800) è una patologia progressiva, spesso fatale, causata da una riduzione dell attivita dell'alfa-1,4-glucosidasi acida (maltasi acida), un enzima lisosomiale che idrolizza il glicogeno in glucosio. Questo deficit determina una miopatia prossimale con accumulo di glicogeno nel fegato, nel cuore e nel muscolo scheletrico. Alla bse della GSDII vi sono mutazioni recessive nel gene GAA. Abbiamo rivisto i dati clinici, biochimici e molecolari nella nostra casistica di pazienti con deficit di maltasi acida, costituita da 36 soggetti caratterizzati da un fenotipo adulto. Abbiamo confrontato le caratteristiche del nostro campione con quello degli altri gruppi di pazienti descritti in letteratura e tentato una correlazione genotipo-fenotipo, fino a questo momento scarsamente informativa. Tutti i pazienti diagnosticati presentano in eterozigosi l IVS T>G (frequenza allelica 50%). Questo dato conferma la prevalenza riportata in letteratura di questa variante nella popolazione adulta caucasica con deficit di maltasi acida. Abbiamo quindi diviso i pazienti sulla base della gravità della mutazione del secondo allele, identificandone 21 con una 16

17 mutazione particolare deleteria e associati da un quadro clinico più grave, con precoce e ingravescente compromissione respiratoria. Questi dati e l identificazione di nuovi fattori prognostici potrebbe rivelarsi importante per una migliore definizione del follow-up e dell algoritmo decisionale per l accesso alla terapia enzimatica sostitutiva. Articoli pubblicati Remiche G, Ronchi D, Magri F, Lamperti C, Bordoni A, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Extended phenotype description and new molecular findings in late onset glycogen storage disease type II: a northern Italy population study and review of the literature. J Neurol Jan;261(1): doi: /s Abstract presentati a congressi internazionali Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P., Fortunato F., Bordoni A., Tonin P., Filosto M., Previtali S., Mongini T., Vercelli L., Vittonatto E., Toscano A., Musumeci O., Barca E., Angelini C., Lamperti C., Mora M., Morandi L., Moggio M. Late-onset Pompe Disease: Histopathological, biochemical and clinical assessment before and after ERT. 19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin, Germany. Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P., Fortunato F., Bordoni A., Tonin P., Filosto M., Previtali S., Mongini T., Vercelli L., Vittonatto E., Toscano A., Musumeci O., Barca E., Angelini C., Lamperti C., Mora M., Morandi L., Moggio M. Late-onset Pompe disease: Histopathological, biochemical and clinical assessment before and after ERT. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), July , Nice, France 2) Glicogenosi di tipo 3 La glicogenosi di tipo III (GSDIII) è una rara malattia genetica a trasmissione autosomica recessiva del metabolismo del glicogeno ed è causata da mutazioni nel gene AGL che codifica per l enzima deramificante (GDE), caratterizzata da accumulo di glicogeno nei tessuti, principalmente in fegato e muscolo scheletrico. La malattia in genere si manifesta nell infanzia con epatomegalia, ritardo di crescita e crisi ipoglicemiche, mentre durante l eta adulta si presenta una miopatia. Attualmente, i meccanismi patogenetici della GSDIII non sono stati ancora completamente chiariti e i pazienti sono trattati con una dieta appropriata, che comprende pasti frequenti, e terapie sintomatiche. 17

18 Il nostro laboratorio studia da anni questa patologia attraverso il dosaggio del contenuto di glicogeno dei tessuti, il dosaggio dell attivita dell enzima deramificante e la diagnosi genetica. Il lavoro sulla glicogenosi di tipo III si e ulteriormente sviluppato con la generazione del modello murino di questa patologia. I topi KO Agl presentano epatomegalia importante, ma non abbiamo rilevato segni di cirrosi o adenomi. Nei tessuti affetti i depositi di glicogeno sono aumentati rispetto ai topi controllo, compreso il sistema nervoso centrale, che non è mai stato indagato nell uomo. I dati biochimici sono in accordo con i dati istologici che mostrano chiaramente l alterazione dei tessuti causata dall eccesso di glicogeno. La microscopia elettronica ha evidenziato che le infiltrazioni di glicogeno vanno a distruggere l apparato contrattile della miofibra. Inoltre, i topi affetti adulti sembrano meno attivi dei controlli, e mostrano cifosi alla colonna vertebrale. Gia all eta di tre mesi i topi affetti non riescono a correre e gli animali adulti risultano intolleranti all esercizio fisico. Ancora, i topi più anziani hanno un ritmo respiratorio accelerato anche in condizioni di riposo, fenomeno dovuto all accumulo di glicogeno nel diaframma. Depositi di zucchero sono presenti anche nella lingua dei topi affetti. Questi risultati dimostrano che il modello descritto è affidabile nel riprodurre la GSDIII poiché riassume le caratteristiche essenziali della malattia. Pubblicazioni su riviste internazionali Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti S, Corti S, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Glycogen storage disease type III: A novel Agl knockout mouse model. Biochim Biophys Acta Nov;1842(11): Abstract presentati a congressi internazionali Comi GP, Pagliarani S, Ulzi G, Lucchiari S, Seidita F, Bordoni A, Nizzardo M, Corti S, Violano R, Ripolone M, Moggio M, Bresolin N. A constitutive knockout animal model for Glycogen Storage Disease type III. PS2-236/#175. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia. Sabrina Lucchiari. Glycogen Storage Disease Type III: a novel Agl KO mouse model. V Congreso Internacional de Glucogenosis, 4-8 Giugno 2014, Barcellona, Spagna. 3) Malattia da corpi poliglucosanici La malattia da accumulo di corpi poliglucosanici (APBD) è una rara malattia recessiva ad esordio adulto dovuta al deficit dell enzima ramificante il glicogeno (GBE1). La APBD e una patologia allelica con la glicogenosi di tipo IV, cioe entrambe le patologie sono causate da mutazioni nello stesso gene. Sono presenti disfunzione urinaria, paraplegia spastica con perdita della sensibilità pressoria e di vibrazione, neuropatia periferica e disordini cognitivi. Il 18

19 nostro laboratorio si occupa sia della diagnosi biochimica, con il dosaggio dell attivita enzimatica, sia della diagnosi genetica, con la ricerca delle mutazioni che causano malattia. Nel 2014 abbiamo studiato dal punto di vista clinico, istologico, biochimico e genetico una famiglia italiana con 3 fratelli affetti da APBD. In questa famiglia la presentazione clinica nei tre soggetti affetti e stata eterogenea e in 2 fratelli la biopsia muscolare e risultata essere nella norma. Abbiamo individuato una nuova mutazione nel gene GBE1 e una gia descritta precedentemente. Nonostante la presentazione clinica all esordio della malattia fosse eterogenea, tutti i fratelli presentavano lo stesso pattern di danno neurologico se studiati con neuroimaging. Questi dati sono confluiti in un lavoro sottomesso a Neuromuscular Disorders. Abstract presentati a congressi internazionali Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D Adda E, Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. Adult polyglucosan body disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian family. PS2-237/#205. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia. Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D Adda E, Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi G, Moggio M. Adult Polyglucosan Body Disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian family. EFNS-ENS Joint Congress of Neurology, 31 Maggio 3 Giugno 2014, Istanbul, Turchia. Abstract presentati a congressi nazionali Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D Adda E, Morandi L, Farina L, Riva M, Grimoldi N, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. Heterogeneity of an Italian family affected with Adult polyglucosan body disease. XIV Congresso Nazionale Associazione Italiana di Miologia, 8-10 Maggio 2014, Sirmione, Italia. 4) Glicogenina 1 Recentemente, mutazioni a carico del gene Glicogenina1 (GYG1) sono state descritte causare una miopatia progressiva il cui hallmark istologico e l accumulo di corpi poliglucosanici. I corpi poliglucosanici sono anomali accumuli di amilopectine che si ritrovano in miopatie in cui sono coinvolti geni legati al metabolismo del glicogeno come la malattia da corpi poliglucosanici (APBD), la glicogenosi di tipo IV, la glicogenosi di tipo VII e la miopatia associata a cardiomiopatia causata da mutazioni nel gene RBCK1. Abbiamo screenato il gene GYG1 in alcuni soggetti senza diagnosi genetica la cui biopsia presentava la presenza corpi poliglucosanici e abbiamo individuato una nuova famiglia italiana con mutazioni nel gene GYG1 in due affetti. La sorella maggiore, che presenta una 19

20 compromissione muscolare maggiore rispetto alla sorella minore, e seguita dal nostro centro da piu di 30 anni. CANALOPATIE MUSCOLARI Le canalopatie muscolari sono caratterizzate da un alterata eccitabilita della membrana muscolare e si dividono in miotonie non-distrofiche e paralisi periodiche. Esordiscono principalmente nelle prime due decadi di vita e sono caratterizzate da rigidità muscolare, dolore, debolezza e fatica. Sono causate da mutazioni nei geni CLCN1, SCN4A, CACNA1S e KCNJ2 che codificano rispettivamente per i canali del cloro, del sodio, del calcio e del potassio muscolari. Negli ultimi anni abbiamo caratterizzato un ampia coorte di pazienti affetti sia da miotonie non-distrofiche che da paralisi periodica.nel nostro laboratorio le indagini genetiche sono eseguite sia come completamento dell iter diagnostico sia come aspetto di pura ricerca sulle cause genetiche delle canalopatie muscolari nella popolazione italiana. Relativamente al canale del cloro muscolo specifico (CLCN1), l attivita di diagnostica, corredata da studi funzionali e di espressione in sistemi in vitro per casi selezionati, ha permesso di collezionare in pochi anni una coorte di oltre 70 soggetti Thomsen/Becker. Abbiamo effettuato il primo studio di valutazione del potenziale patogenetico di nuove mutazioni di splicing usando il Mini-gene Assay, che si basa sull analisi del DNA genomico. Le varianti di splicing costituiscono il 23% di quelle trovate nei nostri pazienti con Miotonia Congenita. I risultati ottenuti confermano l importanza di analizzare sperimentalmente la natura dei riarrangiamenti associati con questa classe di mutazioni ed il loro effetto sui trascritti finali. In particolare, le mutazioni di splilcing che si suppone possano produrre trascritti in-frame possono in realtà generare mrna out-of-frame che impediscono la sintesi di un canale funzionale. Dal punto di vista clinico, un errata valutazione molecolare può produrre una diagnosi errata o tardiva della malattia. La nostra coorte consta, inoltre, di 23 soggetti affetti da paralisi periodica (paralisi periodica ipokaliemica, paralisi periodica iperkaliemica e sindrome di Andersen-Tawil e di circa 30 pazienti affetti da miotonia del canale del sodio. Nuove mutazioni sono state identificate e analizzate con studi funzionali. Questi studi finora sono stati presentati a congressi internazionali e hanno portato alla pubblicazione su riviste internazionali di articoli, alcuni dei quali in collaborazione con altri gruppi che si occupano dello studio delle canalopatie muscolari. Pubblicazioni su riviste internazionali 20

21 Ulzi G, Sansone VA, Magri F, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Lucchiari S. In vitro analysis of splice site mutations in the CLCN1 gene using the minigene assay. Mol Biol Rep May;41(5): Abstract presentati a congressi internazionali Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte Camerino D. Functional and pharmacological characterzation of a new hnav1.4 sodiun channel mutation causing myotonia permanens. PS2-195#383. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia. Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte Camerino D. Pharmacogenetics of hnav1.4 sodium channel mutations causing myotonia. XIV Congresso Nazionale Associazione Italiana di Miologia, 8-10 Maggio 2014, Sirmione, Italia. Lucchiari S, Pagliarani S, Ulzi G, Modoni A, Scarlato M, Magri F, D Amico A, Previtali S, Corti S, Meola G, Lo Monaco M, Sansone V, Comi GP. Genetic analysis of non-dystrophic myotonias in Italian patients. DISTROFIE MUSCOLARI, DISTROFIE E MIOPATIE CONGENITE 1) Distrofia Muscolare di Duchenne: partecipazione a Trial clinici nazionali e internazionali E proseguita la partecipazione attiva a trial clinici Nazionali ed Internazionali in pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne. Nell ambito dei trial clinici sono attualmente seguiti 20 bambini affetti da Distrofia muscolare di Duchenne e la valutazione ai fini dell arruolamento ha previsto la valutazione di più di 40 soggetti. Nel corso del 2014 è terminato lo studio sperimentale con l oligonucleotide antisenso Drisapersen, l analisi dei risultati è attualmente in corso. Lo studio ha coinvolto tre pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne seguiti per oltre tre anni. E proseguito inoltre lo studio open label con farmaco Ataluren ed è iniziato da ottobre 2013 uno studio di fase III in doppio cieco sempre con lo stesso farmaco, molecola in grado di promuovere il reading through di stop codon patologici. Questi studi hanno previsto l arruolamento di 12 soggetti. Nel corso di quest anno sono stati inoltre pubblicati i risultati dello studio di fase 2b, condotto negli scorsi anni anche presso la nostra UO. Questi risultati, positivi, hanno consentito di porre le premesse non solo per la prosecuzione dello studio di fase III ma anche per una possibile commercializzazione del farmaco. Infine nel corso del 2014 è stata iniziata la fase di estensione del trial clinico con farmaco Givinostat ed è stata iniziata una nuova sperimentazione con il farmaco Tadalafil, donatore di 21

22 ossido nitrico, Questi farmaci, utilizzati sempre nella popolazione DMD, agiscono con meccanismi differenti sui processi a valle rispetto alla perdita di distrofina incrementando i processi di rigenerazione muscolare. Poiché la Distrofia Muscolare di Duchenne è una patologia che colpisce soggetti in età infantile e presenta un andamento inesorabilmente progressivo con decesso nella terza decade di vita, qualsiasi tentativo terapeutico è essenziale anche in considerazione della attuale mancanza di terapie realmente efficaci. Pubblicazioni su riviste internazionali Bushby K(1), Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW, Flanigan KM, Goemans N, Jones KJ, Mercuri E, Quinlivan R, Renfroe JB, Russman B, Ryan MM, Tulinius M, Voit T, Moore SA, Lee Sweeney H, Abresch RT, Coleman KL, Eagle M, Florence J, Gappmaier E, Glanzman AM, Henricson E, Barth J, Elfring GL, Reha A, Spiegel RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP. Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy.muscle Nerve Oct;50(4): ) Distrofie Muscolari dei cingoli E stata proseguita la raccolta dati di pazienti affetti da Distrofia Muscolare dei Cingoli (LGMD) nell ambito del network italiano realizzato tramite il Progetto Telethon GUP In particolare sono stati raccolti dati prospettici e retrospettivi di più di 400 pazienti affetti da queste forme di distrofia muscolare. Lo studio tramite sequenziamento di geni candidati della sottopopolazione di pazienti non geneticamente determinati ha consentito di porre la diagnosi molecolare in circa 30 ulteriori pazienti, portando a 310 il numero di soggetti geneticamente determinati. Lo studio analitico dei dati ha permesso di definire l epidemiologia di queste forme in Italia e i parametri più importanti per la diagnosi differenziale. Tra i pazienti con nuova diagnosi molecolari alcuni soggetti sono risultati portatori di mutazioni raramente responsabili di LGMD, quali un soggetto adulto con mutazione nel gene codificante la proteina merosina, generalmente responsabile di gravi forme neonatali. Il lavoro di ricerca è stato oggetto di abstract e comunicazioni orali in congressi nazionali e internazionali ed ha anche posto le basi per una revisione della letteratura e degli aspetti molecolari che è stato oggetto di review. Inoltre è in corso lo studio di una sottopopolazione di soggetti che, dopo revisione delle caratteristiche cliniche e bioptiche, è risultata portatrice alla biopsia muscolare di deficit di alfa-distroglicano I geni che codificano per proteine responsabili della glicosilazione di questa proteina sono in aumento negli ultimi anni e responsabili prevalentemente di forme 22

23 congenite. Obiettivo dello studio è verificare la presenza di mutazioni in questi geni nella sottopopolazione di pazienti LGMD privi di diagnosi molecolare. Pubblicazioni su riviste internazionali Magri F, Brajkovic S, Govoni A, Brusa R, Comi GP. Revised genetic classification of Limb Girdle Muscular Dystrophies. Curr Mol Med Oct 10. Savarese M, Di Fruscio G, Mutarelli M, Torella A, Magri F, Santorelli F, Comi G, Bruno C, Nigro V. MotorPlex provides accurate variant detection across large muscle genes both in single myopathic patients and in pools of DNA samples. Acta Neuropathol Commun Sep 11;2(1):100. Abstract presentati a congressi internazionali Magri F., Govoni A., Del Bo R., D'angelo MG., Gandossini S., Brusa R., Colombo I., Moroni I., Mongini T., Mora M., Angelini C., Tomelleri G., Siciliano G., Toscano A., Corti S., Bresolin N., Comi GP., Natural history and peculiar aspects in LGMD2B. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Magri F., Govoni A., Brusa R., Angelini C., D Angelo MG, Mongini T., Toscano A., Siciliano G., Tomelleri G., Mora M., Nigro V., Pegoraro E., Morandi L., Musumeci O., Sciacco M, Ricci G., Moroni I., Gandossini S. Del Bo R., Fortunato F., Ronchi D., Corti S., Moggio M., Bresolin N., Comi GP. The National Registry of Limb Girdle Muscular Dystrophy: clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients. 19th International Congress of the World Muscle Society, Berlin, October 7th-11th, Neuromuscular disorders, vol.24 (9-10), p.892, Abstract presentati a congressi nazionali F. Magri, A. Govoni, R. Brusa, C. Angelini, M.G. D Angelo, T. Mongini, A. Toscano, G. Siciliano, G. Tomelleri, M. Mora, V. Nigro, E. Pegoraro, L. Morandi, O. Musumeci, M. Sciacco, G. Ricci, I. Moroni, S. Gandossini, R. Del Bo, F. Fortunato, D. Ronchi, S. Corti, M. Moggio, N. Bresolin, G.P. Comi The National Registry of Limb Girdle Muscular Dystrophy: clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May F. Magri, I. Colombo, R. Del Bo, A. Govoni, M. Scarlato, R. Brusa, P. Ciscato, S. Previtali, D. Piga, M.G. D Angelo, M. Moggio, G.P. Comi ISPD mutations account for a small proportion of Italian limb girdle muscular dystrophy. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May

24 3) Distrofie congenite e miopatie congenite Nel corso dell anno è stata completata la raccolta dei dati clinici della casistica di pazienti affetti da Distrofie congenite e miopatie congenite seguiti presso il nostro Istituto. Scopo della raccolta è stato raggiungere una migliore caratterizzazione fenotipica e definire, all interno di un network italiano, la frequenza relativa delle differenti forme nella popolazione Italiana. Il nostro gruppo ha contribuito allo studio raccogliendo e organizzando i dati clinici dei pazienti seguiti presso l UO dell Ospedale Maggiore Policlinico e dell IRCCS E Medea Bosisio Parini. Le Miopatie Congenite sono un gruppo estremamente eterogeneo di patologie muscolari che hanno esordio alla nascita o nei primi anni di vita e presentano un decorso variabile, caratterizzato da ipotonia, atrofia, debolezza muscolare, ritardo nell acquisizione delle tappe motorie, malformazioni osteoarticolari, dismorfismi facciali, oftalmoplegia e difficoltà nella nutrizione. Sono forme rare, familiari e occasionalmente sporadiche, causate da un alterazione geneticamente determinata di varie proteine strutturali della fibra muscolare. In genere sono caratterizzate da aspetti istopatologici specifici che consentono una certa suddivisione. Le principali Miopatie Congenite sono la Miopatia Central-Core, la Miopatia Nemalinica, la Miopatia Centronucleare, la Miopatia Minicore, la Miopatia Miofibrillare e la Miopatia con Disproporzione delle Fibre. 1) Caratterizzazione clinica e genetica delle Miopatie Nemaliniche in una coorte di pazienti italiani. Dallo studio di questa casistica è stato possibile estrapolare un sottogruppo di pazienti privo di diagnosi molecolare nei quali è attualmente in corso uno studio molecolare tramite metodiche di nuova generazione (next generation sequencing). Obiettivo dello studio è identificare nuovi fenotipi associati a geni noti o nuovi geni malattia. All interno del network delle Miopatie Congenite il nostro laboratorio si e occupato dello screening di un gruppo di pazienti italiani affetti da Miopatia Nemalinica. Tramite Target Region Capture Sequencing del gene NEB, responsabile del 50% dei casi di miopatie nemaliniche, abbiamo identificato 11 varianti in 8 pazienti, di cui 7 nuove. Le varianti sono state selezionate prendendo in considerazione solo quelle che determinano un alterazione sostanziale della sequenza proteica. Per escludere i polimorfismi si sono usati i data base dbsnps e 1000 Genome data base e si è valutata la patogenicità usando dei programmi di predizione, come Polyphen. Si è poi controllata la segregazione delle mutazioni all interno della famiglia, la loro assenza nell Exome variant server e in un gruppo di 240 cromosomi controllo. 24

25 Concludendo la Target Region Capture Sequencing ha permesso una più facile determinazione delle mutazioni: missense, frameshift, stop codon e mutazioni nei siti di splicing. In particolare lo screening dei nostri pazienti ha permesso un alta frequenza di determinazione delle mutazioni. Queste mutazioni sono distribuite lungo tutto il gene, confermando la mancanza di un hotspot mutazionale. Pertanto questo metodo di analisi sembra essere promettente per una più facile determinazione delle mutazioni in quei geni complessi che presentano un gran numero di esoni, ampie regioni codificanti e non presentano hotspots mutazionali. 2) Caratterizzazione clinica e genetica di tre famiglie con Miopatia Central-Core e Fiber Type Disproportion. La miopatia central core è una delle forme più frequenti di Miopatia Congenita, caratterizzata da aree centrali, con disorganizzazione della struttura miofibrillare e assenza di mitocondri. Il gene maggiormente affetto è RYR1 codificante per il recettore rianodinico e coinvolto nel processo di eccitazione-contrazione in quanto funziona come canale di rilascio del calcio nel muscolo scheletrico. Sono state riportate mutazioni di tipo sia dominante che recessivo. Nella maggior parte dei casi le varianti causano una patologia autosomica dominante associata a Miopatia Central-Core e/o associata a suscettibilita per l Ipertermia Maligna. Invece le mutazioni recessive predominano in pazienti con Miopatia Multiminicore, Centronucleare o con Disproporzione delle Fibre. RYR1 è uno dei geni più grandi del genoma umano, essendo costituito da 106 esoni, quindi l analisi mediante sequenziamento Sanger risulta essere molto lunga e costosa. L utilizzo della Next Generation Sequencing permette invece una più rapida determinazione di varianti in vari geni, che però devono essere validate. Abbiamo analizzato 12 pazienti affetti da Miopatia Congenita usando questo sistema di sequenziamento ad alta definizione su una piattaforma di 98 geni coinvolti in differenti patologie neuromuscolari. In questo modo siamo riusciti a caratterizzare geneticamente tre famiglie, identificando 6 mutazioni nel gene RYR1, di cui 4 nuove. In particolare l analisi di una famiglia con 4 membri affetti ha evidenziato un differente decorso clinico associato allo stesso aplotipo, caratterizzato dalla presenza di due mutazioni dominanti, una associata a Miopatia Central-Core e l altra responsabile di Ipertermia Maligna. Articoli pubblicati Piga D; Magri F; Ronchi D; Corti S; Cassandrini D; Mercuri E; Tasca G; Bertini E; Fattori F; Toscano A; Messina S; Moroni I; Mora M; Moggio M; Colombo I; Pane M; Fiorillo C; D Amico A; Bruno C; Bresolin N; Comi GP. 25

26 New mutations in NEB gene discovered by targeted next generation sequencing in nemaline myopathy Italian patients. (Manoscritto sottomesso) Abstract presentati a congressi internazionali Pegoraro E., Cassandrini D., Astrea G., Codemo V., D'Amico A., Fiorillo C., Maggi L., Magri F., Pane M., Tasca G., Tosatto S., Battini R., Bernasconi P., Bertini E., Comi G.P., Messina S., Mongini T., Mora M., Morandi L., Minetti C., Ricci E., Mercuri E., Santorelli FM., Bruno C. Expanding the clinicopathological and genetic spectrum of RYR1 related Congenital Myopathies with cores and minicores: an Italian population study. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Abstract presentati a congressi nazionali F. Polenghi, I. Colombo, F. Magri, M. Sciacco, G. Fagiolari, S. Gandossini, E. Brighina, D. Piga, G.P. Comi, N. Bresolin, M. Moggio, M.G. D Angelo Late onset ophthalmoplegia in a typical neonatal congenital myopathy. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May (oral presentation) D. Piga, F. Magri, M. Moggio, G. Fagiolari, M.G. D Angelo, A. Cavallini, N. Bresolin, G.P. Comi, V. Nigro. New RYR1 mutations discovered by next generation sequencing in congenital myopathy patients with different phenotypes. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May ) Studio delle Distrofie Muscolari tramite Risonanza Magnetica Muscolare Nel corso dell anno sono state poste le premesse per studiare l evoluzione di alcune forme di patologie muscolare tramite Risonanza Magnetica (RM). In particolare presso l UO Neuroradiologia dell Ospedale Policlinico di Milano sono stati studiati alcuni pazienti affetti da miopatia congenita ed è stato impostato il follow-up di alcuni pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne, anche nell ambito dei trial clinici. Presso L Istituto IRCCS E. Medea (Bosisio Parini) l anno corrente è stato necessario per provvedere all aggiornamento dei software di risonanza al fine di renderli adatti allo studio muscolare. L aggiornamento è stato recentemente completato ed è stata messa a punto la metodica su soggetti controllo. Questo consente di porre le premesse per iniziare uno studio longitudinale in pazienti affetti da distrofia muscolare dei cingoli che avrà inizio nel prossimo anno. 5) Importanza delle misure funzionali e di outcome nelle malattie muscolari. E proseguita la raccolta di dati longitudinali-relativi a misure di outcome (6 minute walking test, North star ambulatory assessment, Motor function measure scale) nei pazienti affetti da 26

27 Distrofie muscolari. Questo studio osservazionale è volto a valutare l efficacia di alcune scale funzionali in pazienti affetti da patologie muscolari. Al fine di definire la reale efficacia di queste misure nel descrivere la storia naturale di queste patologie è necessario tuttavia uno studio su lungo periodo. La definizione di misure di out come è tuttavia fondamentale in quanto la possibilità di dimostrare la reale efficacia di terapie sperimentali è strettamente correlata alla capacità di individuare parametri quantitativi dei quali si possa seguire nel tempo la modifica. Pubblicazioni su riviste internazionali Pane M, Mazzone ES, Sormani MP, Messina S, Vita GL, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, D'Amico A, Lanzillotta V, Viggiano E, D'Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S, Bello L, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Bianco F, Van der Haawue M, Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Alfonsi C, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali SC, Napolitano S, Bruno C, Politano L, Comi GP, Bertini E, Morandi L, Gualandi F, Ferlini A, Goemans N, Mercuri E. 6 minute walk test in Duchenne MD patients with different mutations: 12 month changes. PLoS One Jan 8;9(1):e Abstract presentati a congressi internazionali Villa L., Testolin, S., Peverelli L., Ciscato P., Magri F., Sciacco M., Comi GP, Moggio M. Morphologic and morphometric analysis of muscle degeneration in DMD: evolution in patients aged from 1 to 10 years. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, 2014 Abstract presentati a congressi nazionali L. Villa, S. Testolin, L. Peverelli, P. Ciscato, F. Magri, F. Tiberio, M. Sciacco, G. Comi, M. Moggio Natural history of muscle pathology in 40 DMD patients aged 1 to 10 years: morphologic and morphometric analysis. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May

28 28

29 LABORATORIO DI NEUROIMMUNOLOGIA CLINICA Prof. Giacomo P. Comi Neurologo Dott.ssa Domenica Saccomanno Biologa Nutrizionista Laboratorio di Neuroimmunologia: Certificazione di qualità INSTAND (europeo) anno 2014 per le Sindromi paraneoplastiche. Diagnostica: Il Laboratorio di Neuroimmunologia si occupa del dosaggio dei principali anticorpi associati a neuropatie periferiche (NP) disimmuni quali: polineuropatia cronica infiammatoria demielinizzante (CIDP), neuropatia motoria multifocale (MMN), neuropatia sensitivomotoria demielinizzante associata a gammopatia monoclonale IgM, sindromi neurologiche paraneoplastiche, sindrome di Guillain Barré (GBS) e le sue varianti e la sindrome di Miller Fisher (MFS). Ricerca: Studio di collaborazione tra il il Dip. Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Sezione di Neuroscienze, Centro Dino Ferrari, Università degli Studi di Milano: Dott.ssa Domenica Saccomanno, Dott.ssa Francesca Magri, Prof. Giacomo Pietro Comi e il Centro per la Prevenzione e Diagnosi della Malattia Celiaca della Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano: Dott.ssa Carolina Tomba, Dott.ssa Leda Roncoroni, Dott. Luca Elli, Prof.ssa Maria Teresa Bardella. STUDIO CLINICO SULLA PRESENZA DI ANTICORPI ANTI GANGLIOSIDI NEI PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIA CELIACA ED EFFETTI DELLA DIETA SENZA GLUTINE La malattia celiaca (MC) è un enteropatia autoimmune (Th1) scatenata dall ingestione di glutine, in particolare da alcune sue componenti proteiche, chiamate gliadine. La diagnosi si basa sulla presenza di autoanticorpi circolanti (anti transglutaminasi tipo 2), conferma bioptica (danno atrofico della mucosa intestinale) e risposta alla dieta senza glutine (DGS). Al momento l unica terapia consiste nel seguire per tutto l arco della vita una DSG al fine di proteggere il paziente dall insorgenza di complicanze, associate appunto alla MC non trattata. Le complicanze neurologiche sono state riportate in letteratura in circa il 10% dei pazienti affetti da MC e possono interessare il sistema nervoso centrale e quello periferico, con NP disimmuni associate alla presenza nel siero dei pazienti di anticorpi anti gangliosidi. Anticorpi anti-gangliosidi sono stati trovati in pazienti celiaci con neuropatia ed altre manifestazioni 29

30 neurologiche associate, ma nessuno degli studi finora riportati in letteratura ha indagato la presenza degli anticorpi anti-gm3, GD3, GT1a e Sulfatide. E stata quindi indagata la presenza degli anticorpi anti-gangliosidi, dosando il pannello completo in tutti i campioni dei pazienti adulti celiaci, con e senza disturbi neurologici, alla diagnosi di MC. La MC può esordire con quadri clinici molto differenti, in un range ampio che va dalla totale asintomaticità fino a sintomi severi e talvolta invalidanti. Non sono emerse sostanziali differenze tra i due gruppi di pazienti affetti da MC classica e non classica, pur evidenziando nei pazienti asintomatici l importanza dei segni extraintestinali nel sospetto e nella diagnosi di MC. Inoltre nella maggior parte dei pazienti i disturbi neurologici precedono la diagnosi di MC e migliorano con la DSG. L indagine degli anticorpi anti gangliosidi ha permesso di evidenziare la presenza di anticorpi anti-sulfatide in pazienti adulti celiaci, con una prevalenza della positività in pazienti senza disturbi neurologici e assenza di anticorpi anti-gangliosidi associati a specifici fenotipi clinici in pazienti con disturbi neurologici. In letteratura, è stata riportata una reattività anti-sulfatide IgG e IgA solo in pazienti con NP acuta ed una reattività IgM in pazienti con neuropatia prevalentemente sensitiva. Inoltre è stata rilevata la presenza di anticorpi diretti contro almeno uno o più dei seguenti gangliosidi ( GM1, GM2, GD1a e GD1b) di classe IgG in 6 pazienti adulti celiaci con neuropatia sensitiva distale, suggerendo una risposta autoimmune anti-ganglioside mediata dai linfociti T. Altri studi, riportano una positività IgG per almeno uno dei 3 anticorpi anti-gangliosidi testati (anti- GM1, GD1b e GQ1b) nel 64% dei pazienti celiaci non trattati, con disturbi neurologici e nel 30% dei pazienti celiaci senza disturbi neurologici. Nell ipotesi di un possibile coinvolgimento del glutine nella reattività anti-sulfatide trovata, è stata valutata la riduzione o scomparsa degli autoanticorpi al controllo, dopo almeno 6 mesi di DSG. Gli anticorpi anti-sulfatide IgG (36%) si sono negativizzati in tutti i pazienti celiaci con e senza disturbi neurologici e la loro scomparsa suggerisce un ruolo del glutine nella reattività IgG contro i gangliosidi, trovata nei pazienti del nostro studio mentre la reattività IgA (14%) è risultata indipendente dall esposizione al glutine e dovuta verosimilmente ad una maggiore suscettibilità autoimmune. Abstract presentato a congresso internazionale D. Saccomanno, C. Tomba, F. Magri, L. Roncoroni, M.T. Bardella, G.P. Comi, N. Bresolin, L. Elli. Anti-sulphatide reactivity in patients with celiac disease. 9th International Congress on Autoimmunity, Nizza, Francia, Marzo

31 ELENCO LAVORI SCIENTIFICI 2014 Articoli in extenso 1.Forni D, Pozzoli U, Cagliani R, Tresoldi C, Menozzi G, Riva S, Guerini FR, Comi GP, Bolognesi E, Bresolin N, Clerici M, Sironi M. Genetic adaptation of the human circadian clock to day-length latitudinal variations and relevance for affective disorders. Genome Biol Oct 30;15(10): Magri F, Brajkovic S, Govoni A, Brusa R, Comi GP. Revised genetic classification of Limb Girdle Muscular Dystrophies. Curr Mol Med Oct 10. [Epub ahead of print] 3.Pane M, Mazzone ES, Sivo S, Sormani MP, Messina S, D Amico A, Carlesi A, Vita G, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, Lanzillotta V, Viggiano E, D Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S, Barp A, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Graziano A, Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali S, Bruno C, Politano L, Comi GP, Bertini E, Mercuri E. Long term natural history data in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy: 36- month changes. PLoS One Oct 1;9(10):e doi: /journal.pone ecollection Smith BN, Ticozzi N, Fallini C, Gkazi AS, Topp S, Kenna KP, Scotter EL, Kost J, Keagle P, Miller JW, Calini D, Vance C, Danielson EW, Troakes C, Tiloca C, Al-Sarraj S, Lewis EA, King A, Colombrita C, Pensato V, Castellotti B, de Belleroche J, Baas F, Ten Asbroek AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, McLaughlin RL, Polak M, Asress S, Esteban-Pérez J, Muñoz-Blanco JL, Simpson M; SLAGEN Consortium, van Rheenen W, Diekstra FP, Lauria G, Duga S, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G, Morrison KE, Williams KL, Nicholson GA, Blair IP, Dion PA, Leblond CS, Rouleau GA, Hardiman O, Veldink JH, van den Berg LH, Al-Chalabi A, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, García-Redondo A, Wu Z, Glass JD, Gellera C, Ratti A, Brown RH Jr, Silani V, Shaw CE, Landers JE. Exome-wide Rare Variant Analysis Identifies TUBA4A Mutations Associated with Familial ALS. Neuron Oct 22;84(2): doi: /j.neuron Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Riboldi G, Salani S, Bucchia M, Bresolin N, Comi GP, Corti S. ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1. Stem Cell Reports Aug 12;3(2): doi: /j.stemcr Savarese M, Di Fruscio G, Mutarelli M, Torella A, Magri F, Santorelli FM, Comi GP, Bruno C, Nigro V. MotorPlex provides accurate variant detection across large muscle genes both in single myopathic patients and in pools of DNA samples. Acta Neuropathol Commun Sep 11;2:100. doi: /s Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti S, Corti S, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. 31

32 Glycogen storage disease type III: A novel Agl knockout mouse model. Biochim Biophys Acta Nov;1842(11): doi: /j.bbadis Lanfranconi S, Ronchi D, Ahmed N, Civelli V, Basilico P, Bresolin N, Comi GP, Corti S. A novel CCM1 mutation associated with multiple cerebral and vertebral cavernous malformations. BMC Neurol Aug 3;14:158. doi: /s Bushby K, Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW, Flanigan KM, Goemans N, Jones KJ, Mercuri E, Quinlivan R, Renfroe JB, Russman B, Ryan MM, Tulinius M, Voit T, Moore SA, Lee Sweeney H, Abresch RT, Coleman KL, Eagle M, Florence J, Gappmaier E, Glanzman AM, Henricson E, Barth J, Elfring GL, Reha A, Spiegel RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP. Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy Muscle Nerve Oct;50(4): doi: /mus Riboldi G, Zanetta C, Ranieri M, Nizzardo M, Simone C, Magri F, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Antisense Oligonucleotide Therapy for the Treatment of C9ORF72 ALS/FTD Diseases. Mol Neurobiol Dec;50(3): doi: /s Di Fonzo A, Ronchi D, Gallia F, Cribiù FM, Trezzi I, Vetro A, Della Mina E, Limongelli I, Bellazzi R, Ricca I, Micieli G, Fassone E, Rizzuti M, Bordoni A, Fortunato F, Salani S, Mora G, Corti S, Ceroni M, Bosari S, Zuffardi O, Bresolin N, Nobile-Orazio E, Comi GP Lower motor neuron disease with respiratory failure caused by a novel MAPT mutation. Neurology Jun 3;82(22): doi: /WNL Guerini FR, Clerici M, Cagliani R, Malhotra S, Montalban X, Forni D, Agliardi C, Riva S, Caputo D, Galimberti D, Asselta R, Fenoglio C, Scarpini E, Comi GP, Bresolin N, Comabella M, Sironi M. No association of IFI16 (interferon-inducible protein 16) variants with susceptibility to multiple sclerosis. J Neuroimmunol Jun 15;271(1-2): doi: /j.jneuroim Protti A, Fortunato F, Caspani ML, Pluderi M, Lucchini V, Grimoldi N, Solimeno LP, Fagiolari G, Ciscato P, Zella SM, Moggio M, Comi GP, Gattinoni L Mitochondrial changes in platelets are not related to those in skeletal muscle during human septic shock.. PLoS One May 1;9(5):e doi: /journal.pone ecollection Faravelli I, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Zanetta C, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Stem cell transplantation for amyotrophic lateral sclerosis: therapeutic potential and perspectives on clinical translation. Cell Mol Life Sci Sep;71(17): doi: /s Forni D, Cagliani R, Tresoldi C, Pozzoli U, De Gioia L, Filippi G, Riva S, Menozzi G, Colleoni M, Biasin M, Lo Caputo S, Mazzotta F, Comi GP, Bresolin N, Clerici M, Sironi M. An evolutionary analysis of antigen processing and presentation across different timescales reveals pervasive selection. PLoS Genet Mar 27;10(3):e doi: /journal.pgen ecollection 2014 Mar. 32

33 16.Nizzardo M, Simone C, Salani S, Ruepp MD, Rizzo F, Ruggieri M, Zanetta C, Brajkovic S, Moulton HM, Müehlemann O, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Effect of combined systemic and local morpholino treatment on the spinal muscular atrophy Δ7 mouse model phenotype. Clin Ther Mar 1;36(3): e5. doi: /j.clinthera Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Catteruccia M, Pegoraro E, Carelli V, Valentino ML, Comi GP, Minetti C, Bruno C, Moggio M, Ienco EC, Mongini T, Vercelli L, Primiano G, Servidei S, Tonin P, Scarpelli M, Toscano A, Musumeci O, Moroni I, Uziel G, Santorelli FM, Nesti C, Filosto M, Lamperti C, Zeviani M, Siciliano G. Myoclonus in mitochondrial disorders. Mov Disord May;29(6): doi: /mds Ulzi G, Sansone VA, Magri F, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Lucchiari S. In vitro analysis of splice site mutations in the CLCN1 gene using the minigene assay. Mol Biol Rep May;41(5): doi: /s Pane M, Mazzone ES, Sormani MP, Messina S, Vita GL, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, D'Amico A, Lanzillotta V, Viggiano E, D'Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S, Bello L, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Bianco F, Van der Haawue M, Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Alfonsi C, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali SC, Napolitano S, Bruno C, Politano L, Comi GP, Bertini E, Morandi L, Gualandi F, Ferlini A, Goemans N, Mercuri E. 6 Minute walk test in Duchenne MD patients with different mutations: 12 month changes. PLoS One Jan 8;9(1):e doi: /journal.pone ecollection Zanetta C, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Faravelli I, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Molecular, genetic and stem cell-mediated therapeutic strategies for spinal muscular atrophy (SMA). J Cell Mol Med Feb;18(2): doi: /jcmm Sagnelli A, Savoiardo M, Marchesi C, Morandi L, Mora M, Morbin M, Farina L, Mazzeo A, Toscano A, Pagliarani S, Lucchiari S, Comi GP, Salsano E, Pareyson D. Adult polyglucosan body disease in a patient originally diagnosed with Fabry's disease. Neuromuscul Disord Mar;24(3): doi: /j.nmd Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Donati A, Minetti C, Moggio M, Mongini T, Servidei S, Tonin P, Toscano A, Uziel G, Bruno C, Ienco EC, Filosto M, Lamperti C, Catteruccia M, Moroni I, Musumeci O, Pegoraro E, Ronchi D, Santorelli FM, Sauchelli D, Scarpelli M, Sciacco M, Valentino ML, Vercelli L, Zeviani M, Siciliano G. The m.3243a>g mitochondrial DNA mutation and related phenotypes. A matter of gender? J Neurol Mar;261(3): doi: /s Zanetta C, Nizzardo M, Simone C, Monguzzi E, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Molecular therapeutic strategies for spinal muscular atrophies: current and future clinical trials. Clin Ther Jan 1;36(1): doi: /j.clinthera Fogh I, Ratti A, Gellera C, Lin K, Tiloca C, Moskvina V, Corrado L, Sorarù G, Cereda C, Corti S, Gentilini D, Calini D, Castellotti B, Mazzini L, Querin G, Gagliardi S, Del Bo R, Conforti FL, Siciliano G, Inghilleri M, Saccà F, Bongioanni P, Penco S, Corbo M, Sorbi S, Filosto M, Ferlini A, Di Blasio AM, Signorini S, Shatunov A, Jones A, Shaw PJ, Morrison KE, Farmer AE, Van Damme P, Robberecht W, Chiò A, Traynor BJ, Sendtner M, Melki J, 33

34 Meininger V, Hardiman O, Andersen PM, Leigh NP, Glass JD, Overste D, Diekstra FP, Veldink JH, van Es MA, Shaw CE, Weale ME, Lewis CM, Williams J, Brown RH, Landers JE, Ticozzi N, Ceroni M, Pegoraro E, Comi GP, D'Alfonso S, van den Berg LH, Taroni F, Al- Chalabi A, Powell J, Silani V; SLAGEN Consortium and Collaborators. A genome-wide association meta-analysis identifies a novel locus at 17q11.2 associated with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet Apr 15;23(8): doi: /hmg/ddt Ruggieri M, Riboldi G, Brajkovic S, Bucchia M, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Induced neural stem cells: methods of reprogramming and potential therapeutic applications. Prog Neurobiol Mar;114: doi: /j.pneurobio Remiche G, Ronchi D, Magri F, Lamperti C, Bordoni A, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Extended phenotype description and new molecular findings in late onset glycogen storage disease type II: a northern Italy population study and review of the literature. J Neurol Jan;261(1): doi: /s Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Riboldi G, Faravelli I, Zanetta C, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Minimally invasive transplantation of ipsc-derived ALDHhiSSCloVLA4+ neural stem cells effectively improves the phenotype of an amyotrophic lateral sclerosis model. Hum Mol Genet Jan 15;23(2): doi: /hmg/ddt van Doormaal PT, Ticozzi N, Gellera C, Ratti A, Taroni F, Chiò A, Calvo A, Mora G, Restagno G, Traynor BJ, Birve A, Lemmens R, van Es MA, Saris CG, Blauw HM, van Vught PW, Groen EJ, Corrado L, Mazzini L, Del Bo R, Corti S, Waibel S, Meyer T, Ludolph AC, Goris A, van Damme P, Robberecht W, Shatunov A, Fogh I, Andersen PM, D'Alfonso S, Hardiman O, Cronin S, Rujescu D, Al-Chalabi A, Landers JE, Silani V, van den Berg LH, Veldink JH. Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter survival study. Neurobiol Aging Oct;35(10):2420.e13-4. doi: /j.neurobiolaging Rango M, Arighi A, Bonifati C, Del Bo R, Comi G, Bresolin N. The brain is hypothermic in patients with mitochondrial diseases. J Cereb Blood Flow Metab May;34(5): doi: /jcbfm JIMD Rep Apr 17. [Epub ahead of print] 30.Ronchi D, Previtali SC, Sora MG, Barera G, Del Menico B, Corti S, Bresolin N, Comi GP. Novel Splice-Site Mutation in SMN1 Associated with a very Severe SMA-I Phenotype. J Mol Neurosci. [Epub ahead of print] 31.Ronchi D, Riboldi G, Del Bo R, Ticozzi N, Scarlato M, Galimberti D, Corti S, Silani V, Bresolin N, Comi GP. CHCHD10 mutations in Italian patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Brain Jan 8. pii: awu384. [Epub ahead of print] Lavori pubblicati come Abstract a congressi internazionali 1. Magri F., Govoni A., Del Bo R., D'angelo MG., Gandossini S., Brusa R., Colombo I., Moroni I., Mongini T., Mora M., Angelini C., Tomelleri G., Siciliano G., Toscano A., Corti S., Bresolin N., Comi GP., Natural history and peculiar aspects in LGMD2B. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10,

35 2. Villa L., Testolin, S., Peverelli L., Ciscato P., Magri F., Sciacco M., Comi GP, Moggio M. Morphologic and morphometric analysis of muscle degeneration in DMD: evolution in patients aged from 1 to 10 years. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Pegoraro E., Cassandrini D., Astrea G., Codemo V., D'Amico A., Fiorillo C., Maggi L., Magri F., Pane M., Tasca G., Tosatto S., Battini R., Bernasconi P., Bertini E., Comi G.P., Messina S., Mongini T., Mora M., Morandi L., Minetti C., Ricci E., Mercuri E., Santorelli FM., Bruno C. Expanding the clinicopathological and genetic spectrum of RYR1 related Congenital Myopathies with cores and minicores: an Italian population study. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., DalMas A., Bucchia M., Frattini E., Stuppia G., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi GP., Corti S. Amelioration of spinal muscular atrophy using RNA therapy to increase SMN level and modulate other secondary therapeutic targets. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Corti S., Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Zanetta C., Faravelli I., Magri F., Bresolin N., Comi GP: Improvement of SMARD1 phenotype using ipsc-derived neural stem cells transplantation. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Ronchi D., Previtali S., Magri F., Corti S. Comi G.P. A novel splice-site mutation in SMN1 resulting in very severe SMA1 phenotype. 19th International Congress of the World Muscle Society, Berlin,, October 7th-11th, Neuromuscular disorders, vol.24 (9-10), p.886, Magri F., Govoni A., Brusa R., Angelini C., D Angelo MG, Mongini T., Toscano A., Siciliano G., Tomelleri G., Mora M., Nigro V., Pegoraro E., Morandi L., Musumeci O., Sciacco M, Ricci G., Moroni I., Gandossini S. Del Bo R., Fortunato F., Ronchi D., Corti S., Moggio M., Bresolin N., Comi GP. The National Registry of Limb Girdle Muscular Dystrophy: clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients. 19th International Congress of the World Muscle Society, Berlin, October 7th-11th, Neuromuscular disorders, vol.24 (9-10), p.892, Ronchi D., SciaccoM., Bordoni A., Colombo I., Piga D., Fortunato F., Moggio M., Comi G.P. The novel non-sense mutation m.4214g>a in MT-ND1 results in mitochondrial myopathy with severe complex I deficiency 19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin, Germany. 9.Ronchi D., Bonato S., Di Biase E., Melzi V., Trezzi I., Corti S., Bresolin N., Comi G.P., Di Fonzo A. Mutational analysis of COQ2 in Italian patients with MSA. American Academy of Neurology 66th Annual Meeting, April 26 to May 3, 2014 in Philadelphia, PA, USA. 35

36 10. Ronchi D., Ripolone M., Barca E., Berardinelli A., Mora M., Morandi L., Bordoni A., Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Vallejo D., Corti S, Toscano A., Sciacco M., Di Mauro S., Comi G.P., Moggio M.. Defective muscle mitochondrial biogenesis in spinal muscular atrophy American Academy of Neurology 66th Annual Meeting, April 26 to May 3, 2014 in Philadelphia, PA, USA. 11. Ronchi D., Previtali S., Magri F., Corti S., Comi G.P. A novel splice-site mutation in SMN1 resulting in a very severe SMA1 phenotype 19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin, Germany. 12. Lanfranconi, S. Ronchi, D. Ahmed, N. Basilico, P. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. A novel mutation in KRIT1 gene associated with familial cerebral cavernous malformations Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, Turkey 13. Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P., Fortunato F., Bordoni A., Tonin P., Filosto M., Previtali S., Mongini T., Vercelli L., Vittonatto E., Toscano A., Musumeci O., Barca E., Angelini C., Lamperti C., Mora M., Morandi L., Moggio M. Late-onset Pompe Disease: Histopathological, biochemical and clinical assessment before and after ERT. 19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin, Germany. 14. Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P., Fortunato F., Bordoni A., Tonin P., Filosto M., Previtali S., Mongini T., Vercelli L., Vittonatto E., Toscano A., Musumeci O., Barca E., Angelini C., Lamperti C., Mora M., Morandi L., Moggio M. Late-onset Pompe disease: Histopathological, biochemical and clinical assessment before and after ERT. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), July , Nice, France 15. Comi GP, Pagliarani S, Ulzi G, Lucchiari S, Seidita F, Bordoni A, Nizzardo M, Corti S, Violano R, Ripolone M, Moggio M, Bresolin N. A constitutive knockout animal model for Glycogen Storage Disease type III. PS2-236/#175. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia. 16. Sabrina Lucchiari. Glycogen Storage Disease Type III: a novel Agl KO mouse model. V Congreso Internacional de Glucogenosis, 4-8 Giugno 2014, Barcellona, Spagna. 17. Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D Adda E, Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. Adult polyglucosan body disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian family. PS2-237/#205. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia. 18. Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D Adda E, Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi G, Moggio M. 36

37 Adult Polyglucosan Body Disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian family. EFNS-ENS Joint Congress of Neurology, 31 Maggio 3 Giugno 2014, Istanbul, Turchia. 19. Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte Camerino D. Functional and pharmacological characterzation of a new hnav1.4 sodiun channel mutation causing myotonia permanens. PS2-195#383. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia. 20 Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte Camerino D. Pharmacogenetics of hnav1.4 sodium channel mutations causing myotonia. XIV Congresso Nazionale Associazione Italiana di Miologia, 8-10 Maggio 2014, Sirmione, Italia. 21. Lucchiari S, Pagliarani S, Ulzi G, Modoni A, Scarlato M, Magri F, D Amico A, Previtali S, Corti S, Meola G, Lo Monaco M, Sansone V, Comi GP. Genetic analysis of non-dystrophic myotonias in Italian patients. 22. D. Saccomanno, C. Tomba, F. Magri, L. Roncoroni, M.T. Bardella, G.P. Comi, N. Bresolin, L. Elli. Anti-sulphatide reactivity in patients with celiac disease. 9th International Congress on Autoimmunity, Nizza, Francia, Marzo Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S, DalMas A, Bucchia M, Frattini E, Stuppia G, Magri F, Bresolin N, Pagani F, Comi G, Corti S. Spinal Muscular Atrophy Phenotype Is Ameliorated Either By SMN Increase Or Modulation Of Secondary Cell Death Events With RNA Therapy. 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Corti S, Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Bucchia M, Rinchetti P, Zanetta C, Faravelli I, Monguzzi E, Magri F, Bresolin N, Comi G. ipsc-derived Neural Stem Cells Ameliorate The Phenotype Of Spinal Muscular Atrophy with Respiratory Distress Type 1 (SMARD1). 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S, DalMas A, Bucchia M, Frattini E, Stuppia G, Magri F, Bresolin N, Pagani F, Comi G, Corti S. Spinal Muscular Atrophy Phenotype Is Ameliorated Either By SMN Increase Or Modulation Of Secondary Cell Death Events With RNA Therapy. 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Riboldi, G. Rizzo, F. Ranieri, M. Brajkovic, S. Stuppia, G. Nizzardo, M. Simone, C. Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Magri, F. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. TI Modelling pathogenesis and treatment of Mitofusin 2 disease using patient-specific ipscs EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY, 21 EP1161 BP 136 EP 136 SU 1 PD MAY

38 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY European Federat Neurol Soc PT J 27.Ranieri, M. Riboldi, G. Brajkovic, S. Corti, S. Simone, C. Nizzardo, M. Rizzo, F. Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Rinchetti, P. Zanetta, C. Faravelli, I. Monguzzi, E. Magri, F. Bresolin, N. Comi, G. P. TI ipsc-derived neural stem cells improve the phenotype of spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21 EP4117 BP 328 MAY 2014 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY SP European Federat Neurol Soc 28.Brajkovic, S. Riboldi, G. Ranieri, M. Nizzardo, M. Simone, C. Rizzo, F. Ruggieri, M. Salani, S. Dal Mas, A. Bucchia, M. Frattini, E. Stuppia, G. Magri, F. Bresolin, N. Pagani, F. Comi, G. P. Corti, S. TI RNA-based strategies leading to either an increase of SMN or modulation of disease pathways ameliorated spinal muscular atrophy phenotype EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21 EP4119 MAY 2014 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY SP European Federat Neurol Soc 29.Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., DalMas A., Bucchia M., Frattini E., Stuppia G., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi GP., Corti S. Amelioration of spinal muscular atrophy using RNA therapy to increase SMN level and modulate other secondary therapeutic targets. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Corti S., Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Zanetta C., Faravelli I., Magri F., Bresolin N., Comi GP: Improvement of SMARD1 phenotype using ipsc-derived neural stem cells transplantation. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Riboldi G., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Porro F., Bresolin N., Comi GP Corti S. ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in SMARD1, SFN Bucchia M., Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Dametti S., Ramirez A., Frattini E., Pagliarani S., Bresolin N., Pagani F., Comi GP, Corti S. Regulation of SMN and other key pathogenetic events in Spinal Muscular Atrophy (SMA): Moving to RNA-Based treatment strategies, SFN Lavori pubblicati come Abstract a congressi nazionali 1. S.Lucchiari, S.Pagliarani, G.Ulzi, A.Modoni, M.Scarlato, F.Magri, A.D Amico, S.Previtali, S.Corti, G.Meola, M. Lo Monaco, V.Sansone, G.P. Comi Genetic analysis of non-dystrophic myotonias in Italian patients. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May (oral presentation) 2. F. Polenghi, I. Colombo, F. Magri, M. Sciacco, G. Fagiolari, S. Gandossini, E. Brighina, D. Piga, G.P. Comi, N. Bresolin, M. Moggio, M.G. 38

39 D Angelo Late onset ophthalmoplegia in a typical neonatal congenital myopathy. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May (oral presentation) 3. F. Magri, A. Govoni, R. Brusa, C. Angelini, M.G. D Angelo, T. Mongini, A. Toscano, G. Siciliano, G. Tomelleri, M. Mora, V. Nigro, E. Pegoraro, L. Morandi, O. Musumeci, M. Sciacco, G. Ricci, I. Moroni, S. Gandossini, R. Del Bo, F. Fortunato, D. Ronchi, S. Corti, M. Moggio, N. Bresolin, G.P. Comi The National Registry of Limb Girdle Muscular Dystrophy: clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May (oral presentation presenting author) 4. S. Corti, C. Simone; M. Nizzardo, F. Rizzo, M. Ruggieri, S. Salani, M. Bucchia, P. Rinchetti, F. Magri, N. Bresolin, G. Comi ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May (oral presentation) 5. L. Villa, S. Testolin, L. Peverelli, P. Ciscato, F. Magri, F. Tiberio, M. Sciacco, G. Comi, M. Moggio Natural history of muscle pathology in 40 DMD patients aged 1 to 10 years: morphologic and morphometric analysis. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May F. Magri, I. Colombo, R. Del Bo, A. Govoni, M. Scarlato, R. Brusa, P. Ciscato, S. Previtali, D. Piga, M.G. D Angelo, M. Moggio, G.P. Comi ISPD mutations account for a small proportion of Italian limb girdle muscular dystrophy. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May D. Piga, F. Magri, M. Moggio, G. Fagiolari, M.G. D Angelo, A. Cavallini, N. Bresolin, G.P. Comi, V. Nigro. New RYR1 mutations discovered by next generation sequencing in congenital myopathy patients with different phenotypes. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May M. Nizzardo, C. Simone, S. Dametti, A. Ramirez, A. Dal Mas, E. Frattini, G. Riboldi, F. Magri, N. Bresolin, F. Pagani, G.P. Comi, S. Corti. RNA therapy for Spinal Muscular Atrophy by SMN increase or modulation of secondary cell death events. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May Ronchi D., Ahmed N., Di Fonzo A., Bordoni A., Piga D., Rizzuti M., Melzi V., Corti S., Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. The application of next-generation sequencing in the discovery of novel genetic defects in adult patients affected by mitochondrial disorders featuring muscle mtdna instability. Il sequenziamento di nuova generazione in genetica umana e medica. Convegno nazionale della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU), Ottobre 2014 Bologna. 10.Ronchi D., Di Fonzo A. Ahmed N., Piga D., Bordoni A., Rizzuti M., Corti S., Bresolin N., Comi G.P. 39

40 In-depth analysis of muscle mitochondrial DNA in adult onset disorders featuring mitochondrial genome instability. 2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano. 11.Ronchi D., Ripolone M., Rizzuti M., Bordoni A., Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Corti S., Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. Defective muscle mitochondrial biogenesis and delayed muscle maturation in spinal muscular atrophy 2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano 12. Ripolone M., Ronchi D., Violano R., Vallejo D., Fagiolari G., Lucchini V., Barca E., Berardinelli A., Ballottin U., Morandi L., Mora M., Toscano A., Grimoldi N., Tiberio F., Bordoni A., Fortunato F., Corti S., Di Mauro S., Comi G.P., Sciacco M., Moggio M. Muscle mitochondrial dysfunction due to defective mitochondrial biogenesis in SMA patients. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D Adda E, Morandi L, Farina L, Riva M, Grimoldi N, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. Heterogeneity of an Italian family affected with Adult polyglucosan body disease. XIV Congresso Nazionale Associazione Italiana di Miologia, 8-10 Maggio 2014, Sirmione, Italia. 14. Lucchiari S., Pagliarani S., Ulzi G., Modoni A., Scarlato M., Magri F., D Amico A., Previtali S., Corti S., Meola G., Lo Monaco M., Sansone V., Comi G.P. Genetic analysis of non- dystrophic myotonias in Italian patients, XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Corti S., Simone C.; Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Magri F., Bresolin N., Comi G. ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Nizzardo M., Simone C., Dametti S., Ramirez A., Dal Mas A., Frattini E., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi G.P., Corti S. RNA therapy for Spinal Muscular Atrophy by SMN increase or modulation of secondary cell death events XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione

41 LABORATORIO CELLULE STAMINALI NEURALI PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA 2014 Responsabile: Dott.ssa Stefania Corti Medici: Dott.ssa Giulietta Riboldi Dott.ssa Irene Favarelli Biologi: Dott. Sabrina Salani Dott. Chiara Simone Dott. Federica Rizzo Dott. Monica Bucchia Dott. Agnese Ramirez Dott. Sara Dametti Dott. Valeria Parente Biotecnologi Dott. Monica Nizzardo Dott. Paola Rinchetti 41

42 PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA 2014 L attivita di ricerca del Laboratorio di Cellule Staminali Neurali è dedicata allo sviluppo di strategie terapeutiche cellulari e molecolari per patologie neurodegenerative (in particolare malattie del motoneurone ad esordio infantile Atrofia Muscolare Spinale e Atrofia muscolare spinale con distress respiratorio o adulto come la Sclerosi Laterale Amiotrofica) e neuropatie ereditarie (Malattia di Charcot-Marie-Tooth 2 di tipo 2A). Il trapianto di cellule staminali può rappresentare un possibile approccio terapeutico per le malattie neurodegenerative ed in particolare per le malattie del motoneurone. I meccanismi attraverso i quali agisce sono molteplici ed includono oltre alla sostituzione cellulare, anche il rilascio di fattori neuroprotettivi prodotti dalle cellule trapiantate. Nel nostro laboratorio sono inoltre allo studio strategie terapeutiche molecolari con oligonucleotidi in particolare con chimica morfolino e di terapia genica con vettori adenoassociati (AAV). Sono qui presentati in sintesi i risultati ottenuti dalle nostre ricerche nel Utilizzo di cellule staminali neuronali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (ipsc) per lo sviluppo di una terapia cellulo-mediata per l Atrofia Muscolare Spinale con Distress Respiratorio di tipo 1 (Simone et al., 2014) L Atrofia Muscolare Spinale con Distress Respiratorio di tipo 1 (SMARD1) è una patologia neuromuscolare autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene IGHMBP2. Attualmente non esiste una cura risolutiva per questa patologia. Il trapianto di cellule staminali neuronali (NSC) rappresenta una strategia terapeutica promettente per le malattie del motoneurone: le NSC, una volta trapiantate ed integrate nel tessuto ospite, possono agire attraverso diversi meccanismi tra i quali il rilascio di fattori neuroprotettivi, la riduzione di sostanze tossiche nel microambiente e la sostituzione di altre cellule non-neuronali. Nel nostro laboratorio le NSC sono state generate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (ipsc) ed è stato dimostrato il loro elevato potenziale terapeutico applicato a questa patologia. Precedentemente abbiamo documentato che le NSC trapiantate nel modello murino di SMARD1 sono in grado di integrarsi correttamente nel tessuto ospite, di differenziare in neuroni, astrociti e oligodendrociti e di migliorare il fenotipo patologico svolgendo un azione neuroprotettiva sui motoneuroni endogeni in degenerazione. Abbiamo ottenuto un modello umano in vitro della patologia differenziando in motoneuroni le ipsc derivate da pazienti affetti da SMARD1. Queste cellule ricapitolano alcuni aspetti della malattia umana, tra cui una significativa riduzione della sopravvivenza cellulare e della lunghezza assonale. Abbiamo 42

43 riscontrato un miglioramento del fenotipo patologico nei motoneuroni SMARD1 posti in cocoltura con NSC umane sane. Ulteriori indagini sperimentali ci hanno permesso di approfondire i meccanismi molecolari mediante i quali le NSC esercitano il loro effetto neuroprotettivo: abbiamo dimostrato la capacità delle NSC derivate da ipsc di produrre fattori neurotrofici in grado di inibire due chinasi, GSK-3 e HGK, coinvolte nell attivazione di un pathway che determina la morte cellulare. I nostri dati supportano il ruolo delle ipsc come modello di malattia SMARD1 e il loro potenziale traslazionale come terapia per le malattie del motoneurone. Pubblicazioni Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Riboldi G, Salani S, Bucchia M, Bresolin N, Comi GP, Corti S. ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1. Stem Cell Reports Aug 12;3(2): Sviluppo di una terapia cellulo-mediata per la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) (Nizzardo et al., 2014) La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurologica caratterizzata dalla degenerazione selettiva dei motoneuroni. Attualmente non esistono terapie risolutive per questa patologia. La nostra ricerca ha come oggetto lo sviluppo di una terapia cellulo-mediata per la SLA basata sul trapianto di cellule staminali neuronali (NSCs) ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte (ipsc). Nel nostro laboratorio, abbiamo generato linee cellulari ipsc da pazienti SLA e da soggetti sani con un metodo non virale e le abbiamo caratterizzate verificandone la pluripotenza e l espressione di marker specifici di staminalita. Abbiamo quindi differenziato le ipscs in NSCs isolando diverse sottopopolazioni cellulari in particolare una sottopopolazione con una elevata attività aldeide deidrogenasica, basso side scatter ed elevata espressione per il marcatore VLA4. Dopo aver differenziato le cellule NSCs-ALDHhiSSCloVLA4 mediante l utilizzo di specifici protocolli gia validati nel nostro laboratorio, le abbiamo trapiantate a livello sistemico e a livello intratecale nel modello murino di SLA SOD1G93A. Le cellule NSC trapiantate hanno dimostrato una buona capacità di migrazione e di integrazione nel sistema nervoso ospite con entrambi i metodi di somministrazione. I modelli SLA trattati hanno presentato un miglioramento delle funzioni neuromuscolari e un aumento della sopravvivenza soprattutto a seguito dell iniezione sistemica. Abbiamo inoltre identificato la produzione di fattori neurotrofici e la riduzione di micro e macrogliosi, come i meccanismi molecolari responsabili di questi effetti positivi, 43

44 come dimostrato dagli esperimenti di immunoistochimica e di ELISA. Abbiamo inoltre dimostrato che le NSC inducono un decremento dell astrogliosi reattiva attraverso l attivazione del recettore vanilloide TRPV1. Attualmente stiamo valutando la possibilità di selezionare le NSCs non solo per l integrina VLA4, ma anche per CXCR4, un recettore importante per la migrazione cellulare. Il nostro studio ha dimostrato che il trapianto di NSC può avere un effetto positivo nella SLA, potenzialmente utile anche nell ambito di altre malattie del motoneurone. Pubblicazioni Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Riboldi G, Faravelli I, Zanetta C, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Minimally invasive transplantation of ipsc-derived ALDHhiSSCloVLA4+ neural stem cells effectively improves the phenotype of an amyotrophic lateral sclerosis model. Hum Mol Genet Jan 15;23(2): Sviluppo di una terapia genica per l Atrofia Muscolare Spinale con Distress Respiratorio di tipo 1 (Nizzardo et al., submitted) La causa della SMARD1 è stata attribuita ad una mutazione localizzata sul cromosoma 11q13 a livello del gene IGHMBP2. In un altra patologia del motoneurone, l Atrofia Muscolare Spinale (SMA), è stato dimostrato recentemente che la terapia genica mediata dall adenovirus AAV9 può portare al recupero del fenotipo nel modello animale. Attualmente è in corso un trial clinico che prevede l utilizzo di questa strategia nella SMA. Nel nostro studio abbiamo dimostrato che sostituendo il gene mutato nel modello animale di SMARD1 è possibile recuperarne il fenotipo patologico. Abbiamo somministrato per via sistemica il gene wild-type IGHMBP2 utilizzando come vettore l adenovirus associato del sierotipo 9 (AAV9) e abbiamo riscontrato, in seguito a questo trattamento, il ripristino dei livelli di proteina wild-type e il recupero delle funzioni motorie, della fisiologia neuromuscolare e della sopravvivenza. Per valutare questa strategia nel modello cellulare umano, motoneuroni derivati dalle ipsc generate da fibroblasti di pazienti affetti da SMARD1 sono stati trasfettati con il gene wild-type IGHMBP2. Anche in questo modello cellulare è stato possibile rilevare un aumento della sopravvivenza e della lunghezza assonale dei motoneuroni trattati. I nostri data supportano il potenziale traslazionale di una terapia genica mediata da AAV9 per la patologia SMARD1, ponendo le basi per poter testare questo approccio terapeutico in trial clinici umani. Pubblicazioni 44

45 Monica Nizzardo, Chiara Simone, Federica Rizzo, Sabrina Salani, Sara Dametti, Paola Rinchetti, Roberto Del Bo, Kevin Foust, Brian Kaspar, Nereo Bresolin, Giacomo P. Comi, and Stefania Corti. Gene therapy rescues disease phenotype in a SMARD1 mouse model. Manuscript submitted Sviluppo di una terapia con oligonucleotidi per l Atrofia Muscolare Spinale e la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) (Nizzardo et al., 2014) L Atrofia Muscolare Spinale (SMA) e la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) sono malattie del motoneurone per le quali attualmente non esiste una terapia efficace. La SMA è causata da mutazioni del gene Survival Motor Neuron 1 (SMN1), con conseguente riduzione dei livelli della proteina SMN. Nel genoma umano è presente un gene paralogo di SMN1, ossia SMN2, che differisce da SMN1 per pochi nucleotidi tra cui un nucleotide critico nell esone 7. Questo nucleotide determina una modificazione nello splicing di SMN2, con conseguente perdita dell esone 7 nel trascritto maturo e produzione di una proteina SMN tronca e non funzionante. Un promettente approccio terapeutico è rappresentato dall utilizzo di oligonucleotidi antisenso (ASO) in particolare con chimica morfolino (MO), per modificare lo splicing di SMN2 ed incrementare l espressione della proteina SMN. In questo progetto abbiamo disegnato e prodotto una molecola di MO della lunghezza di 25 nucleotidi, complementare alla regione ISS-N1 del gene SMN2. Abbiamo dimostrato che questa sequenza è in grado di modificare lo splicing di SMN2 nel modello murino di SMA, con aumento dei livelli di espressione della proteina SMN funzionale. I topi trattati hanno presentato un miglioramento fenotipico con una maggiore sopravvivenza e ripristino della funzionalità neuromuscolare. Partendo da questi presupporti stiamo studiando un metodo per incrementare la biodistribuzione del morfolino nei tessuti attraverso la coniugazione con peptidi. Mentre la SMA è una malattia a causa genetica, la maggior parte dei casi di SLA non presentano una chiara eziologia genetica e sono definiti come casi sporadici, mentre il 10% sono casi familiari. Tuttavia sono stati identificati diversi geni correlati allo sviluppo della patologia e particolarmente frequenti sono risultate le mutazioni a carico del gene che codifica per una proteina, la Cu/Zn superossidodismutasi 1 (SOD1). È stato ipotizzato che alterazioni della proteina SOD1, quali l errato misfolding con successiva aggregazione all interno del citoplasma, abbiano un effetto tossico sia nei casi familiari sia in quelli sporadici, quindi la riduzione della quantità di proteina mutata potrebbe rallentare la progressione della malattia. Abbiamo quindi pensato di applicare la strategia con oligonucleotidi antisenso per ridurre la 45

46 sintesi della proteina SOD1 mutata. I nostri dati preliminari dimostrano l efficacia degli oligonucleotidi nel ridurre la proteina mutata in vitro e in vivo. Il nostro lavoro contribuirà allo sviluppo di una terapia per le malattie del motoneurone a causa genetica, applicabile successivamente, con le dovute modifiche, ad altre patologie neurodegenerative. Pubblicazioni Monica Nizzardo, Chiara Simone, Sabrina Salani, Marc-David Ruepp, Federica Rizzo, Margherita Ruggieri, Simona Brajkovic, Hong Moulton, Oliver Muehlemann, Nereo Bresolin, Giacomo P. Comi and Stefania Corti, Combined Systemic and Local Morpholino Treatment Rescues the Phenotype of SMA Δ7 Mouse Model. Clinical Therapeutics, 2014 Manoscritto in preparazione Cellule staminali pluripotenti indotte per lo sviluppo di un approccio terapeutico per la Charchot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) (Rizzo et al., manuscript in preparation) La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) è una polineuropatia sensitivomotoria caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni motori e sensitivi, che risulta in una progressiva debolezza agli arti, atrofia muscolare e perdita della sensibilità. La patologia è dovuta a mutazioni nel gene Mitofusina 2 (MFN2), che codifica per una proteina localizzata a livello dei mitocondri, essenziale per la sopravvivenza delle cellule e per il loro corretto funzionamento. Ad oggi, purtroppo non esistono terapie risolutive per questa patologia. Obiettivo del nostro studio è approfondire la conoscenza dei meccanismi responsabili della malattia, identificare nuovi bersagli terapeutici e definire biomarcatori del fenotipo patologico. In questo progetto, abbiamo inizialmente ottenuto fibroblasti da pazienti affetti da CMT2A che presentavano diverse mutazioni nel gene MFN2. La riprogrammazione di queste cellule in ipsc e il successivo differenziamento in motoneuroni e neuroni sensitivi ci ha offerto la possibilità di ottenere un modello in vitro specifico della malattia. Sfruttando questa metodica, abbiamo ottenuto diverse linee di ipsc da pazienti CMT2A e abbiamo dimostrato il differenziamento in motoneuroni paziente specifici. Le cellule così ottenute presentano alcuni aspetti tipici della patologia, come le alterazioni della localizzazione dei mitocondri, la riduzione della quantita di DNA mitocondriale e dell attivita dei complessi della catena respiratoria. Questi difetti sono risultati più evidenti nelle cellule neuronali rispetto ai fibroblasti, in accordo con la specificità neuronale della patologia. Accanto ai modelli in vitro, abbiamo condotto le analisi degli stessi aspetti anche nell unico modello murino attualmente 46

47 disponibile di CMT2A (MitoCharc1), con lo scopo di caratterizzarlo in modo approfondito e di individuare biomarcatori specifici del fenotipo patologico. Ci siamo dedicati anche allo sviluppo di un approccio terapeutico per questa patologia. A questo proposito, abbiamo silenziato il gene MFN2 endogeno mediante short hairpin RNA (shrna) nei fibroblasti CMT2A. In parallelo, nelle stesse cellule, per recuperare i normali livelli di espressione del gene MFN2, abbiamo introdotto il c-dna del gene MFN2 sano modificato in modo da resistere al processo di silenziamento. I risultati ottenuti con questa strategia nei fibroblasti CMT2A sono stati molto promettenti e ci hanno permesso di ottenere alcuni dati preliminari anche nel modello murino. Questo studio ha contribuito ad approfondire i meccanismi molecolari patogenetici attraverso la generazione di un modello in vitro di CMT2A con ipsc specifiche dei pazienti e di identificare una possibile strategia terapeutica per la CMT2A. Pubblicazioni Manoscritto in preparazione Sviluppo di una terapia per l Atrofia Muscolare Spinale (SMA) attraverso un approccio di genome editing (Dametti et al.; Nizzardo et al., manuscripts in preparation) L Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una malattia a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata dalla progressiva perdita dei motoneuroni spinali. La SMA costituisce la causa genetica più comune di mortalità infantile. Essa è dovuta a mutazioni a livello del gene Survival Motor Neuron 1 (SMN1), che causano la diminuzione dei livelli cellulari della proteina SMN da esso codificata. Questa proteina svolge un ruolo fondamentale nella sopravvivenza dei motoneuroni: una quantità insufficiente di SMN ha come conseguenza la degradazione dei motoneuroni. Nel genoma umano è presente il gene omologo SMN2, che differisce da SMN1 per pochi nucleotidi. In particolare, la transizione nucleotidica C-T nell esone 7 causa un alterazione di splicing che comporta l esclusione dell esone 7 nella maggior parte dei trascritti (SMNΔ7). Solo il 10% della proteina codificata da SMN2 è full lenght e funzionante; il rimanente 90% consiste in una forma proteica tronca e funzionalmente difettosa. Non esiste una terapia della SMA, quindi la ricerca di nuove strategie terapeutiche è fondamentale. Un possibile approccio sperimentale consiste in un intervento a livello della sequenza del gene SMN2 in modo da compensare la perdita di SMN1 utilizzando le tecniche di genome editing, che offrono la possibilità di effettuare la correzione in situ del gene. Lo sviluppo delle Zinc Finger Nuclease (ZFN) ha permesso l applicazione del genome editing in linee cellulari primarie e pluripotenti, tra cui le cellule staminali pluripotenti indotte (ipscs). È stato 47

48 dimostrato che le ZFN sono in grado di promuovere un efficiente genome editing attraverso il processo di riparazione per ricombinazione omologa, inducendo una rottura sito-specifica nel doppio filamento di DNA. Nel nostro laboratorio stiamo elaborando una strategia terapeutica per la SMA utilizzando le NSC differenziate da cellule staminali specifiche di pazienti SMA corrette ex-vivo. Inizialmente abbiamo corretto nelle ipscs-sma il gene SMN2, convertendolo in SMN1, attraverso la strategia delle ZFN. Abbiamo in programma il differenziamento delle ipscs corrette in NSC, che verranno trapiantate, per via intratecale, nel modello murino di SMAΔ7. Confronteremo l efficacia terapeutica delle cellule corrette rispetto alle cellule wild-type e alle cellule SMA non corrette e ne valuteremo parametri quali la sopravvivenza, differenziamento e funzionalità. Pubblicazioni Nizzardo M., Simone C., Dametti S., Ramirez A., Dal Mas A., Frattini E., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi G.P., Corti S. RNA therapy for Spinal Muscular Atrophy by SMN increase or modulation of secondary cell death events XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione 2014 Bucchia M., Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Dametti S., Ramirez A., Frattini E., Pagliarani S., Bresolin N., Pagani F., Comi GP, Corti S. Regulation of SMN and other key pathogenetic events in Spinal Muscular Atrophy (SMA): Moving to RNA-Based treatment strategies, SFN Manoscritti in preparazione 48

49 ELENCO LAVORI SCIENTIFICI 2014 Articoli in extenso 1: Frattini E, Ruggieri M, Salani S, Faravelli I, Zanetta C, Nizzardo M, Simone C, Magri F, Corti S. Pluripotent stem cell-based models of spinal muscular atrophy. Mol Cell Neurosci Dec 12;64C: doi: /j.mcn [Epub ahead of print] PubMed PMID: : Smith BN, Ticozzi N, Fallini C, Gkazi AS, Topp S, Kenna KP, Scotter EL, Kost J, Keagle P, Miller JW, Calini D, Vance C, Danielson EW, Troakes C, Tiloca C, Al-Sarraj S, Lewis EA, King A, Colombrita C, Pensato V, Castellotti B, de Belleroche J, Baas F, ten Asbroek AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, McLaughlin RL, Polak M, Asress S, Esteban-Pérez J, Muñoz-Blanco JL, Simpson M; SLAGEN Consortium, van Rheenen W, Diekstra FP, Lauria G, Duga S, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G, Morrison KE, Williams KL, Nicholson GA, Blair IP, Dion PA, Leblond CS, Rouleau GA, Hardiman O, Veldink JH, van den Berg LH, Al-Chalabi A, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, García-Redondo A, Wu Z, Glass JD, Gellera C, Ratti A, Brown RH Jr, Silani V, Shaw CE, Landers JE. Exome-wide rare variant analysis identifies TUBA4A mutations associated with familial ALS. Neuron Oct 22;84(2): doi: /j.neuron Epub 2014 Oct 22. PubMed PMID: : Rizzuti M, Nizzardo M, Zanetta C, Ramirez A, Corti S. Therapeutic applications of the cell-penetrating HIV-1 Tat peptide. Drug Discov Today Sep 30. pii: S (14) doi: /j.drudis [Epub ahead of print] PubMed PMID: : Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Riboldi G, Salani S, Bucchia M, Bresolin N, Comi GP, Corti S. ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1. Stem Cell Reports Aug 12;3(2): doi: /j.stemcr Epub 2014 Jul 4. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC : Porro F, Rinchetti P, Magri F, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Zanetta C, Faravelli I, Corti S. The wide spectrum of clinical phenotypes of spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1: a systematic review. J Neurol Sci Nov 15;346(1-2): doi: /j.jns Epub 2014 Sep 16. PubMed PMID: : Faravelli I, Bucchia M, Rinchetti P, Nizzardo M, Simone C, Frattini E, Corti S. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Res Ther Jul 14;5(4):87. doi: /scrt476. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC : Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti S, Corti S, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Glycogen storage disease type III: A novel Agl knockout mouse model. Biochim Biophys Acta Nov;1842(11): doi: /j.bbadis Epub 2014 Aug 1. PubMed PMID:

50 8: Lanfranconi S, Ronchi D, Ahmed N, Civelli V, Basilico P, Bresolin N, Comi GP, Corti S. A novel CCM1 mutation associated with multiple cerebral and vertebral cavernous malformations. BMC Neurol Aug 3;14:158. doi: /s PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC : Bushby K, Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW, Flanigan KM, Goemans N, Jones KJ, Mercuri E, Quinlivan R, Renfroe JB, Russman B, Ryan MM, Tulinius M, Voit T, Moore SA, Lee Sweeney H, Abresch RT, Coleman KL, Eagle M, Florence J, Gappmaier E, Glanzman AM, Henricson E, Barth J, Elfring GL, Reha A, Spiegel RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP (Corti S). Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy. Muscle Nerve Oct;50(4): doi: /mus PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC : van Doormaal PT, Ticozzi N, Gellera C, Ratti A, Taroni F, Chiò A, Calvo A, Mora G, Restagno G, Traynor BJ, Birve A, Lemmens R, van Es MA, Saris CG, Blauw HM, van Vught PW, Groen EJ, Corrado L, Mazzini L, Del Bo R, Corti S, Waibel S, Meyer T, Ludolph AC, Goris A, van Damme P, Robberecht W, Shatunov A, Fogh I, Andersen PM, D'Alfonso S, Hardiman O, Cronin S, Rujescu D, Al-Chalabi A, Landers JE, Silani V, van den Berg LH, Veldink JH. Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter survival study. Neurobiol Aging Oct;35(10):2420.e13-4. doi: /j.neurobiolaging Epub 2014 Apr 19. PubMed PMID: : Riboldi G, Zanetta C, Ranieri M, Nizzardo M, Simone C, Magri F, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Antisense oligonucleotide therapy for the treatment of C9ORF72 ALS/FTD diseases. Mol Neurobiol Dec;50(3): doi: /s Epub 2014 May 9. PubMed PMID: : Di Fonzo A, Ronchi D, Gallia F, Cribiù FM, Trezzi I, Vetro A, Della Mina E, Limongelli I, Bellazzi R, Ricca I, Micieli G, Fassone E, Rizzuti M, Bordoni A, Fortunato F, Salani S, Mora G, Corti S, Ceroni M, Bosari S, Zuffardi O, Bresolin N, Nobile-Orazio E, Comi GP. Lower motor neuron disease with respiratory failure caused by a novel MAPT mutation. Neurology Jun 3;82(22): doi: /WNL Epub 2014 May 7. PubMed PMID: : Pupillo E, Messina P, Giussani G, Logroscino G, Zoccolella S, Chiò A, Calvo A, Corbo M, Lunetta C, Marin B, Mitchell D, Hardiman O, Rooney J, Stevic Z, Bandettini di Poggio M, Filosto M, Cotelli MS, Perini M, Riva N, Tremolizzo L, Vitelli E, Damiani D, Beghi E; EURALS Consortium (Corti S). Physical activity and amyotrophic lateral sclerosis: a European population-based casecontrol study. Ann Neurol May;75(5): doi: /ana Epub 2014 May 21. PubMed PMID: : Faravelli I, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Zanetta C, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Stem cell transplantation for amyotrophic lateral sclerosis: therapeutic potential and perspectives on clinical translation. Cell Mol Life Sci Sep;71(17): doi: /s Epub 2014 Apr 4. Review. PubMed PMID:

51 15: Nizzardo M, Simone C, Salani S, Ruepp MD, Rizzo F, Ruggieri M, Zanetta C, Brajkovic S, Moulton HM, Müehlemann O, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Effect of combined systemic and local morpholino treatment on the spinal muscular atrophy Δ7 mouse model phenotype. Clin Ther Mar 1;36(3): e5. doi: /j.clinthera PubMed PMID: : Ulzi G, Sansone VA, Magri F, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Lucchiari S. In vitro analysis of splice site mutations in the CLCN1 gene using the minigene assay. Mol Biol Rep May;41(5): doi: /s Epub 2014 Jan 23. PubMed PMID: : Zanetta C, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Faravelli I, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Molecular, genetic and stem cell-mediated therapeutic strategies for spinal muscular atrophy (SMA). J Cell Mol Med Feb;18(2): doi: /jcmm Epub 2014 Jan 8. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC : Zanetta C, Nizzardo M, Simone C, Monguzzi E, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Molecular therapeutic strategies for spinal muscular atrophies: current and future clinical trials. Clin Ther Jan 1;36(1): doi: /j.clinthera Epub 2013 Dec 17. PubMed PMID: : Fogh I, Ratti A, Gellera C, Lin K, Tiloca C, Moskvina V, Corrado L, Sorarù G, Cereda C, Corti S, Gentilini D, Calini D, Castellotti B, Mazzini L, Querin G, Gagliardi S, Del Bo R, Conforti FL, Siciliano G, Inghilleri M, Saccà F, Bongioanni P, Penco S, Corbo M, Sorbi S, Filosto M, Ferlini A, Di Blasio AM, Signorini S, Shatunov A, Jones A, Shaw PJ, Morrison KE, Farmer AE, Van Damme P, Robberecht W, Chiò A, Traynor BJ, Sendtner M, Melki J, Meininger V, Hardiman O, Andersen PM, Leigh NP, Glass JD, Overste D, Diekstra FP, Veldink JH, van Es MA, Shaw CE, Weale ME, Lewis CM, Williams J, Brown RH, Landers JE, Ticozzi N, Ceroni M, Pegoraro E, Comi GP, D'Alfonso S, van den Berg LH, Taroni F, Al-Chalabi A, Powell J, Silani V; SLAGEN Consortium and Collaborators. A genome-wide association meta-analysis identifies a novel locus at 17q11.2 associated with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet Apr 15;23(8): doi: /hmg/ddt587. Epub 2013 Nov 20. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC : Compagnucci C, Nizzardo M, Corti S, Zanni G, Bertini E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of ipsc technology. Cell Mol Life Sci May;71(9): doi: /s Epub 2013 Nov 20. PubMed PMID: : Ruggieri M, Riboldi G, Brajkovic S, Bucchia M, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Induced neural stem cells: methods of reprogramming and potential therapeutic applications. Prog Neurobiol Mar;114: doi: /j.pneurobio Epub 2013 Nov 15. PubMed PMID: : Rizzo F, Riboldi G, Salani S, Nizzardo M, Simone C, Corti S, Hedlund E. Cellular therapy to target neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis. Cell Mol Life Sci Mar;71(6): doi: /s Epub 2013 Oct 8. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC

52 23: Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Riboldi G, Faravelli I, Zanetta C, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Minimally invasive transplantation of ipsc-derived ALDHhiSSCloVLA4+ neural stem cells effectively improves the phenotype of an amyotrophic lateral sclerosis model. Hum Mol Genet Jan 15;23(2): doi: /hmg/ddt425. Epub 2013 Sep 4. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC Abstracts presentati a Congressi Internazionali 1 Ronchi D, Ripolone M, Barca E, Berardinelli A, Morandi L, Mora M, Bordoni A, Fortunato F, Fagiolari G, Violano R, Vallejo D, Corti S, Toscano A, Sciacco M, DiMauro S, Comi G, Moggio M. Defective Muscle Mitochondrial Biogenesis in Spinal Muscular Atrophy. 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Ronchi D, Bonato S, Di Biase E, Melzi V, Trezzi I, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Di Fonzo A. Mutational Analysis of COQ2 in Italian Patients with MSA. 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S, DalMas A, Bucchia M, Frattini E, Stuppia G, Magri F, Bresolin N, Pagani F, Comi G, Corti S. Spinal Muscular Atrophy Phenotype Is Ameliorated Either By SMN Increase Or Modulation Of Secondary Cell Death Events With RNA Therapy. 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Corti S, Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Bucchia M, Rinchetti P, Zanetta C, Faravelli I, Monguzzi E, Magri F, Bresolin N, Comi G. ipsc-derived Neural Stem Cells Ameliorate The Phenotype Of Spinal Muscular Atrophy with Respiratory Distress Type 1 (SMARD1). 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S, DalMas A, Bucchia M, Frattini E, Stuppia G, Magri F, Bresolin N, Pagani F, Comi G, Corti S. Spinal Muscular Atrophy Phenotype Is Ameliorated Either By SMN Increase Or Modulation Of Secondary Cell Death Events With RNA Therapy. 66 th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology Corti S and Hedlund H. Identification of oculomotor-restricted genes with motor neuron protective properties for the development of ALS therapeutics. TLF meeting Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Bucchia M, Dametti S, Ramirez A, Corti S ALS therapy via transplantation of an ipsc-derived LeX+CXCR4+VLA4+ neural stem cell subpopulation. ENCALS meeting Leuven

53 8 Riboldi, G. Rizzo, F. Ranieri, M. Brajkovic, S. Stuppia, G. Nizzardo, M. Simone, C. Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Magri, F. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. TI Modelling pathogenesis and treatment of Mitofusin 2 disease using patient-specific ipscs EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY, 21 EP1161 BP 136 EP 136 SU 1 PD MAY 2014 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY European Federat Neurol Soc PT J 9 Lanfranconi, S. Ronchi, D. Ahmed, N. Basilico, P. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. P. TI A novel mutation in KRIT1 gene associated with familial cerebral cavernous malformations EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21 EP2115 BP 184 MAY 2014 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY SP European Federat Neurol Soc 10 Ranieri, M. Riboldi, G. Brajkovic, S. Corti, S. Simone, C. Nizzardo, M. Rizzo, F. Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Rinchetti, P. Zanetta, C. Faravelli, I. Monguzzi, E. Magri, F. Bresolin, N. Comi, G. P. TI ipsc-derived neural stem cells improve the phenotype of spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21 EP4117 BP 328 MAY 2014 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY SP European Federat Neurol Soc 11 Brajkovic, S. Riboldi, G. Ranieri, M. Nizzardo, M. Simone, C. Rizzo, F. Ruggieri, M. Salani, S. Dal Mas, A. Bucchia, M. Frattini, E. Stuppia, G. Magri, F. Bresolin, N. Pagani, F. Comi, G. P. Corti, S. TI RNA-based strategies leading to either an increase of SMN or modulation of disease pathways ameliorated spinal muscular atrophy phenotype EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21 EP4119 MAY 2014 Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY SP European Federat Neurol Soc 12 Magri F., Govoni A., Del Bo R., D'angelo MG., Gandossini S., Brusa R., Colombo I., Moroni I., Mongini T., Mora M., Angelini C., Tomelleri G., Siciliano G., Toscano A., Corti S., Bresolin N., Comi GP., Natural history and peculiar aspects in LGMD2B. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., DalMas A., Bucchia M., Frattini E., Stuppia G., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi GP., Corti S. Amelioration of spinal muscular atrophy using RNA therapy to increase SMN level and modulate other secondary therapeutic targets. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Corti S., Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Zanetta C., Faravelli I., Magri F., Bresolin N., Comi GP: Improvement of SMARD1 phenotype using ipsc-derived neural stem cells transplantation. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Riboldi G., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Porro F., Bresolin N., Comi GP Corti S. 53

54 ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in SMARD1, SFN Bucchia M., Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Dametti S., Ramirez A., Frattini E., Pagliarani S., Bresolin N., Pagani F., Comi GP, Corti S. Regulation of SMN and other key pathogenetic events in Spinal Muscular Atrophy (SMA): Moving to RNA-Based treatment strategies, SFN Abstracts presentati a Congressi Nazionali 1. Lucchiari S., Pagliarani S., Ulzi G., Modoni A., Scarlato M., Magri F., D Amico A., Previtali S., Corti S., Meola G., Lo Monaco M., Sansone V., Comi G.P. Genetic analysis of non- dystrophic myotonias in Italian patients, XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Corti S., Simone C.; Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M., Rinchetti P., Magri F., Bresolin N., Comi G. ipsc-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Magri F., Govoni A., Brusa R., Angelini C., D Angelo M.G., Mongini T., Toscano A., Siciliano G., Tomelleri G., Mora M., Nigro V., Pegoraro E., Morandi L., Musumeci O., Sciacco M., Ricci G., Moroni I., Gandossini S., Del Bo R., Fortunato F., Ronchi D., Corti S., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. The National Registry of limb Girdle Muscular dystrophy: clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Nizzardo M., Simone C., Dametti S., Ramirez A., Dal Mas A., Frattini E., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi G.P., Corti S. RNA therapy for Spinal Muscular Atrophy by SMN increase or modulation of secondary cell death events XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione Ripolone M., Ronchi D., Violano R., Vallejo D., Fagiolari G., Lucchini V., Barca E., Berardinelli A., Ballottin U., Morandi L., Mora M., Toscano A., Grimoldi N., Tiberio F., Bordoni A., Fortunato F., Corti S., Di Mauro S., Comi G.P., Sciacco M., Moggio M. Muscle mitochondrial dysfunction due to defective mitochondrial biogenesis in SMA patients. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione

55 UOSD MALATTIE NEURODEGENERATIVE Direttore: Prof. Elio Scarpini Professore Associato di Neurologia Dott.ssa Daniela Galimberti Dottore di Ricerca Scienze Neurologiche e del Dolore Tecnico Laureato Università di Milano Dott.ssa Chiara Fenoglio Dottore di Ricerca Scienze Neurologiche e del Dolore Assegnista Università di Milano Dott.ssa Rossana Bonsi Dottoranda di Ricerca Medicina Molecolare Università di Milano Dott.ssa Maria Serpente Dottore di Ricerca in Medicina Molecolare - Assegnista Università di Milano Dott.ssa Sara Cioffi Biologa - Borsista OMP Dott.ssa Marina Arcaro Biotecnologa-Borsista OMP Dott.ssa Milena De Riz Neurologa Specialista Dirigente medico OMP Dott.ssa Anna Pietroboni Neurologa Specialista Dirigente medico OMP Dott. Andrea Arighi Neurologo Specialista - Dirigente medico OMP Dott. Giorgio Fumagalli Medico Specializzando Dott.ssa Laura Ghezzi Medico Specializzando Dott. Alberto Calvi Medico Specializzando Dott.ssa Paola Basilico Medico Specializzando Dott. Roberto Vimercati Psicologo Borsista OMP Dr.ssa Emanuela Rotondo Psicologa- Dottore di Ricerca - Borsista OMP Dr.ssa Priscilla Corti Psicologa- Dottore di Ricerca Borsista OMP Dott. Matteo Mercurio Psicologo Dottorando di Ricerca - Università di Milano Sig.ra Daniela Da Lisca Segretaria Borsista OMP Sig. Marco Milianti Segretario Borsista OMP Sig.ra Mahin Fardipoor Tecnico Laboratorio Ospedaliero Sig.ra Serena Di Giorgio Laureanda Biologia 55

56 1 - ATTIVITÀ CLINICA ED ASSISTENZIALE Dal punto di vista clinico, il gruppo si è occupato di ricerche cliniche nel campo della Sclerosi Multipla e della malattia di Alzheimer e demenze correlate. I pazienti sono stati seguiti dai componenti del gruppo presso i seguenti Ambulatori Specialistici di secondo livello : 1.1. Ambulatorio Malattie Demielinizzanti del Sistema Nervoso Centrale Nel corso dell anno 2014 sono giunti all ambulatorio per le Malattie Demielinizzanti circa 80 nuovi pazienti. Il numero totale di visite nel corso del 2014 è stato di più di 800 in ambulatori dedicati alla Sclerosi Multipla, attivi sia al mattino che al pomeriggio. È operativo un servizio di Day Hospital per consentire ai pazienti di sottoporsi a trattamenti quali la somministrazione di cortisonici ad alto dosaggio e. v. e l infusione di Immunoglobuline e.v. nonché di effettuare tutte le procedure diagnostiche. Sono stati effettuati circa 200 ricoveri in Day Hospital. Il Servizio è riconosciuto tra i Centri Provinciali autorizzati dalla Regione Lombardia alla dispensazione del beta-interferone Ia e Ib, del Copaxone, del Tysabri (Natalizumab) e del Gylenia (Fingolimod). In particolare, sono al momento registrati in File F per il trattamento 260 pazienti Ambulatorio per la Diagnosi e la Terapia dei Disturbi Cognitivi e della Memoria Nel corso dell anno sono giunti all ambulatorio per la Diagnosi e la Terapia dei Disturbi Cognitivi e della Memoria circa 250 nuovi pazienti. Complessivamente sono state eseguite circa 1200 visite, in ambulatori attivi dal lunedì al venerdì, sia mattina che pomeriggio. Sono stati effettuati 200 ricoveri in regime di Day Hospital per accertamenti diagnostici. Dall ottobre 2000 il Centro è stato riconosciuto da parte della Regione Lombardia come Unita Valutazione Alzheimer (U.V.A) ed inserito nel Progetto CRONOS del Ministero della Sanità. Presso tale Centro afferiscono pazienti con sospetto decadimento cognitivo, inviati dal medico di base o dallo specialista, onde essere sottoposti ad un inquadramento diagnostico rivolto alla malattia di Alzheimer e demenze correlate, ai fini dell inserimento nel progetto CRONOS che prevede l erogazione gratuita dei nuovi farmaci anticolinesterasici. Nell ambito del progetto CRONOS risultano al momento registrati per terapia con anticolinesterasici 260 pazienti. Inoltre, 8 pazienti sono registrati in File F per trattamento con memantina (Ebixa). Riguardo gli esami diagnostici per Sclerosi Multipla, malattia di Alzheimer e Degenerazione Lobare Frontotemporale, sono state effettuate le seguenti prestazioni (sia per pazienti degenti che richieste da ospedali esterni): - esame liquor, IEF per diagnosi di sclerosi multipla: dosaggio Amiloide, Tau totale e fosforilata nel liquor per diagnosi Alzheimer: progranulina plasmatica: estrazione DNA, mutazioni MAPT, progranulina, PS1 e 2, APP: SPERIMENTAZIONI CLINICHE (multicentriche, randomizzate) Open-label, single-arm extention study to the duble-blind, randomized, multicenter, placebocontrolled, parallel-group study comparing the efficacy and safety of 0.5 mg FTY720 administered orally once daily versus placebo in patients with primary progressive multiple sclerosis CFTY720D2306E1

57 Long term, prospective, non-interventional,multinational, parallel-cohort study monitoring safety in patients with MS recently initiated with fingolimod once daily or treated with another approved disease-modifying therapy, Novartis, prot. CFTY720D2406 Transition: A two-year observational study to evaluate the safety profile of fingolimod in patients with MS who switch from natalizumab to fingolimod, Novartis, prot. CFTY720D2405 Studio multicentrico, in aperto, a un solo gruppo di trattamento per valutare la sicurezza, la tollerabilita e l efficacia a lungo termine di 0.5 mg di fingolimod (FTY720) somministrato per via orale una volta al giorno in pazienti con sclerosi multipla, Novartis, prot. CFTY720D2399 A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study of the efficacy of Natalizumab on reducing disability progression in subjects with Secondary Progressive Multiple Sclerosis, with optional open-label extension, Biogen, prot. 101MS326 A multicenter, randomized, double-blind, parallel-group, placebo-controlled variable treatment duration study evaluating the efficacy and safety of Siponimod (BAF312) in patients with secondry progressive MS, Novartis, prot. CBAF312A2304 Studio osservazionale, della durata di 12 mesi, prospettico, che valuta l'impatto del trattamento con DMT sui disturbi dell'umore nei pazienti che hanno ricevuto una diagnosi recente di SM, TEVA, prot. POSIDONIA A Phase 2/3, Multi-Center, Randomized, Double-Blind, placebo-controlled (Part A) and double-blind, double-dummy, active-controlled (Part B), parallel group study to evaluate the efficacy and safety of RPC1063 administered orally to relapsing MS patients, Receptos, prot. RPC1063 Observational, single-arm, multicenter one-day trial in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis (RRMS) patients to characterize (in term of demographic, clinical and neurovegetative aspects) the population for whom extended monitoring after the first dose of fingolimod (Gilenya) was necessary CFTY720DIT08 A prospective observational study to depict the role of adherence as a tool of treatment decision making in RMS subject experiencing first clinical relapse while on 1 st line DMDs (CHOICE) Observational study mobility improvements with spasticity in multiple sclerosis with additional treatment using sativex oromucosal spray (MOVE2) A randomized, multicountry study to evaluate the effectiveness of flobetapir (18F) PET imaging in changing patient management and to evaluate the relationship between florbetapir (18F) PET scan status and cognitive decline (AVID) Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Parallel-Group, 12-Month trial of leucomethylthioninium bis (hydromethanesulfotane) in subjects with Mild to moderate AD, TauRx Therapeutics Ltd, prot. Trx A Placebo-controlled, double-blind, parallel-group, Bayesian Adaptive randomization design and dose Regimen-finding Study to evaluate safety,tolerability and efficacy of BAN2401 in subjects with Early Alzheimer s Disease, EISAI, prot. BAN

58 Randomised, double-blind, parallel-group, placebo-controlled, fixed-dose study of Lu AE58054 in patients with mild-moderate AD treted with donepezil, Lundbeck, 14861A A randomized, Placebo Controlled, Parallel-group, Double Blind efficacy and safety Trial of MK-8931 in Subjects with mild to moderate Alzheimer s Disease, Merck Serono, MK A phase III, Randomized, placebo-controlled, parallel-group, double-blind clinical trial to study the efficacy and safety of MK-8931 in subject with Amnestic Mild Cognitive Impairment due to Alzheimer s Disease (Prodromal AD), MK Continued Efficacy and Safety monitoring of solanezumab, an anti-amyloid beta antibody in patients with Alzheimer s disease (H8A-MC-LZAO) Studio osservazionale in pazienti affetti da SM RR trattati con immunomodulanti volontariamente non complianti, Quintiles, prot. OAK BIIT0112 Effect of passive Immunization on the progression of mild Alzheimer s disease: Solanezumab (LY ) versus Placebo H8A-MC-LZAX A randomized, double-blind, Placebo-controlled, Parallel-group, 26-week, phase 3 study of two doses of EVP-6124 or placebo in subjects with mild to moderate AD currently or previously receiving an Acetylcholinesterase Inhibitor Medication EVP ATTIVITÀ DI RICERCA DI BASE È attualmente presente presso la UOS Malattie Neurodegenerative e Demielinizzanti una banca biologica comprendente: 1) circa 3300 campioni di DNA. Le patologie più rappresentate sono: pazienti con diagnosi di Malattia di Alzheimer con altri tipi di demenza (Degenerazione Lobare Frontotemporale, demenza a corpi di Lewy, demenza vascolare, paralisi sopranucleare progressiva, degenerazione corticobasale) con diagnosi di Sclerosi Multipla 2) circa 400 campioni di liquido cerebrospinale, siero e plasma. Tra questi: pazienti con Sclerosi Multipla con patologie neurodegenerative (prevalentemente malattia di Alzheimer) 3) circa 500 cdna ricavati da RNA estratto da cellule del sangue Nel corso del 2014 l attivita del gruppo si è articolata sulle seguenti tematiche: 1) Ruolo dei microrna nella Sclerosi Multipla (SM) Sono continuate le ricerche iniziate nel corso dello scorso anno, in particolare lo studio di espressione di una nuova classe di molecole, i microrna (mirna) che diverse evidenze sperimentali suggeriscono come possibili marcatori in patologie di varia natura ed eziogenesi. I mirna sono dei modulatori trascrizionali di numerosissimi geni tra i quali anche geni propriamente implicati nella patogenesi della SM. Lo scopo di questo nuovo filone di ricerca è quello di verificare la funzione e il livello di espressione di queste molecole al fine di stabilire la loro possibile utilità come marcatore di patologia. Nel corso degli scorsi anni abbiamo identificato alcuni microrna deregolati nelle cellule circolanti di pazienti con SM (Fenoglio et al., Multiple Sclerosis 2013), e messo a punto una tecnica per dosare i livelli di mirna circolanti, che permette di ottenere dati senza bisogno di isolare le cellule (Ridolfi et al., 2013). Nel 2014 abbiamo proseguito questi studi in pazienti sottoposti a diversi tipi di trattamento 58

59 immonomodulante, e correlato l andamento dei livelli di mirna con i dati clinici e radiologici, al fine di identificare un marcatore che predica la risposta al trattamento. 2) Analisi di mutazioni in pazienti con Degenerazione Lobare Frontotemporale e patologie psichiatriche Sono stati identificate nuove mutazioni in famiglie con forme autosomiche dominanti sia di patologie neurodegenerative che con disturbo bipolare o schizofrenia. Sulla popolazione di pazienti sporadici sono stati effettuati studi di associazione ed identificati fattori di rischio genetici e sono stati analizzati i livelli di molecole infiammatorie nel siero e nel liquido cefalorachidiano. 3) Studi di associazione e di espressione in pazienti con malattia di Alzheimer e studio dei mirna circolanti a livello del liquido cefalorachidiano e del siero. I progetti di ricerca sono stati sviluppati grazie alla collaborazione con Centri sia italiani che stranieri. Tra i primi vi sono: - Prof. A. Maggi, Centro di Biotecnologie Farmacologiche, Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Università di Milano - Prof. C. Mariani, Ospedale L. Sacco, Milano - Dott. G. Forloni, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano - Dr. G. Frisoni, IRCCS S. Giovanni di Dio Fatebenefratelli, Brescia - Dr. S. Cappa, Ospedale S. Raffaele Ville Turro, Milano - Prof. A. Padovani, Università di Brescia - Prof. I. Rainero, prof.ssa M.T. Giordana, Università di Torino Tra i centri esteri: - Dr. R.P. Lisak, Dip. di Neurologia, Detroit (USA) - Prof. P. Scheltens, Dept. of Neurology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Nertherlands - Dr. Howard Feldman, Dept. of Neurology, University of British Columbia, Vancouver, Canada - Prof. A. Compston, Dr. Steven Sawcer, Dept. of Neurology, Cambridge, UK - Dr. A. Reif, Dept. Of Psychiatry and Psychotherapy, Julius-Maximilians-University, Wurzburg, Germany - Dr. Anne Cross, University of Saint Louis, USA - Prof. Philippe Amouyel, Lille, France - Dr. Jonathan Rohrer, UCL, London, UK 4. PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI CENSITE Borroni B, Grassi M, Bianchi M, Bruni AC, Maletta RG, Anfossi M, Pepe D, Cagnin A, Caffarra P, Cappa S, Clerici F, Daniele A, Frisoni GB, Galimberti D, Parnetti L, Perri R, Rainero I, Tremolizzo L, Turla M, Zanetti O, Padovani A. Estimating the Inheritance of Frontotemporal Lobar Degeneration in the Italian Population. Journal of Alzheimer s Disease 2014; 41(2): IF=3, Galimberti D, Arosio B, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi SM, Bonsi R, Rossi P, Abbate C, Mari D, Scarpini E. 59

60 Incomplete Penetrance of the C9ORF72 Hexanucleotide Repeat Expansions: Frequency in a Cohort of Geriatric Non-Demented Subjects. Journal of Alzheimer s Disease 2014;39(1): IF=3, Carecchio M, Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Scarpini E, Comi C, Terazzi E, Cantello R. Evidence of Pre-Synaptic Dopaminergic Deficit in a Patient with a Novel Progranulin Mutation Presenting with Atypical Parkinsonism. Journal of Alzheimer s Disease 2014; 2014;38(4): IF=3, Grande G, Vanacore N, Maggiore L, Cucumo V, Ghiretti R, Galimberti D, Scarpini E, Mariani C, Clerici F. Physical Activity Reduces the Risk of Dementia in Mild Cognitive Impairment Subjects: A Cohort Study. Journal of Alzheimer s Disease 2014;39(4): IF=3, Borroni B, Ferrari F, Galimberti D, Nacmias B, Barone C, Bagnoli S, Fenoglio C, Piaceri I, Archetti S, Bonvicini C, Gennarelli M, Turla M, Scarpini E, Sorbi S, Padovani A. Heterozygous TREM2 mutations in frontotemporal dementia. Neurobiology of Aging 2014; 35(4):934.e7-10. IF=4, Calvi A, De Riz M, Pietroboni AM, Ghezzi L, Maltese V, Arighi A, Fumagalli GG, Jacini F, Donelli C, Comi G, Galimberti D, Scarpini E. Partial recovery after severe immune reconstitution inflammatory syndrome in a multiple sclerosis patient with progressive multifocal leukoencephalopathy. Immunotherapy 2014; 6(1): IF=2,44 7. Galimberti D, Reif A, Dell'osso B, Palazzo C, Villa C, Fenoglio C, Kittel-Schneider S, Leonhard C, Olmes DG, Serpente M, Paoli RA, Altamura AC, Scarpini E. C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion as a rare cause of bipolar disorder. Bipolar Disorders 2014; 16(4): IF=4, Galimberti D, Reif A, Dell'osso B, Kittel-Schneider S, Leonhard C, Herr A, Palazzo C, Villa C, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi SM, Prunas C, Paoli RA, Altamura AC, Scarpini E. The C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion is a rare cause of schizophrenia. Neurobiology of Aging 2014; 35(5):1214.e e10. IF=4, Fenoglio C, De Riz M, Villa C, Serpente M, Ridolfi E, Bonsi R, Cioffi SM, Barone C, Pietroboni A, Calvi A, Scarpini E, Galimberti D. C9ORF72 repeat expansion not detected in patients with multiple sclerosis. Neurobiology of Aging 2014; 35(5):1213.e1-2. IF=4, Guaschino C, Esposito F, Liberatore G, Colombo B, Annovazzi P, D'Amico E, Cavalla P, Capello E, Capra R, Galimberti D, Tedeschi G, Grimaldi L; PROGRESSO Group; PROGEMUS Group, Leone M, D'Alfonso S, Martinelli V, Comi G, Martinelli-Boneschi F. Familial clustering in Italian progressive-onset and bout-onset multiple sclerosis. Neurological Sciences 2014; 35(5): IF=1, Galimberti D, Prunas C, Paoli RA, Dell'osso B, Fenoglio C, Villa C, Palazzo C, Cigliobianco M, Camuri G, Serpente M, Scarpini E, Altamura AC. Progranulin gene variability influences the risk for bipolar I disorder, but not bipolar II disorder.

61 Bipolar Disorders 2014; 16(7): IF=4, Abbate C, Arosio B, Galimberti D, Nicolini P, Rossi PD, Ferri E, Gussago C, Deriz M, Fenoglio C, Serpente M, Scarpini E, Mari D. Phenotypic Variability associated with the C9ORF72 Hexanucleotide Repeat Expansion: A Sporadic Case of Frontotemporal Lobar Degeneration with Prodromal Hyposmia and Predominant Semantic Deficits. Journal of Alzheimer s Disease 2014; 40(4): IF=3, Serpente M, Bonsi R, Scarpini E, Galimberti D. Innate immune system and inflammation in Alzheimer's disease: from pathogenesis to treatment. Neuroimmunomodulation 2014; 21(2-3): IF=1, Guerini FR, Clerici M, Cagliani R, Malhotra S, Montalban X, Forni D, Agliardi C, Riva S, Caputo D, Galimberti D, Asselta R, Fenoglio C, Scarpini E, Comi GP, Bresolin N, Comabella M, Sironi M. No association of IFI16 (interferon-inducible protein 16) variants with susceptibility to multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 2014; 271(1-2): IF=2, Xi Z, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Bruni AC, Maletta RG, Nacmias B, Sorbi S, Galimberti D, Surace EI, Zheng Y, Moreno D, Sato C, Liang Y, Zhou Y, Robertson J, Zinman L, Tartaglia MC, St George-Hyslop P, Rogaeva E. Hypermethylation of the CpG-island near the C9orf72 G4C2-repeat expansion in FTLD patients. Human Molecular Genetics 2014; 23(21): IF=6, Caso F, Agosta F, Magnani G, Galantucci S, Spinelli EG, Galimberti D, Falini A, Comi G, Filippi M. Clinical and MRI correlates of disease progression in a case of nonfluent/agrammatic variant of primary progressive aphasia due to progranulin (GRN) Cys157LysfsX97 mutation. Journal of the Neurological Sciences 2014; 342(1-2): IF=2, Escott-Price V, Bellenguez C, Wang LS, Choi SH, Harold D, Jones L, Holmans P, Gerrish A, Vedernikov A, Richards A, DeStefano AL, Lambert JC, Ibrahim- Verbaas CA, Naj AC, Sims R, Jun G, Bis JC, Beecham GW, Grenier-Boley B, Russo G, Thornton-Wells TA, Denning N, Smith AV, Chouraki V, Thomas C, Ikram MA, Zelenika D, Vardarajan BN, Kamatani Y, Lin CF, Schmidt H, Kunkle B, Dunstan ML, Vronskaya M; the United Kingdom Brain Expression Consortium, Johnson AD, Ruiz A, Bihoreau MT, Reitz C, Pasquier F, Hollingworth P, Hanon O, Fitzpatrick AL, Buxbaum JD, Campion D, Crane PK, Baldwin C, Becker T, Gudnason V, Cruchaga C, Craig D, Amin N, Berr C, Lopez OL, De Jager PL, Deramecourt V, Johnston JA, Evans D, Lovestone S, Letenneur L, Hernández I, Rubinsztein DC, Eiriksdottir G, Sleegers K, Goate AM, Fiévet N, Huentelman MJ, Gill M, Brown K, Kamboh MI, Keller L, Barberger-Gateau P, McGuinness B, Larson EB, Myers AJ, Dufouil C, Todd S, Wallon D, Love S, Rogaeva E, Gallacher J, George-Hyslop PS, Clarimon J, Lleo A, Bayer A, Tsuang DW, Yu L, Tsolaki M, Bossù P, Spalletta G, Proitsi P, Collinge J, Sorbi S, Garcia FS, Fox NC, Hardy J, Naranjo MC, Bosco P, Clarke R, Brayne C, Galimberti D, Scarpini E, Bonuccelli U, Mancuso M, Siciliano G, Moebus S, Mecocci P, Zompo MD, Maier W, Hampel H, Pilotto A, Frank-García A, Panza F, Solfrizzi V, Caffarra P, Nacmias B, Perry W, 61

62 Mayhaus M, Lannfelt L, Hakonarson H, Pichler S, Carrasquillo MM, Ingelsson M, Beekly D, Alvarez V, Zou F, Valladares O, Younkin SG, Coto E, Hamilton-Nelson KL, Gu W, Razquin C, Pastor P, Mateo I, Owen MJ, Faber KM, Jonsson PV, Combarros O, O'Donovan MC, Cantwell LB, Soininen H, Blacker D, Mead S, Mosley TH Jr, Bennett DA, Harris TB, Fratiglioni L, Holmes C, de Bruijn RF, Passmore P, Montine TJ, Bettens K, Rotter JI, Brice A, Morgan K, Foroud TM, Kukull WA, Hannequin D, Powell JF, Nalls MA, Ritchie K, Lunetta KL, Kauwe JS, Boerwinkle E, Riemenschneider M, Boada M, Hiltunen M, Martin ER, Schmidt R, Rujescu D, Dartigues JF, Mayeux R, Tzourio C, Hofman A, Nöthen MM, Graff C, Psaty BM, Haines JL, Lathrop M, Pericak-Vance MA, Launer LJ, Van Broeckhoven C, Farrer LA, van Duijn CM, Ramirez A, Seshadri S, Schellenberg GD, Amouyel P, Williams J. Gene-Wide Analysis Detects Two New Susceptibility Genes for Alzheimer's Disease. PLoS One 2014;9(6):e IF=3, Ferrari R, Hernandez DG, Nalls MA, Rohrer JD, Ramasamy A, Kwok JB, Dobson- Stone C, Brooks WS, Schofield PR, Halliday GM, Hodges JR, Piguet O, Bartley L, Thompson E, Haan E, Hernández I, Ruiz A, Boada M, Borroni B, Padovani A, Cruchaga C, Cairns NJ, Benussi L, Binetti G, Ghidoni R, Forloni G, Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Scarpini E, Clarimón J, Lleó A, Blesa R, Waldö ML, Nilsson K, Nilsson C, Mackenzie IR, Hsiung GY, Mann DM, Grafman J, Morris CM, Attems J, Griffiths TD, McKeith IG, Thomas AJ, Pietrini P, Huey ED, Wassermann EM, Baborie A, Jaros E, Tierney MC, Pastor P, Razquin C, Ortega- Cubero S, Alonso E, Perneczky R, Diehl-Schmid J, Alexopoulos P, Kurz A, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Rogaeva E, St George-Hyslop P, Rossi G, Tagliavini F, Giaccone G, Rowe JB, Schlachetzki JC, Uphill J, Collinge J, Mead S, Danek A, Van Deerlin VM, Grossman M, Trojanowski JQ, van der Zee J, Deschamps W, Van Langenhove T, Cruts M, Van Broeckhoven C, Cappa SF, Le Ber I, Hannequin D, Golfier V, Vercelletto M, Brice A, Nacmias B, Sorbi S, Bagnoli S, Piaceri I, Nielsen JE, Hjermind LE, Riemenschneider M, Mayhaus M, Ibach B, Gasparoni G, Pichler S, Gu W, Rossor MN, Fox NC, Warren JD, Spillantini MG, Morris HR, Rizzu P, Heutink P, Snowden JS, Rollinson S, Richardson A, Gerhard A, Bruni AC, Maletta R, Frangipane F, Cupidi C, Bernardi L, Anfossi M, Gallo M, Conidi ME, Smirne N, Rademakers R, Baker M, Dickson DW, Graff-Radford NR, Petersen RC, Knopman D, Josephs KA, Boeve BF, Parisi JE, Seeley WW, Miller BL, Karydas AM, Rosen H, van Swieten JC, Dopper EG, Seelaar H, Pijnenburg YA, Scheltens P, Logroscino G, Capozzo R, Novelli V, Puca AA, Franceschi M, Postiglione A, Milan G, Sorrentino P, Kristiansen M, Chiang HH, Graff C, Pasquier F, Rollin A, Deramecourt V, Lebert F, Kapogiannis D, Ferrucci L, Pickering-Brown S, Singleton AB, Hardy J, Momeni P. Frontotemporal dementia and its subtypes: a genome-wide association study. Lancet Neurology 2014;13(7): IF=21, Gallone S, Boschi S, Rubino E, De Martino P, Scarpini E, Galimberti D, Fenoglio C, Acutis PL, Maniaci MG, Pinessi L, Rainero I. Is HCRTR2 a Genetic Risk Factor for Alzheimer's Disease? Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 2014; 38(3-4): IF=2, Dell Osso B, D Addario C, Carlotta Palazzo M, Benatti B, Camuri G, Galimberti D, Fenoglio C, Scarpini E, Di Francesco A, Maccarrone M, Carlo Altamura A. Epigenetic modulation of BDNF gene: Differences in DNA methylation between unipolar and bipolar patients.

63 Journal of Affective Disorders 2014; 166: IF=3, Guerini FR, Agliardi C, Sironi M, Arosio B, Calabrese E, Zanzottera M, Bolognesi E, Ricci C, Costa AS, Galimberti D, Griffanti L, Bianchi A, Savazzi F, Mari D, Scarpini E, Baglio F, Nemni R, Clerici M. Possible Association between SNAP-25 Single Nucleotide Polymorphisms and Alterations of Categorical Fluency and Functional MRI Parameters in Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer s Disease 2014; 42(3): IF=3, Galimberti D, Villa C, Fenoglio C, Serpente M, Ghezzi L, Cioffi SM, Arighi A, Fumagalli G, Scarpini E. Circulating mirnas as Potential Biomarkers in Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer s Disease 2014; 42(4): IF=3, Lattante S, Le Ber I, Galimberti D, Serpente M, Rivaud-Péchoux S, Camuzat A, Clot F, Fenoglio C; The French research network on FTD and FTD-ALS, Scarpini E, Brice A, Kabashi E. Defining the association of TMEM106B variants among frontotemporal lobar degeneration patients with GRN mutations and C9orf72 repeat expansions. Neurobiology of Aging 2014; 35(11):2658.e1-5. IF=4, Millecamps S, De Septenville A, Teyssou E, Daniau M, Camuzat A, Albert M, LeGuern E, Galimberti D; The French research network on FTD and FTD-ALS, Brice A, Marie Y, Le Ber I. Genetic analysis of matrin 3 gene in French amyotrophic lateral sclerosis patients and frontotemporal lobar degeneration with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging 2014; 35(12): 2882.e13-5. IF=4, Talarico G, Canevelli M, Tosto G, Piscopo P, Confaloni A, Galimberti D, Fenoglio C, Scarpini E, Gasparini M, Bruno G. Binge eating and fast cognitive worsening in an early-onset bvftd patient carrying C9ORF72 expansion. Neurocase 2014; 26:1-5. IF=1, Gnanapavan S, Hegen H, Khalil M, Hemmer B, Franciotta D, Hughes S, Hintzen R, Jeromin A, Havrdova E, Tumani H, Bertolotto A, Comabella M, Frederiksen J, Alvarez-Cermeño JC, Villar L, Galimberti D, Myhr KM, Dujmovic I, Fazekas F, Ionete C, Menge T, Keir G, Deisenhammer F, Teunissen C, Giovannoni G. Guidelines for uniform reporting of body fluid biomarker studies in neurologic disorders. Neurology 2014; 83(13): IF=8, Salvadores N, Shahnawaz M, Scarpini E, Tagliavini F, Soto C. Detection of misfolded Aβ oligomers for sensitive biochemical diagnosis of Alzheimer's disease. Cell Reports 2014; 7(1): IF=7, Ferrucci R, Vergari M, Cogiamanian F, Bocci T, Ciocca M, Tomasini E, De Riz M, Scarpini E, Priori A. Transcranial direct current stimulation (tdcs) for fatigue in multiple sclerosis. Neurorehabilitation 2014;34(1): IF=1, Filippi M, Rocca MA, Pagani E, De Stefano N, Jeffery D, Kappos L, Montalban X, Boyko AN, Comi G; ALLEGRO Study Group (including E. Scarpini). Placebo- 63

64 controlled trial of oral laquinimod in multiple sclerosis: MRI evidence of an effect on brain tissue damage. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 2014; 85(8): IF=5, COMUNICAZIONI SU RIVISTE CENSITE Fenoglio C, Serpente M, Bonsi R, Cioffi SM, Arighi A, Ghezzi L, Callea A, Donelli C, Mercurio M, Scarpini E, Galimberti D. Cytokine gene expression in peripheral cells from patients with frontotemporal lobar degeneration due to GRN and C9ORF72 mutation. European Journal of Neurology 2014; 21 (Suppl. 1): European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. 2. Galimberti D, Fenoglio C, Villa C, Serpente M, Bonsi R, Cioffi SM, Ghezzi L, Arighi A, Basilico P, Callea A, Scarpini E. Circulating and intrathecal mirnas as potential biomarkers for Alzheimer s disease. European Journal of Neurology 2014; 21 (Suppl. 1): 34. European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. 3. Ghezzi L,. Fenoglio C, Villa C, Arighi A, Basilico P, Pietroboni A, Rotondo E, Corti P, Mercurio M, Serpente M, Cioffi S, Scarpini E, Galimberti D. Circulating mirnas as potential biomarkers in primary progressive aphasia. European Journal of Neurology 2014; 211 (Suppl. 1): 34. European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. 4. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Barone C, Arighi A, Ghezzi L, Clerici F, Grande G, Maggiore L, Mariani C, Scarpini E. TREM2 genetic variability in patients with Alzheimer s disease and frontotemporal lobar degeneration. European Journal of Neurology 2014; 321 (Suppl. 1): 34. European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. 5. Calvi A, Fenoglio C, De Riz M, Pietroboni AM, Ghezzi L, Maltese V, Serpente M, Bonsi R, Barone C, Cioffi S, Frigerio F, Turrini R, Galimberti D, Scarpini E. Restoration of aberrant circulating mirnas levels after fingolimod treatment in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. European Journal of Neurology 2014; 341 (Suppl. 1): 34. European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. 6. Campisi GM, Cioffi SMG, Serpente M, Fenoglio C, Bonsi R, Arighi A, Fumagalli G, Scarpini E, Galimberti D. Profiling of ubiquitination pathway genes in peripheral cells from C9orf72 mutation carriers with frontotemporal lobar degeneration. Clinical Neuropathology 33(3): 212 (2014). 50 Annual Meeting of the Italian Association of Neuropathology and Clinical Neurobiology (AINP-NC) 40 Meeting of the Italian Association for Research on Brain Aging (AIRIC), June 5-7, 2014, Verbania, Italy. 64

65 7. Cioffi SMG, Fenoglio C, Serpente M, Bonsi R, Ridolfi E, Arighi A, Fumagalli G, Ghezzi L, Clerici F, Mariani C, Scarpini E, Galimberti D. Trem2 genetic variability in Italian populations of FTLD and AD patients. Clinical Neuropathology 33(3): 216 (2014). 50 Annual Meeting of the Italian Association of Neuropathology and Clinical Neurobiology (AINP-NC) 40 Meeting of the Italian Association for Research on Brain Aging (AIRIC), June 5-7, 2014, Verbania, Italy. 8. Galimberti D, Scarpini E. Role of non-coding RNA in neurodegenerative and demyelinating diseases of the central nervous system. Clinical Neuropathology 33(3): 222 (2014). 50 Annual Meeting of the Italian Association of Neuropathology and Clinical Neurobiology (AINP-NC) 40 Meeting of the Italian Association for Research on Brain Aging (AIRIC), June 5-7, 2014, Verbania, Italy. 9. Bocchetta M, Pievani M, Babiloni C, Bruni AC, Scarpini E, Sorbi S, Tagliavini F, Padovani A, Benussi L, Bernardi L, Binetti G, Borroni B, Di Fede G, Di Maria E, Fostinelli S, Galimberti D, Gennarelli M, Ghidoni R, Marzano N, Mega A, Nacmias B, Piaceri I, Porteri C, Rossi G, Suardi S, Vecchio F, Frisoni GB. Italian network for autosomal dominant Alzheimer s disease and Frontotemporal Lobar Degeneration (Italian DIAfN). Alzheimer s & Dementia 2014; 10(4): P38. Alzheimer's Association International Conference 2014, July 12-17, Copenhagen (Denmark). 10. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Bonsi R, Cioffi S, Ghezzi L, Arighi A, Basilico P, Callea A, Donelli C, Scarpini. Circulating and intrathecal mirnas as potential biomarkers for Alzheimer s disease. Alzheimer s & Dementia 2014; 10(4): P Alzheimer's Association International Conference 2014, July 12-17, Copenhagen (Denmark). 11. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Arighi A, Ghezzi L, Clerici F, Grande G, Maggiore L, Mariani C, Scarpini E. TREM2 genetic variability in patients with Alzheimer s disease and Frontotemporal Lobar Degeneration. Alzheimer s & Dementia 2014; 10(4): P319. Alzheimer's Association International Conference 2014, July 12-17, Copenhagen (Denmark). 12. Gardini S, Galimberti D, Fenoglio C, Cioffi S, Pietroboni A, Calvi A, Scarpini E, Concari L, Barocco F, Spallazzi M, Ghetti C, Ruffini L, Caffarra P. A novel mutation in progranulin gene in behavioural variant Frontotemporal dementia. Alzheimer s & Dementia 2014; 10(4): P666. Alzheimer's Association International Conference 2014, July 12-17, Copenhagen (Denmark). 13. Bocchetta M, Pievani M, Babiloni C, Bruni AC, Scarpini E, Sorbi S, Tagliavini F, Padovani A, Benussi L, Bernardi L, Binetti G, Borroni B, Di Fede G, Di Maria E, Fostinelli S, Galimberti D, Gennarelli M, Ghidoni R, Marzano N, Mega A, Nacmias B, Piaceri I, Porteri C, Rossi G, Suardi S, Vecchio F, Frisoni GB. Italian network for autosomal dominant Alzheimer s disease and Frontotemporal Lobar Degeneration (Italian DIAfN). Alzheimer s & Dementia 2014; 10(4): P

66 Alzheimer's Association International Conference 2014, July 12-17, Copenhagen (Denmark). 14. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Clerici F, Grande G, Maggiore L, Arighi A, Ghezzi L, Mariani C, Scarpini E. Role of TREM2 in patients with Alzheimer s disease: genetic variability and mrna expression. Neurological Sciences 35, Suppl.: S23, XLV Congress of the Italian Neurological Society, October 11-14, 2014, Cagliari, Italy. 15. Ghezzi L, Fenoglio C, Villa C, Arighi A, Pietroboni A, Serpente M, Cioffi S, Scarpini E, Galimberti D. Circulating mirnas as potential biomarkers in primary progressive aphasia. Neurological Sciences 35, Suppl.: S23, XLV Congress of the Italian Neurological Society, October 11-14, 2014, Cagliari, Italy. 16. Calvi A, Cioffi S, Caffarra P, Fenoglio C, Serpente M, Pietroboni A, Arighi A, Ghezzi L, gardini S, Scarpini E, Galimberti D. The novel GRN g1159_1160deltg mutation is asociated with behavioral variant Frontotemporal Dementia. Neurological Sciences 35, Suppl.: S43, XLV Congress of the Italian Neurological Society, October 11-14, 2014, Cagliari, Italy. 17. Arighi A, Rango M, Pietroboni A, De Riz M, Fumagalli G, Ghezzi L, Donelli C, Calvi A, Basilico P, Zago S, Rotondo E, Corti P, Mecurio M, Vimercati R, Fenoglio C, Serpente M, Galimberti D, Scarpini E. Magnetic resonance spectroscopy in posterior cortical atrophy. Neurological Sciences 35, Suppl.: S219, XLV Congress of the Italian Neurological Society, October 11-14, 2014, Cagliari, Italy. 18. Galimberti D, Serpente M, Fenoglio C, Bonsi R, Cioffi S, Arighi A, Ghezzi L, Scarpini E. Profiling of ubiquitination pathway genes in peripheral cells from C9orf72 and GRN mutation carriers with frontotemporal lobar degeneration. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014 Vancouver, Canada. 19. Benussi A, Archetti S, Galimberti D, Parnetti L, Nacmias B, Ferrari F, Sorbi S, Scarpini E, Padovani A, Borroni B. CSF p-tau181/tau ratio as biomarker for TDP pathology in frontotemporal lobar degeneration. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014 Vancouver, Canada. 20. Galimberti D, Cioffi S, Calvi A, Caffarra P, Fenoglio C, Serpente M, Pietroboni A, Arighi A, Ghezzi L, Gardini S, Scarpini E. The novel GRN g.1159_1160deltg mutation is associated with behavioural variant frontotemporal dementia. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1):

67 9th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014 Vancouver, Canada. 21. Xi Z, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Bruni A, Maletta R, Nacmias B, Sorbi S, Galimberti D, Surace E, Tartaglia M, van Blitterswijk M, Rademakers R, Yunusova Y, Robertson J, St. George-Hyslop P, Zinman L, Rogaeva E. Epigenetic study of C9orf72 in FTD and ALS patients including the family with identical twins. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014 Vancouver, Canada. 22. Bonsi R, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Arighi A, Ghezzi L, Mercurio M, Scarpini E, Galimberti D. Cytokine and chemokine gene expression in peripheral cells from patients with frontotemporal lobar degeneration due to GRN and C9orf72 mutations. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014 Vancouver, Canada. 23. Borroni B, Turrone R, Galimberti D, Nacmias B, Antonella A, Caffarra P, Caltagirone C, Cappa S, Frisoni G, Ghidoni R, Marra C, Padovani A, Rainero I, Scarpini E, Silani V, Sorbi S, Tagliavini F, Tremolizzo L, Bruni A, FTD Group SINDEM. Italian frontotemporal dementia network (FTD Group SINDEM): sharing clinical and diagnostic procedures in Frontotemporal Dementia in Italy. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014 Vancouver, Canada. 6. PARTECIPAZIONEN A EDITORIAL BOARD DI RIVISTE INTERNAZIONALI O NAZIONALI CON IF>0 - Dott. D. Galimberti - Editorial Board Member della rivista The Open Geriatric Medicine Journal - Dott. D. Galimberti - Senior Editor della rivista Journal of Alzheimer s disease - Prof. E. Scarpini Editorial Board Member della rivista Journal of Neurology - Prof. E. Scarpini Associate Editor della rivista Journal of Alzheimer s disease - Prof. E. Scarpini Associated Editor della rivista Journal of the Neurological Sciences 7. CHAIRMAN A MANIFESTAZIONI INTERNAZIONALI - Dott.ssa D. Galimberti - European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies Joint meeting, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. Oral session on dementia - Prof. E. Scarpini - European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies Joint meeting, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. Oral session on dementia 8. MEMBERSHIP SOCIETÀ SCIENTIFICHE Dott.ssa D. Galimberti Secretary of the European Federation of Neurological Societies Prof. E. Scarpini socio fondatore e segretario dell Associazione per la ricerca sulle demenze della Società Italiana di Neurologia (SINDEM) 67

68 Dott.ssa D. Galimberti membro dell Associazione per la ricerca sulle demenze della Societa Italiana di Neurologia (SINDEM) Prof. E Scarpini coordinatore del Gruppo di Lavoro Patologie Neurologiche Progressive - Sottogruppo Demenze: Percorso diagnostico, terapeutico ed assistenziale. Documento presentato all Assessorato alla Salute - Regione Lombardia 9. RELAZIONI SU INVITO 50 Annual Meeting of the Italian Association of Neuropathology (AINP) XL Meeting of the Italian Association for Research on Brain Aging (AIRIC). Titolo: Role of non coding RNA in neurodegenerative and demyelinating disorders of the central nervous system. June 5-7, 2014, Verbania, Italy. 10. FINANZIAMENTI - Joint Program for Neurodegenerative Disorders BIOMARKAPD (Giugno 2012-Maggio 2015) - Ricerca Finalizzata Ministero della Salute Italian network for autosomal dominant Alzheimer s disease and frontotemporal lobar degeneration (30/11/ /11/2015) - Giovani Ricercatori, Ministero della Salute The topological organization of anatomical and functional cortical brain networks in patients with the behavioral variant of frontotemporal dementia and primary progressive aphasia (scad. 30/11/2015) - Ricerca Corrente, Ministero della Salute Long Non Coding RNAs (Lnc-RNAs) e Sclerosi Multipla: identificazione di nuovi possibili bio-marcatori prognostici e di risposta al trattamento Ricerca Concorso (Maria Serpente), Long non-coding RNAs (nc-rnas) e Sclerosi Multipla: identificazione di nuovi possibili biomarcatori prognostici e di risposta al trattamento x (Daniela Galimberti), Ruolo delle molecole infiammatorie e degli RNA non codificanti (micro e long RNAs) nella patogenesi della Degenerazione Lobare Frontotemporale (Demenza di Pick) e dei disturbi psicotici Fondazione Monzino Malattia di Alzheimer e Degenerazione Lobare Frontotemporale: ricerca di marcatori da associare alla patologia mediante studi genetici e di espressione per migliorare la diagnosi differenziale e l efficacia della terapia ( ). 68

69 LABORATORIO CELLULE STAMINALI Responsabile: Dottor Yvan Torrente, Neurologo Universitario in convenzione Personale: Marzia Belicchi biologa con contratto a tempo indeterminato di tecnico di laboratorio laureato universitario Mirella Meregalli biologa con contratto a tempo determinato di tecnico di laboratorio laureato universitario Federica Colleoni biologa, con borsa annuale ospedaliera Paola Razini biotecnologa con borsa annuale ospedaliera Andrea Farini biologo, PostDoc contrattista pluriannulae universitario Silvia Erratico biotecnologa, contrattista annuale Letizia Cassinelli, biologa con contratto annuale Paola Frattini, biotecnologa con borsa annuale ospedaliera Clementina Sitzia, biotecnologa, medico, con borsa annuale ospedaliera Stefania Banfi, biologa con borsa annuale ospedaliera Francesca De Santis, biologa con borsa annuale ospedaliera Chiara Villa, bioingegnere, Phd/student contrattista pluriannuale universitario Gloria Marelli, studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale Mattia Piovani studente della facoltà di Biotecnologie, tirocinante per tesi magistrale dei 5 anni Veronica Nervi studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale Giorgia Riolo studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale Naima Guarrata, dottore in economia, project manager contrattista annuale 69

70 Consuntivo dell attivita di ricerca svolta nel corso dell anno 2014 da parte del Gruppo di lavoro, diretto dal Dr. Yvan Torrente, attivo presso il Laboratorio Cellule Staminali - Centro Dino Ferrari dell Universita degli Studi di Milano. L attivita di ricerca svolta dal gruppo di lavoro diretto dal dott. Torrente è di tipo traslazionale e verifica la possibilità di trasformare le scoperte scientifiche che arrivano dal laboratorio in applicazioni cliniche. L obiettivo, in altre parole, è quello di costruire una sorta di ponte tra la scienza e la medicina, per poter utilizzare nel modo migliore le scoperte dei ricercatori. L interesse primario del gruppo è costituito, da anni, dallo studio delle cellule staminali adulte con potenzialità miogeniche per una loro applicazione clinica e, nello specifico, per il loro utilizzo nello sviluppo di nuove terapie cellulari per la lotta alle distrofie muscolari, in particolare alla distrofia muscolare di Duchenne, patologia che rimane ancora priva di cure efficaci e risolutive. Le distrofie muscolari (MDs) sono un gruppo eterogeneo di patologie ereditarie, in cui la progressiva atrofia e debolezza muscolare sono spesso associate all esaurimento del potenziale rigenerativo del muscolo. Sebbene ad oggi il muscolo scheletrico sia un tessuto con proprietà fisiologiche ben conosciute, non ci sono ancora trattamenti risolutivi per queste patologie. Il gruppo del dott. Torrente ha pubblicato quest anno sulla rivista scientifica Frontiers in Physiology una review in cui descrive i progressi fatti nell'isolamento di nuove sottopopolazioni di cellule staminali e nella creazione di nicchie artificiali di cellule staminali, ed argomenta come queste tecnologie emergenti offrano importanti premesse per futuri approcci terapeutici alle malattie muscolari e all atrofia muscolare associate all invecchiamento. La terapia cellulare è ad oggi uno dei più promettenti approcci per correggere difetti causa delle malattie genetiche dal momento che è stato dimostrato ampiamente che le cellule possono partecipare attivamente alla rigenerazione tessutale; in tal senso la recente identificazione di differenti tipologie di cellule staminali multipotenti, alcune delle quali particolarmente adeguate per essere utilizzate in protocolli di terapia cellulare, ha creato nuove interessanti prospettive nel trattamento di malattie genetiche che ancora oggi non hanno una terapia efficace e risolutiva, tra queste la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle più comuni e aggressive. Negli ultimi 10 anni infatti sono stati fatti importanti passi avanti nella conoscenza delle cellule staminali: la definizione di nicchia, l identificazione di segnali regolatori della mobilizzazione e dell homing; progressi questi che costituiscono degli strumenti fondamentali per lo sviluppo di nuovi promettenti protocolli di terapia cellulare. Le cellule mesenchimali (MSCs), in particolare, sono cellule staminali non ematopoietiche con potenzialità di differenziare in diversi lineages; tali cellule possono essere isolate da diverse fonti tissutali, quali il tessuto adiposo, il midollo osseo e lo stesso tessuto muscolare, e sono in grado di rilasciare molecole con proprietà antiinfiammatorie capaci di modulare la risposta immunitaria umorale e cellulare. Recentemente sono stati pubblicati molti studi realizzati a livello preclinico e clinico che prevedono l utilizzo di cellule mesenchimali. In tal senso, il team del dott. Torrente ha descritto sulla rivista scientifica Stem Cells International, le caratteristiche delle cellule MSCs e come tale popolazione cellulare, grazie alle proprie potenzialità immuno-modulanti, possa essere considerata uno strumento prezioso per il trattamento di patologie infiammatorie, degenerative ed autoimmuni. Dalla letteratura emerge come la distrofia muscolare di Duchenne sia una malattia caratterizzata da assenza della distrofina, da infiammazione cronica, da danni al sarcolemma, e dalla degenerazione dei muscoli scheletrici. Tra i molteplici meccanismi patogeni proposti per la DMD, lo stress ossidativo e l'infiammazione sono direttamente coinvolti nel processo distrofico. Numerosi elementi caratteristici del fenotipo distrofico, soprattutto l'infiammazione e l'attivazione della risposta immunitaria innata o acquisita, sono caratteristiche importanti di tutte le distrofie muscolari. Sono stati pubblicati numerosi studi in cui si dimostra la possibilità di una risposta immunitaria verso il vettore virale utilizzato in terapia genica per veicolare ad esempio porzioni geniche per 70

71 ripristinare il corretto schema di lettura nelle cellule muscolari di un paziente distrofico e stimolare la produzione della nuova proteina. A tal proposito il gruppo del dott. Torrente ha pubblicato sulla rivista internazionale Biomed Research International le attuali conoscenze scientifiche circa il coinvolgimento della risposta del sistema immunitario alle terapie sperimentali oggi utilizzate per la distrofia muscolare. Da alcuni anni la letteratura scientifica ha più volte sottolineato come per patologie degenerative, come appunto la DMD, sia risultato vincente un approccio che preveda la combinazione di terapia genica e terapia cellulare. Inoltre, è stato messo in risalto come la combinazione di terapia genica e terapia cellulare con utilizzo di cellule staminali adulte consenta, ad oggi, di avere discrete chances per la gestione e la terapia della DMD. Negli ultimi decenni differenti tecnologie, quali ad esempio la modificazione genetica mediata da vettori virali, sono state oggetto di indagine tesa a risolvere il deficit di distrofina, causa della DMD. Sono stati fatti molti progressi che hanno portato a migliorare la terapia genica in termini di efficacia e di sicurezza in particolare per superare gli ostacoli costituiti dal ridotto trasferimento genico, dal basso livello di espressione della proteina, dal rischio di mutagenesi per l integrazione casuale del vettore virale, dall immunogenicita dei vettori stessi e, qualche volta, dello stesso transgene. Da diversi anni gli studi del gruppo di lavoro diretto dal dott. Torrente sono volti alla realizzazione di un trial clinico di fase I/II che prevede la combinazione della terapia genica e terapia cellulare con l utilizzo cellule staminali muscolari CD133+. Questo studio clinico, di fase I, monocentrico, non randomizzato consiste nel trapianto autologo di cellule staminali muscolari ingegnerizzate con metodica di exon skipping nel muscolo adduttore del mignolo della mano sinistra di bambini DMD. La tecnologia di exon skipping ha il vantaggio di essere diretta contro il trascritto endogeno della proteina distrofina che presenta la mutazione, preservando il naturale livello di proteina. Inoltre, il trapianto autologo consente di superare il problema di una risposta immunitaria durante approcci di terapia genica che prevedano l utilizzo diretto in vivo di vettori virali. Il primo passo verso la realizzazione di questo trial clinico, il primo a livello mondiale, è stato sottomettere al Comitato Etico della Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico il progetto di validazione dal titolo STUDIO DI VALIDAZIONE DELLE CELLULE STAMINALI MUSCOLARI CD133+ INGEGNERIZZATE (CD133-LV(U7)) CON UN VETTORE LENTIVIRALE GMP/GLP, che in data 22/5/2014 è stato approvato con parere favorevole 240 (determina 878/14). Il protocollo presentato descrive uno studio di validazione del prodotto medicinale costituito da cellule staminali CD133 positive isolate da biopsie muscolari di pazienti pediatrici affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne. Un gruppo di dodici pazienti verra selezionato sulla base dell eta, del quadro clinico e dell assenza di patologie concomitanti non correlate. Tra questi, cinque pazienti saranno inclusi negli studi di validazione del processo di isolamento e preparazione delle cellule ingegnerizzate con vettore lenti-virale GMP/GLP. In caso di materiale biologico insufficiente, miogenesi cellulare non soddisfacente o complicazioni causate da effetti collaterali avversi, i pazienti verranno sostituiti. Le cellule staminali CD133 positive saranno isolate dalla biopsia muscolare in laboratori certificati GMP della Fondazione IRCCS Policlinico di Milano, saranno infettate con un vettore lenti virale GMP/GLP in grado di favorirne la loro correzione genica e successivamente saranno mantenute in coltura al fine di incrementarne il numero in visione di un futuro trapianto. Questo studio biologico di validazione permetterà di progettare e successivamente realizzare un primo trial clinico di fase I/II che prevederà il trapianto autologo delle cellule muscolari CD133+ ingegnerizzate con il vettore GMP validate in codesto studio, nel muscolo Abductor Digiti Minimi (ADM) sinistro dei pazienti distrofici precedentemente inclusi. Tale studio clinico è stato progettato in conformità alle regole di buona pratica clinica italiana ed europea, determinate nella Conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH) E6, e sono state 71

72 soddisfatte tutte le richieste degli organi regolatori quali l Istituto Superiore di Sanità, il Ministero della Salute, AIFA e comitati etici di ricerca locale italiana. Seguendo la normativa in materia di utilizzo di cellule staminali ingegnerizzate a scopo di sperimentazione clinica il dott. Torrente ha contattato i principali enti regolatori italiani, in particolare l'istituto Superiore di Sanità (ISS), il Ministero della Salute e l'agenzia Italiana del Farmaco (AIFA) per pianificare lo studio e condividere il protocollo clinico con i rappresentanti di AIFA e ISS. La risultante di questi incontri è quella di procedere con un primo studio che prevede una singola iniezione intramuscolare di cellule staminali CD133+ ingegnerizzate isolate da biopsie muscolari di pazienti DMD e di farlo seguire in un secondo momento dall iniezione sistemica nell arteria femorale dei pazienti distrofici. Il protocollo di sperimentazione clinica, il CRF dello studio e i documenti complementari richiesti dagli Organi Regolatori verranno presentati al Comitato Etico della Fondazione IRCCS Cà Granda Policlinico nel corso del Negli ultimi anni gli scienziati hanno scoperto molti geni associati a specifiche malattie mettendo in evidenza che tutti noi abbiamo diversi livelli di predisposizione genetica verso patologie quali ad esempio il cancro, il diabete e le malattie cardiovascolari. Tuttavia è stato stabilito che la presenza e la gravità di queste malattie sono fortemente influenzate da fattori ambientali come la dieta, il fumo e lo stile di vita. Recenti studi confermano sempre più la connessione tra l'alimentazione e i geni perché il cibo può accenderli o spegnerli, modificando la loro espressione: il DNA non si può cambiare, ma è possibile intervenire sui meccanismi con cui la dieta può attivare o disattivare alcuni geni. E' in quest'ottica di ricerca che la genomica nutrizionale sta cercando di capire come diversi cibi e composti naturali possano portare sollievo e cura verso alcune malattie cosiddette genetiche come Alzheimer, cancro e sclerosi multipla. Cibi che funzionino come mattoncini di blocco o semplici operai riparatori dei geni malati o difettosi. In un regime dietetico sano, volto al recupero della forma fisica fare uso di alcuni cibi funzionali detti anche nutraceutici deve essere una cosa prioritaria; ovvero fare uso di alimenti che hanno una funzione benefica sulla salute umana, inclusi la prevenzione o il trattamento di una malattia non dovrebbe essere trascurato. I ricercatori a causa delle basi genetiche delle distrofie muscolari hanno iniziato a studiare strategie alternative a quelle farmacologiche per il trattamento di questo gruppo di patologie. La ricerca, infatti, si è da tempo attivata in diversi ambiti al fine di individuare tutte le possibili strade da percorrere nella gestione della distrofia, con l obiettivo ultimo non di curare ma di migliorare la qualità della vita dei pazienti. In tal senso il gruppo del Dott. Torrente in una pubblicazione sulla rivista internazionale BioMed Research International ha valutato gli affetti di una dieta a base di una miscela di polifenoli naturali (ProAbe) sull architettura e la funzionalità muscolare di topi distrofici mdx. I muscoli dei topi trattati quotidianamente con il composto hanno mostrato una riduzione della fibrosi e della necrosi muscolare oltre ad una migliore vascolarizzazione. Il recupero delle caratteristiche morfologiche del muscolo distrofico porta ad un incremento della resistenza dei topi distrofici che hanno ricevuto il ProAbe. Questi dati confermano che una dieta a base di una miscela di polifenoli, importanti agenti antiossidanti, potrebbe rappresentare una strategia coadiuvante un trattamento per la distrofia muscolare di Duchenne. Durante quest ultimo anno il team del dott. Torrente ha continuato a collaborare con diversi gruppi di ricerca nazionali ed internazionali sia per studi clinici sia per sviluppare temi importanti per la ricerca di base nel campo delle malattie neuromuscolari. In collaborazione con l Ospedale San Raffaele di Milano sono stati pubblicati sulla rivista scientifica Plos One, i risultati di un nuovo studio clinico eseguito su un gruppo di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne di età compresa tra i 5 e i 12 anni ed ancora in grado di camminare. In tale studio si descrive un protocollo clinico osservazionale longitudinale che prende in analisi la forza muscolare dei pazienti distrofici utilizzando un test muscolare quantitativo (QMT) e qualitativo con misurazioni funzionali quali North Star Ambulatory Assessment (NSAA) o il 6-min walk test (6MWT). 72

73 Quest ultimo test è stato recentemente scelto come principale strumento di valutazione in trial clinici multicentrici internazionali per pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne (DMD) ancora in grado di camminare. Lo scopo di questo studio è stato quello di registrare i cambiamenti osservati durante il terzo anno di valutazione dei singoli pazienti e stabilire una possibile correlazione con eta, terapia con steroidi e la valutazione basale effettuata all inizio dello studio con il medesimo test. Sono stati osservati 96 pazienti provenienti da 11 centri e sono stati valutati con 6 minute walk test e con North Star Ambulatory Assessment a 12, 24 e 36 mesi dalla visita iniziale. I risultati ottenuti con questo studio, il primo che ha collezionato dati relativi a suddetti tests per 36 mesi in pazienti affetti da DMD, potrebbero non solo fornire informazioni riguardo alla progressione di questa malattia, ma anche costituire un riferimento importante da utilizzare per poter comparare i risultati di futuri studi clinici. La medesima collaborazione ha portato il gruppo del dott. Torrente a pubblicare sulla stessa rivista Plos One un altro studio clinico osservazionale atto a stabilire se un elevato gruppo di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne (191 pazienti ancora in grado di camminare) con diverse mutazioni presentino differenti valutazioni effettuate con il test 6MWT tra la misurazione basale e dopo 12 mesi di follow up. Nonostante siano state osservate alcune differenze nei vari sottogruppi, i valori medi delle valutazioni a 12 mesi in ciascun gruppo si sono mostrate tutti all'interno di un intervallo ristretto. Queste informazioni potranno essere d aiuto a disegnare un trial clinico con un ristretto gruppo di pazienti, affetti da patologia rara. Ulteriori collaborazioni che favoriscono l integrazione di diversi know how e competenze hanno permesso al gruppo concretizzare le proprie ricerche in pubblicazioni in importanti riviste scientifiche internazionali. In tal senso la proficua collaborazione con il gruppo di chimici diretto dalla Dott.ssa Lenardi presso la piattaforma di Micro e Nano Fabbricazione del Bioincubatore Filarete ha portato a pubblicare sulla rivista Journal Tissue Engineering Regen un lavoro in cui si descrive un nuovo idrogelo termosensibile P(NIPAAM-co-HEMA) costituito da due diversi biomateriali in grado di consentire il distacco di fogli di cellule muscolari, strumento utile nell ottica di una futura applicazione in vivo nel tessuto muscolare. Si sono identificati infatti diversi idrogeli con una struttura in grado di far aderire e proliferare la linea murina di mioblasti C 2 C 12 formando strati di cellule che si possono staccare dal substrato temperatura-sensibile, caratteristica importante per fare sì che tale materiale possa essere considerato una nuova ed innovativa superficie per colture cellulari. Pertanto, questi risultati rappresentano una prova iniziale per un ulteriore applicazione di questa tecnologia in modelli animali di danno muscolare, in prospettiva di una futura applicazione clinica. In collaborazione con il gruppo del prof. Rustichelli dell Universita Politecnica delle Marche, Di.S.C.O. - Sezione di Biologia, Biochimica e Fisica di Ancona, si è pubblicato sulla rivista internazionale Tissue Engineering Part C Methods un lavoro scientifico di approfondimento di come le cellule, ed in particolare le cellule staminali, siano in grado di interagire con un bioscaffold e di come il tipo di biomateriale e le sue caratteristiche riescano ad influenzarne ed a controllarne la crescita e/o il differenziamento delle cellule. In questo studio, frutto della collaborazione di diverse figure professionali tra le quali biologi, fisici e bioingegneri, afferenti a diverse università italiane, sono state analizzati i comportamenti in vitro di diverse tipologie di progenitori cellulari umani: progenitori endoteliali (ECFCs) isolati da soggetti sani e soggetti affetti dalla sindrome di Kaposi (una patologia angioproliferativa) e cellule staminali muscolari CD133+, coltivati su uno scaffold di acido polilattico poliglicolico. Gli scaffold 3D sono stati analizzati con la microtomografia X-ray (micro-ct), una tecnologia con un elevata risoluzione, fino a centinaia di nanometri (submicron), che permette di valutare la proliferazione e l organizzazione delle cellule sullo scaffold e come e quanto tale organizzazione si modifica durante la coltura in vitro. Da molti anni il gruppo del dott. Torrente collabora con numerosi gruppi di ricerca che operano all interno della Fondazione 73

74 IRCCS Ca Granda Policlinico di Milano ed in particolare con il gruppo della dott.ssa Porretti con cui quest anno ha pubblicato, sulla rivista scientifica Plos One, uno studio in cui si è analizzata l espressione media delle proteine ABC ed il ruolo dei vacuoli citoplasmatici nel processo di multi-drug resistance in sei linee cellulari di epatocarcinoma; inoltre si è confermato l accumulo di farmaci antitumorali in vacuoli giganti e piccoli di origine lisosomiale. Il test MTT inoltre ha mostrato che le linee cellulari con lisosomi giganti sono più resistenti al trattamento con il farmaco antitumorale sorafenib rispetto alle cellule con lisosomi piccoli e che il trattamento con verapamil è in grado di modificare questa resistenza. Il dott. Torrente ha in corso una collaborazione con il professore Gorka Orive del Dipartimento di Farmacologia dell Universita dei Paesi Baschi di Vittoria che ha dato origine ad una pubblicazione sulla rivista Current Pharmaceutical Biotechnology, in cui vengono descritte alcune delle tecnologie emergenti negli ultimi anni in relazione allo sviluppo di nuovi biomateriali, all ottimizzazione di alcune micro- e nano-tecnologie per il delivery di farmaci e cellule o per l applicazione di cellule staminali come prodotti terapeutici, inoltre ne vengono discussi tutti i potenziali benefici. Il gruppo del Dott. Torrente durante quest anno ha scritto e pubblicato anche due capitoli di libro: uno pubblicato su Horizon in Neuroscience Research in cui gli autori descrivono le cellule staminali e le potenzialità della terapia cellulare a base di cellule staminali nel trattamento di patologie neuromuscolari e neurodegenerative.; l altro invece pubblicato su From Pre-clinic to Biodiversity in cui gli autori realizzano una overview delle possibili terapie cellulari a base di cellule staminali applicate a studi preclinici in diversi modelli animali di distrofia muscolare. L attenzione è focalizzata sui pro- e i contro del traslare risultati scientifici da una fase preclinica realizzata su modelli animali all applicazione clinica. Durante quest anno il Dott. Torrente è stato impegnato anche nell organizzazione di eventi scientifici divulgativi nazionali ed internazionali, aventi come tema le cellule staminali e rivolti a ricercatori, medici, biologi e studenti universitari; da ricordare in modo particolare le giornate di studio e i convegni organizzati da Unistem all Universita degli Studi di Milano. Durante il 2014 il dott. Torrente ha continuato la sua attività di revisore di lavori scientifici per numerose prestigiose riviste internazionali e di progetti di ricerca ministeriali; inoltre fa parte dell editorial board della rivista scientifica CellR4, un giornale multidisciplinare focalizzato in particolare sulla riprogrammazione, differenziamento e rigenerazione cellulare. In conclusione, come si evince dalla letteratura scientifica sempre in evoluzione, ogni anno la ricerca scientifica riesce ad ampliare le conoscenze e a realizzare promettenti risultati nel campo delle cellule staminali e in particolare della terapia cellulare e genica. Significative informazioni, nuove conoscenze e soprattutto nuove tecnologie sempre più all avanguardia sono gli strumenti essenziali per poter arrivare ad un applicazione clinica delle cellule staminali adulte in sperimentazioni cliniche nel campo di patologie neurodegenerative e neuromuscolari per cui non esiste ancora una cura risolutiva, prima tra tutte, appunto, la distrofia muscolare di Duchenne. PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA 2014 ELENCO PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI RECENSITE Federico Colombo, Elena Trombetta, Paola Cetrangolo, Marco Maggioni, Paola Razini, Francesca De Santis, Yvan Torrente, Daniele Prati, Erminio Torresani, Laura Porretti Giant Lysosomes as a Chemotherapy Resistance Mechanism in Hepatocellular Carcinoma Cells PLOS ONE: December 10, 2014

75 I.F: 3.53 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 2. Pane M, Mazzone ES, Sivo S, Sormani MP, Messina S, D Amico A, Carlesi A, Vita G, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, Lanzillotta V, Viggiano E, D Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S, Barp A, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Graziano A, Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali S, Bruno C, Politano L, Comi GP, Bertini E, Mercuri E. Long term natural history data in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy: 36-month changes. PLOS ONE Oct 1;9(10) I.F: 3.53 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 6: Neuroscienze Cliniche e di Base 3. Farini A, Sitzia C, Erratico S, Meregalli M, Torrente Y. Influence of immune responses in gene/stem cell therapies for muscular dystrophies. Biomed Res Int. 2014;2014 I.F.: 2.71 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 4. Farini A, Sitzia C, Erratico S, Meregalli M, Torrente Y. Clinical applications of mesenchymal stem cells in chronic diseases. Stem Cells International Volume 2014, Article ID , 11 pages I.F.: 2.81 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 5. Villa C, Martello F, Erratico S, Tocchio A, Belicchi M, Lenardi C, Torrente Y. P(NIPAAM-co-HEMA) thermoresponsive hydrogels: an alternative approach for muscle cell sheet engineering. J Tissue Eng Regen Med May 5. I.F.: SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 6. Meregalli M, Farini A, Sitzia C, Torrente Y. Advancements in stem cells treatment of skeletal muscle wasting. Front Physiol Feb 12;5:48. I.F.: (primo IF nel 2015) SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 7. Pane M, Mazzone ES, Sormani MP, Messina S, Vita GL, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, D'Amico A, Lanzillotta V, Viggiano E, D'Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S, Bello L, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Bianco F, Van der Haawue M, Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Alfonsi C, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali SC, Napolitano S, Bruno C, Polit- tano L, Comi GP, Bertini E, Morandi L, Gualandi F, Ferlini A, Goemans N, Mercuri E. 75

76 76 6 Minute walk test in Duchenne MD patients with different mutations: 12 month changes. PLOS ONE Jan 8; 9(1): I.F.: 3.53 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 6:Neuroscienze Cliniche e di Base 8. Giuliani A, Moroncini F, Mazzoni S, Belicchi ML, Villa C, Erratico S, Colombo E, Calcaterra F, Brambilla L, Torrente Y, Albertini G, Della Bella S. Polyglycolic acid-polylactic acid scaffold response to different progenitor cell in vitro cultures: a demonstrative and comparative X-ray synchrotron radiation phasecontrast microtomography study. Tissue Eng Part C Methods Apr; 20(4): I.F.: ETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 9. Clementina Sitzia, Andrea Farini, Federica Colleoni, Francesco Fortunato, Paola Razini, Silvia Erratico, Alessandro Tavelli, Francesco Fabrizi, Marzia Belicchi, Mirella Meregalli, Giacomo Comi, Yvan Torrente. Improvement of endurance of DMD animal model using natural polyphenols BioMed Research International, Issue Nutrients and Muscle Disease (MDIS) " I.F.: 2.71 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 6:Neuroscienze Cliniche e di Base 10. Orive G, Cobos R, Gorriti, Pedraz JL, Meregalli M, Torrente Y. Emerging Technologies for Tissue repair and Regeneration Special issue of Current Pharmaceutical Biotechnology I.F.: 3.40 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 11. F. Colleoni, M. Pluderi, M. Belicchi, P. Razini, N. Bresolin, D. Spagnoli, F. Raneri, P. Rampini, S. Gatti, M. Vergari, N. Grimoldi, Y. Torrente Skin Derived Stem Cells Scaffold Regenerate Axons of Injured Dorsal Root CellR4 2014; 2 (1): e809 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare CAPITOLI DI LIBRO 1. Sitzia Clemetina, Erratico Silvia, Farini Andrea, Torrente Yvan, Meregalli Mirella Stem cells in dystrophic animal models: from pre-clinic to clinical studies From Pre-clinic to Biodiversity SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare 2. M. Meregalli, A. Farini, C. Sitzia, Y. Torrente.

77 Cell Replacement Therapy in Neuromuscular and Neurodegenerative Diseases. Horizon in Neuroscience Research. Nova Publishers 2014 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare ELENCO CONGRESSI Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Autologous skin-derived stem cells and platelet-rich plasma as treatment for traumatic spinal cord injury. Y. Torrente, N. Grimoldi, M. Belicchi, S. Erratico, M. Pluderi, R. Giordano, T. Francesca, M. Marconi, P. Rampini, N. Bresolin. IRCCS Global Controls in Stem Cells, Singapore. November 5-7, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Stem cell-mediated exon skipping of the dystrophin gene by the bystander effect. Y. Torrente, M. Meregalli, C. Beley, A. Farini, C. Sitzia, P. Razini, L. Cassinelli, F. olleoni, A. Tavelli, M. Belicchi, L. Garcia. IRCCS Global Controls in Stem Cells, Singapore. November 5-7, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 6:Neuroscienze Cliniche e di Base Improvement of endurance of DMD animal model using natural polyphenols. S.E. Erratico, C. Sitzia, A. Farini, F. Colleoni, P. Razini, F. Fortunato, F. Fabrizi, M. Belicchi, M. Meregalli, G. Comi, Y.Torrente. 2nd World Congress on Targeting Microbiota. Institut Pasteur, Paris, France. October 16-17, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation, Invited speaker) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Aspetti neurologici delle cellule staminali. Y. Torrente. Uso delle cellule staminali cordonali per scopi non ematologici. European Biotech Week. Università degli Studi Tor Vergata, Roma. 6 Ottobre Comunicazione scientifica su riviste non censite (Postar presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Full-Length Dysferlin Expression Driven by Engineered Human Dystrophic Blood-Derived CD133+ Stem Cells. M. Meregalli, C. Navarro, C. Sitzia, A. Farini, P. Razini, C. Beley, L. Cassinelli, D. Parazzoli, Y. Torrente. 13th International Congress on neuromuscular diseases ICNMD. Acropolis Convention Center, Nice, France. July 5-10th, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation, Invited speaker) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 6:Neuroscienze Cliniche e di Base Cortical and spinal motor neurons controlling muscle behavior. Y. Torrente. MOTOR EURON DISEASES - Molecular and Cellular Basis of Selective Vulnerability. Sala Napoleonica, Università degli Studi di Milano. July 3rd,

78 7. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Postar presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Predicted mirnas in murine dystrophin gene. L.M. Cassinelli, F. Gandolfi, M. Forcato, S. Bicciato, M. Meregalli, Y. Torrente New Directions in Biology and Disease of Skeletal Muscle Conference. Chicago, Illinois. June 29-July 2, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Postar presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare Full-Length Dysferlin Expression Driven by Engineered Human Dystrophic Blood- Derived CD133+ Stem Cells. M. Meregalli, C. Navarro, C. Sitzia, A. Farini, E. Montani, N. Wein, P. Razini, C. Beley, L. Cassinelli, M. Belicchi, D. Parazzoli, L. Garcia, Y. Torrente New Directions in Biology and Disease of Skeletal Muscle Conference. Chicago, Illinois. June 29-July 2, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Stem Cell Salvage of injured peripheral nerve. N. Grimoldi, F. Colleoni, F. Tiberio, I. G. Vetrano, A. Cappellari, A. Costa, M. Belicchi, P. Razini, R. Giordano, D. Spagnoli, M. Pluderi, M. Morbin, S. M. Gaini, P. Rebulla, N. Bresolin and Y. Torrente. EFNS-ENS Joint Congress of European Neurology. Istanbul, Turkey. May 31 st -June 3 rd, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Autologous skin derived stem cells and platelet-rich plasma as treatment for Traumatic spinal cord injury. Y. Torrente, N. Grimoldi, M. Belicchi, S. Erratico, M. Pluderi, R. Giordano, T. Francesca, M. Marconi, P. Rampini, N. Bresolin. EFNS-ENS Joint Congress of European Neurology. Istanbul, Turkey. May 31 st -June 3 rd, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Autologous transplantation of bone marrow-derived CD133+ stem cells in facioscapulohumeral dystrophy. Y. Torrente, P. Razini, M. Belicchi, A. Mazza, A. Schiavetta, R. Giordano, M. Marconi, N. Bresolin. EFNS-ENS Joint Congress of European Neurology. Istanbul, Turkey. May 31 st -June 3 rd, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare Role Of Mesenchymal Stem Cells In Human IUGR Placentas. C. Novielli, P. Razini, C. Mandò, A. Tavelli, G.M. Anelli, M. Belicchi, I. Capriata, S. Erratico, I. Cetin, Y. Torrente. Reproductive sciences. Society for Gynaecological Investigation (SGI) Annual Meeting. Florence. March 26-29, Comunicazione scientifica su riviste non censite (Co-Chaiman and Oral presentation) RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8: Terapia Genica e Cellulare 78

79 Le cellule Staminali nella Sperimentazione Clinica. Y. Torrente. Giornata UniStem L Italia Unita dalla Scienza: il lungo e affascinante viaggio della ricerca sulle cellule staminali. Aula Magna, Università degli Studi di Milano. 14 marzo ELENCO DEI PROGETTI DI RICERCA FINANZIATI ED ANCORA IN CORSO 1. Ricerca Corrente 2014 della Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinici Caratterizzazione del midollo osseo di pazienti distrofici - Ricerca Corrente Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano Finanziamento Euro 2. Ricerca Finalizzata Ref. n. RF ( ) "Design of a clinical trial using CD133-LV(U7)" Finanziamento totale Euro (I tranche Euro erogata nel 2013) 3. Gene therapy for alpha-dystroglycan muscular dystrophy (MDC1C) _Fondazione Opsis Onlus Finanziamento Euro 4. Studio genetico e nutrizionale finalizzato alla cura delle Miopatie Miofibrillari Fondazione Roby ONLUS Finanziamento Euro 5. Motor neuron degeneration in Spinal and Bulbar Muscular Atrophy: molecular approaches to counteract mutant androgen receptor neurotoxicity Telethon Grant 2014 Finanziamento Euro 79

80 80

81 U.O.S.D. MALATTIE NEUROMUSCOLARI e RARE Responsabile: M. Moggio Collaboratori: M. Sciacco: Dirigente Medico Fondazione - Neurologo, Dottore di ricerca in Scienze Neurologiche, co-responsabile Banca tessuto muscolare scheletrico, nervo periferico, DNA e colture cellulari G. Fagiolari: Biologo - tecnico ospedaliero Fondazione M. Ripolone: Biologo borsista Fondazione P. Ciscato: Tecnico ospedaliero Fondazione R. Violano: Biologo - borsista Fondazione L. Napoli: Biologo - borsista Telethon V. Lucchini: Neurologo - Dottore di ricerca in medicina molecolare - Borsista Fondazione (sino a luglio 2014) I. Colombo: Neurologo specializzato da luglio 2014 L. Peverelli: Specializzando in Neurologia L. Villa: Specializzanda in Neurologia P. Valentini: Architetto - amministrativa - Borsista Telethon R. Xhani: Laureata in Medicina e Chirurgia, Borsista Fondazione (sino a novembre 2014) S. Testolin: Laureata in Medicina e Chirurgia, Borsista Fondazione 81

82 ATTIVITA DIAGNOSTICA Nell'anno 2014 l attivita ambulatoriale globale riguardante le malattie neuromuscolari è sovrapponibile a quella dell anno precedente. In particolare, sono state effettuate n visite nell ambulatorio per le malattie neuromuscolari in collaborazione con la UO di Neurologia. Inoltre, sono stati effettuati n. 250 accessi di DH per le suddette patologie. Sono state studiate e refertate 227 biopsie muscolari e 15 biopsie di nervo. I prelievi bioptici afferiscono al laboratorio della UOSD Malattie Neuromuscolari e Rare della Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico provenienti da: UOC di Neurologia UOSD Malattie Neuromuscolari e Rare Dipartimento di Medicina della Fondazione Altri Dipartimenti della Fondazione Altri Ospedali quali: Ospedale S. Gerardo di Monza, Istituto Auxologico-Ospedale San Luca, Istituto Mondino di Pavia, Istituto Humanitas, Istituto Don Gnocchi di Milano, Ospedale San Paolo, Ospedale Sacco, Ospedale Valduce di Como, Ospedale Cantonale di Lugano, Ospedale di Niguarda, Ospedale di Desio, Ospedale di Lugo di Romagna, Ospedale di Faenza, Ospedale di Ravenna, Ospedale di Rimini, Ospedale di Gallarate, Ospedale di Busto Arsizio, Ospedale di Melegnano, Ospedale di Ravenna, Ospedale di Vimercate, Ospedale di Legnano, Ospedale Policlinico di Pavia, Ospedale Santa Corona di Garbagnate e occasionalmente da altre strutture ospedaliere. Regolari Convenzioni o rapporti di fatturazione intercorrono fra il Servizio di Diagnostica e i citati Enti ospedalieri. Il laboratorio provvede alla tecnicazione delle biopsie, alla refertazione delle medesime, alla loro conservazione e alla spedizione dei referti ai vari enti ospedalieri. Dall anno 1999 il Laboratorio ha avuto il riconoscimento di Banca Telethon di DNA, tessuto muscolare scheletrico, nervo periferico e colture cellulari. I diversi campioni biologici stoccati nella banca sono a disposizione dei ricercatori italiani e stranieri interessati e sono elencati in un dedicato sito web: Dall anno 2001 la banca è parte dell Eurobiobank, un network di banche di Istituti scientifici di diversi paesi della Comunità Europea. Dall anno 2002 la banca è anche parte del Progetto Finalizzato dell Ospedale Maggiore Bioredepositary. Dal Luglio 2002 l Unita operativa ha ottenuto la certificazione ISO 9001:

83 Biopsie Muscolari Microscopia ottica Durante l anno 2014 sono state eseguite N 227 biopsie muscolari indagate con metodiche istologiche, istoenzimatiche e immunoistochimiche. Tutte le biopsie di pazienti col sospetto clinico di distrofia sono state studiate anche con metodiche immunologiche con anticorpi contro le varie proteine coinvolte in queste patologie (distrofina, merosina, sarcoglicani, disferlina, caveolina, emerina, alfadistroglicano, miotilina, desmina, etc.). Tutte le biopsie di pazienti col sospetto di patologia infiammatoria sono state studiate mediante specifici markers immunocitochimici. In particolare, sono stati utilizzati anticorpi anti-hla 1 (A,B,C), anti-membrane attack complex, anti-linfociti T (CD4 e CD8) e anti-b (CD 19). Biopsie con il sospetto di IBM vengono studiate con la colorazione Rosso Congo. In totale, relativamente a quanto sopra specificato, sono stati eseguiti tests. Microscopia elettronica Le biopsie muscolari sono state studiate con metodiche ultrastrutturali quando ritenuto necessario e sono stati eseguiti 84 tests. In particolare, vengono studiate tutte le biopsie di pazienti affetti da miopatie dismetaboliche per la conferma delle seguenti diagnosi: glicogenosi, lipidosi, mitocondriopatie, miopatie a corpi inclusi e miopatie congenite. Sono infine analizzate tutte le biopsie nelle quali gli studi istologici, istoenzimologici, biochimici e genetici non sono indicativi di una particolare miopatia. Biopsie di nervo Microscopia ottica Durante l anno 2014 sono state eseguite N 15 biopsie di nervo periferico. Tutti i prelievi bioptici sono studiati su sezioni criostatiche con le comuni metodiche istologiche e su sezioni semifini incluse in resina per la microscopia elettronica colorate con blu di toluidina, sono stati eseguiti 55 tests (istologia e reazioni immunocitochimiche). Viene eseguita una valutazione quantitativa della densità delle fibre mieliniche con apposito analizzatore di immagini su sezioni semifini. Di tutte le biopsie vengono allestite apposite preparazioni atte all analisi di singole fibre nervose isolate (metodica del teasing) e per ogni paziente se ne studiano almeno 100. Nelle biopsie di nervo con sospetto di patologia infiammatoria vengono inoltre eseguiti studi immunoistochimici con Abs anti HLA, MAC e linfociti. Nel sospetto di patologia da accumulo di amiloidosi viene eseguita la colorazione per il rosso congo. Microscopia elettronica Le biopsie di nervo sono state incluse in resine epossidiche e tecnicate per le osservazioni in microscopia elettronica, per l isolamento delle singole fibre nervose e per la valutazione quantitativa della densità fibrale. A tal fine sono stati eseguiti circa 45 tests (sezioni semifini e griglie per ultrastruttura). 83

84 In particolare vengono studiate tutte le biopsie nelle quali gli esami istologici e quantitativi non riescono ad indirizzare la diagnosi verso una particolare neuropatia. ATTIVITA DI RICERCA L'attività di ricerca è stata condotta utilizzando gli stessi laboratori e apparecchi impiegati per la diagnostica neuromuscolare. Anche i reagenti utilizzati sono, almeno per l 80%, quelli comunemente impiegati per la diagnostica. L attivita di ricerca ha prodotto nel 2014 i seguenti risultati: PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA ANNO 2014 SETTORE URGENZA-EMERGENZA: FISIOPATOLOGIA DELLA RELAZIONE TRA PERSONA E AMBIENTE E MALATTIE RARE Linea 1:Epidemiologia Clinica Gang Q, Bettencourt C, Machado PM, Fox Z, Brady S, Healy E, Parton M, Holton JL, Hilton- Jones D, Shieh PB, Zanoteli E, De Paepe B, De Bleecke Jr, Shaibani A, Ripolone M, Violano R, Moggio M, Barohn RJ, Dimachkie MM, Mora M, Mantegazza R, Zanotti S, Hanna MG, Houlden H. The effects of an intronic polymorphism in TOMM40 and APOE genotypes in sporadic inclusion body myositis. Neurobiology of Aging, 31 dec 2014 PII: S (15) DOI: /j.neurobiolaging Reference: NBA 9179 I.F Il lavoro ha visto il contributo della nostra UO come fornitore di campioni biologici di pazienti affetti da miopatia da corpi inclusi e custoditi nella banca della UO. Sono stati individuati dei polimorfismi a carico del gene TOMM40 e del del gene APOE che sono stati correlati a differenti quadri clinici. Colombo I, Scoto M, Manzur AY, Robb SA, Maggi L, Gowda V, Cullup T, Yau M, Phadke R, Sewry C, Jungbluth H, Muntoni F. Congenital myopathies: Natural history of a large pediatric cohort. Neurology Nov 26. pii: /WNL [Epub ahead of print] PMID: [PubMed - as supplied by publisher] I.F Si tratta di uno studio retrospettivo su125 pazienti affetti da Miopatia Congenita in età pediatrica, volto a valutare la storia naturale di tale malattia rara. Una caratterizzazione genetica è stata possibile nel 79.2% dei casi, con mutazioni del gene RYR1 come più frequenti. Si è riscontrata una mortalità del 12% nel primo anno di vita, la perdita della deambulazione nel 9%, il ricorso a ventilazione notturna e gastrostomia in un terzo dei pazienti, e a chirurgia per scoliosi nel 13%. Specifiche correlazioni genotipo-fenotipo sono state altresì descritte. Bertoldo F, Zappini F, Brigo M, Moggio M, Lucchini V, Angelini C, Semplicini C, Filosto M, Ravaglia S, Cotelli S, Todeschini A, Scarpelli M, Pancheri S, Tonin P. Prevalence of asymptomatic vertebral fractures in late-onset Pompe disease. J Clin Endocrinol Metab Nov 14:jc [Epub ahead of print] PMID: [PubMed - as supplied by publisher] I.F Si tratta di un lavoro multicentrico volto a stabilire la prevalenza delle fratture vertebrali morfometriche e a valutare la massa ossea in soggetti adulti affetti da malattia di Pompe. Lo studio ha permesso di riscontrare fratture vertebrali morfometriche nel 77% dei pazienti studiati (17 su 22). Tutte le fratture erano asintomatiche e atraumatiche e la loro presenza 84

85 era indipendente dal quadro miopatico e respiratorio. Osteopenia e osteoporosi erano presenti in oltre il 50% dei pazienti. Lo studio sottolinea la necessità di effettuare uno screening per la presenza di fratture vertebrali nei soggetti con malattia di Pompe indipendentemente dalla gravità della patologia. Levy RJ, Ríos PG, Akman HO, Sciacco M, Vivo DC, DiMauro S. Long survival in patients with leigh syndrome and the m.10191t>c mutation in MT-ND3 : a case report and review of the literature. J Child Neurol Oct;29(10):NP doi: / Epub 2013 Nov 27. PMID: [PubMed - in process] I.F Riportiamo il caso atipico di una donna affetta da sindrome di Leigh con mutazione m.10191t>c nel complesso I del gene MT-ND3. Nonostante l'esordio infantile e la gravità dei sintomi la paziente è sopravvissuta fino all'età adulta grazie ad un regime dietetico mirato e al supporto familiare. Si tratta di un ulteriore testimonianza di sopravvivenza in età adulta di un soggetto affetto da sindrome di Leigh. De Filippi P, Saeidi K, Ravaglia S, Dardis A, Angelini C, Mongini T, Morandi L, Moggio M, Di Muzio A, Filosto M, Bembi B, Giannini F, Marrosu G, Rigoldi M, Tonin P, Servidei S, Siciliano G, Carlucci A, Scotti C, Comelli M, Toscano A, Danesino C. Genotype-phenotype correlation in Pompe disease, a step forward. Orphanet J Rare Dis Aug 8;9:102. doi: /s z. PMID: [PubMed - in process]i.f Si tratta di uno studio multicentrico relativo ad un ampio numero di pazienti affetti da glicogenosi tipo II (malattia di Pompe) dei quali sono stati raccolti i dati clinici e strumentali (parametri respiratori e dosaggio CPK). Tali dati sono stati confrontati con le mutazioni genetiche di ciascun paziente e con la presenza o meno di alcuni polimorfismi genetici in grado di influenzare le caratteristiche del tessuto muscolare. Ciò ha consentito di individuare i sottogruppi di pazienti che, in base al genotipo, tendono a sviluppare più precocemente la malattia e/o ad avere una più marcata sintomatologia algica muscolare. Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Catteruccia M, Pegoraro E, Carelli V, Valentino ML, Comi GP, Minetti C, Bruno C, Moggio M, Ienco EC, Mongini T, Vercelli L, Primiano G, Servidei S, Tonin P, Scarpelli M, Toscano A, Musumeci O, Moroni I, Uziel G, Santorelli FM, Nesti C, Filosto M, Lamperti C, Zeviani M, Siciliano G. Myoclonus in mitochondrial disorders. Mov Disord May;29(6): doi: /mds Epub 2014 Feb 7. PMID: [PubMed - in process] I.F Il mioclono è una manifestazione di frequente riscontro nelle malattie mitocondriali, in particolare, insieme all'epilessia e alla presenza di fibre ragged red alla biopsia muscolare, rappresenta il cardine della sinndrome di MERFF (epilessia mioclonica con fibre Ragged Red). Scopo di questo studio multicentrico è quello di studiare la prevalenza del mioclono in soggetti affetti da mitocondiopatie e di valutare quali fenotipi clinici vi si associano, oltre alla nota sindrome di MERRF. La revisione dei pazienti è stata fatta grazie ai dati contenuti nel database del Network Italiano per le Malattie Mitocondriali. Dallo studio è emerso che il mioclono è una caratteristica clinica piuttosto rara (3.6% dei 1,086 pazienti registrati nel network), che non sottende un fenotipo o genotipo specifico, che solo uno su tre pazienti con sindrome di MERFF ha la mutazione tipica di questa patologia (8344 A>G) e che il mioclono si associa più spesso all'atassia cerebellare che non all'epilessia. 85

86 Remiche G, Ronchi D, Magri F, Lamperti C, Bordoni A, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Extended phenotype description and new molecular findings in late onset glycogen storage disease type II: a northern Italy population study and review of the literature. J Neurol Jan;261(1): doi: /s Epub 2013 Oct 25. Review. PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE] I.F Gli autori hanno effettuato una correlazione genotipo-fenotipo in 36 pazienti affetti da glicogenosi di tipo II (Malattia di Pompe) ad esordio tardivo allo scopo di identificare quali siano le mutazioni più deleterie ossia quelle che si associano ad una maggior disabilità dal punto di vista muscolare e respiratorio. L obiettivo è quello di identificare fattori prognostici il più possibile accurati anche per meglio definire le strategie di follow-up e l algoritmo per la somministrazione di enzima ricombinante. Linea 3:Nuove Emergenze per la Cura della Salute Esposito S, Bruno C, Berardinelli A, Filosto M, Mongini T, Morandi L, Musumeci O, Pegoraro E, Siciliano G, Tonin P, Marrosu G, Minetti C, Servida M, Fiorillo C, Conforti G, Scapolan S, Ansaldi F, Vianello A, Castaldi S, Principi N, Toscano A, Moggio M. Vaccination recommendations for patients with neuromuscular disease. Vaccine Oct 14;32(45): doi: /j.vaccine Epub 2014 Sep 16. PMID: [PubMed - in process]i.f Il lavoro presenta le raccomandazioni relative alla problematica delle vaccinazioni in pazienti affetti da malattie neuromuscolari. Il lavoro presenta il consenso delle diverse società scientifiche che hanno congiuntamente redatto il consenso. Brunetti D, Dusi S, Giordano C, Lamperti C, Morbin M, Fugnanesi V, Marchet S, Fagiolari G, Sibon O, Moggio M, d'amati G, Tiranti V. Pantethine treatment is effective in recovering the disease phenotype induced by ketogenic diet in a pantothenate kinase-associated neurodegeneration mouse model. Brain Jan;137(Pt 1): doi: /brain/awt325. Epub 2013 Dec 6. PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE] I.F Analisi di un modello animale (tipo knockout) per il gene PANK2, le cui mutazioni sono responsabili di un disturbo autosomico recessivo caratterizzato da distonia, disartria, rigidità, retinite pigmentosa e accumulo di ferro a livello encefalico. Il lavoro dimostra che la somministrazione di pantetina può impedire lo sviluppo del fenotipo patologico neuromuscolare nei topi, suggerendo la possibilità di un utilizzo della sostanza a livello sperimentale nei soggetti affetti. Regulating Biobanks in Humans: The Use of Adult and Children Biomaterials for Clinical and Research Purposes. Editor: Elena Salvaterra Contributing Authors: E. Salvaterra, R. Giorda, M.T. Bassi, R. Borgatti, L. Knudsen, A. Martinuzzi, M. Nobile, U. Pozzoli, G.P. Ramelli, G.L. Reni, D. Rivolta, M.A. Stazi, S. Strazzer, C. Thijs, V. Toccaeli, A. Trabacca, A.C. Turconi, S. Zanini. C. Zucca, N. Bresolin, L. Lenzi, S. Giovanelli, B. Butti, M.T. Bardella, P.A. Bertazzi, S. Bosari, G. Coggi, D. A. Coviello, F. Lalatta, M. Moggio, M. Nosotti, A. Zanella, and P. Rebulla. Nova Publisher

87 Il lavoro presenta il consenso dei maggiori esperti nazionali in ambito di "biobanche", relativo alle modalità di stoccaggio, e distribuzione di materiale biologico nonché relativo alle corrette procedure di raccolta del consenso informato e dei dati sensibili relativi ad ogni donatore. Linea 4: Terapia Personalizzata (neonato, bambino, anziano ) Bushby K, Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW, Flanigan KM, Goemans N, Jones KJ, Mercuri E, Quinlivan R, Renfroe JB, Russman B, Ryan MM, Tulinius M, Voit T, Moore SA, Lee Sweeney H, Abresch RT, Coleman KL, Eagle M, Florence J, Gappmaier E, Glanzman AM, Henricson E, Barth J, Elfring GL, Reha A, Spiegel RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP. Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy. Muscle Nerve Oct;50(4): doi: /mus PMID: [PubMed - in process] I.F Risultati dello studio multicentrico, condotto in doppio cieco e controllato da placebo, relativo al trattamento con Ataluren di bambini affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) con mutazione nonsense sul gene della distrofina. Le mutazioni nonsense rappresentano circa il 13% dei casi di DMD. Ataluren è stato sviluppato per interagire coi ribosomi e consentire di bypassare gli stop codons prematuri indotti dalla mutazione genetica sull'rna messaggero in modo da consentire alle cellule di produrre una proteina di lunghezza normale e funzionante. Ataluren è stato ben tollerato e i risultati in base agli endpoint primari e secondari sono promettenti. SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 6:Neuroscienze Cliniche e di Base Montagnese F, Portaro S, Musumeci O, Migliorato A, Moggio M, Fagiolari G, Rodolico C. Sporadic late-onset nemaline myopathy in a woman with multiple myeloma successfully treated with lenalidomide/dexamethasone. Muscle Nerve Dec 19. doi: /mus [Epub ahead of print] No abstract available. PMID: [PubMed - as supplied by publisher] I.F Descrizione di un caso clinico di paziente affetta da miopatia nemalinica ad esordio tardivo, complicata da mieloma multiplo, che ha risposto positivamente al trattamento con associazione lenalidomide-desametasone. Moggio M, Colombo I, Peverelli L, Villa L, Xhani R, Testolin S, Di Mauro S, Sciacco M. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myologica 2014; XXXIII: p Lavoro descrittivo delle numerose complicanze cliniche e multisistemiche associate alla presenza di malattie mitocondriali. Il lavoro si prefigge di tracciare delle linee guida su come individuare, monitorare e, quando possibile, trattare le diverse complicanze allo scopo di migliorare la prognosi dei pazienti. Mora M, Angelini C, Bignami F, Bodin AM, Crimi M, Di Donato JH, Felice A, Jaeger C, Karcagi V, LeCam Y, Lynn S, Meznaric M, Moggio M, Monaco L, Politano L, de la Paz MP, Saker S, Schneiderat P, Ensini M, Garavaglia B, Gurwitz D, Johnson D, Muntoni F, Puymirat J, Reza M, Voit T, Baldo C, Bricarelli FD, Goldwurm S, Merla G, Pegoraro E, Renieri A, Zatloukal K, Filocamo M, Lochmüller H. The EuroBioBank Network: 10 years of hands-on experience of collaborative, transnational biobanking for rare diseases. 87

88 Eur J Hum Genet Dec 24. doi: /ejhg [Epub ahead of print] PMID: [PubMed - as supplied by publisher] I.F Il network della EuroBioBank (EBB) (www.eurobiobank.org) è il primo network di biobanche europee in grado di fornire campioni di DNA e di altri tessuti biologici alla comunità scientifica per promuovere la ricerca sulle malattie rare (Rare Diseases, RD). La EBB, riconosciuta e finanziata dalla Comunità Europea nel 2002 (5th framework programme) subito dopo la sua fondazione, ha partecipato negli anni a vari programmi tra cui il TREAT-NMD, e ha preso parte alla pianificazione della European Biobanking and Biomolecular Resources Research Infrastructure. Recentemente, EBB è diventata partner di RD-Connect, un programma europeo dedicato alle malattie rare mirato a coordinare biobanche, registri e dati bioinformatici. Melchionda L, Haack TB, Hardy S, Abbink TE, Fernandez-Vizarra E, Lamantea E, Marchet S, Morandi L, Moggio M, Carrozzo R, Torraco A, Diodato D, Strom TM, Meitinger T, Tekturk P, Yapici Z, Al-Murshedi F, Stevens R, Rodenburg RJ, Lamperti C, Ardissone A, Moroni I, Uziel G, Prokisch H, Taylor RW, Bertini E, van der Knaap MS, Ghezzi D, Zeviani M. Mutations in APOPT1, encoding a mitochondrial protein, cause cavitating leukoencephalopathy with cytochrome c oxidase deficiency. Am J Hum Genet Sep 4;95(3): doi: /j.ajhg Epub 2014 Aug 28. PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE] I.F In questo lavoro si evidenzia come grazie alle tecniche di sequenziamento dell'intero genoma sia stato possibile individuare mutazioni nel gene APOPT1 in due sorelle italiane, in un paziente turco e in tre bambini tra loro non imparentati che presentavano leucodistrofia alla RM cerebrale oltre che deficit di COX alla biopsia muscolare. Le caratteristiche cliniche di questa nuova entità nosologica vanno dal grave scompenso metabolico in età infantile alla comparsa di segni neurologici minori durante l'adolescenza. Il lavoro descrive in dettaglio gli esperimenti che hanno permesso di individuare come APOPT1 codifichi per una proteina mitocondriale e come le funzioni di tale proteina vengano compromesse dalla mutazione genetica. Protti A, Fortunato F, Caspani ML, Pluderi M, Lucchini V, Grimoldi N, Solimeno LP, Fagiolari G, Ciscato P, Zella SM, Moggio M, Comi GP, Gattinoni L. Mitochondrial changes in platelets are not related to those in skeletal muscle during human septic shock. PLoS One May 1;9(5):e doi: /journal.pone ecollection PMID: [PubMed - in process] I.F Le piastrine possono essere utilizzate per studiare la funzione, o la disfunzione mitocondriale in numerose patologie. In questo studio, tramite spettrofotometria, abbiamo effettuato uno studio biochimico della catena respiratoria mitocondriale nelle piastrine e nel muscolo tricipite di 30 pazienti ricoverati per shock settico acuto e di dieci controlli (prelievo in occasione di intervento chirurgico programmato). I pazienti con shock settico hanno mostrato un'inibizione di alcuni enzimi della catena respiratoria nelle piastrine, ma non nel muscolo tricipite, rispetto ai controlli. Sembra quindi che lo shock settico induca delle alterazioni mitocondriali focali, in questo caso nelle piastrine, che non sono presenti in altri organi e tessuti. 88

89 Diodato D, Invernizzi F, Lamantea E, Fagiolari G, Parini R, Menni F, Parenti G, Bollani L, Pasquini E, Donati MA, Cassandrini D, Santorelli FM, Haack TB, Prokisch H, Ghezzi D, Lamperti C, Zeviani M. Common and Novel TMEM70 Mutations in a Cohort of Italian Patients with Mitochondrial Encephalocardiomyopathy. JIMD Rep Apr 17. [Epub ahead of print] PMID: [PubMed - as supplied by publisher] I.F Studio multicentrico di dieci soggetti italiani con quadro clinico caratterizzato da acidosi lattica neonatale, insufficienza respiratoria, ipotonia, cardiomiopatia e ritardo psicomotorio che presentano mutazioni a trasmissione autosomica recessiva nel gene TMEM70. La proteina TMEM70, la cui funzione interferisce col funzionamento del complesso v della catena respiratoria e porta ad un deficit di ATP sintasi, è risultata assente nei campioni muscolari di tutti i soggetti studiati. Alcune delle mutazioni individuate rappresentano varianti note, ma sono anche state individuate quattro varianti nuove.i pazienti studiati presentavano anche un deficit a carico degli altri complessi della catena respiratoria e l'analisi ultrastrutturale del tessuto muscolare di uno dei soggetti affetti ha mostrato marcate alterazioni morfologiche a carico dei mitocondri. tali risultati indicano che il deficit di complesso v induce una riduzione indiretta degli altri complessi della catena respiratoria causando grave alterazione a carico dei mitocondri. Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti S, Corti S,Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Glycogen storage disease type III: A novel Agl knockout mouse model. Biochim Biophys Acta Nov;1842(11): doi: /j.bbadis Epub 2014 Aug 1. PMID: [PubMed - in process] I.F Nicholls TJ, Zsurka G, Peeva V, Schöler S, Szczesny RJ, Cysewski D, Reyes A, Kornblum C, Sciacco M, Moggio M, Dziembowski A, Kunz WS, Minczuk M. Linear mtdna fragments and unusual mtdna rearrangements associated with pathological deficiency of MGME1 exonuclease. Hum Mol Genet Dec 1;23(23): doi: /hmg/ddu336. Epub 2014 Jun 30. PMID: [PubMed - in process] I.F Si tratta di uno studio biomolecolare mirato ad approfondire le funzioni di MGME1, un'esonucleasi mitocondriale coinvolta nei processi di replicazione e mantenimento del DNA mitocondriale (mtdna). Mutazioni nel gene che codifica per questa proteina causano una grave patologia mitocondriale a trasmissione autosomica recessiva caratterizzata da cachessia ed insufficienza respiratoria ingravescenti. lo studio in oggetto approfondisce le conoscenze sul ruolo della proteina che risulta essere essenziale per la corretta replicazione del genoma mitocondriale mediante interazione con la replicasi PolgA. Non escludibile un suo ruolo nei processi di ricombinazione intramolecolare del mtdna. Cortese A, Tucci A, Piccolo G, Galimberti CA, Fratta P, Marchioni E, Grampa G, Cereda C, Grieco G, Ricca I, Pittman A, Ciscato P, Napoli L, Lucchini V, Ripolone M, Violano R, Fagiolari G, Mole SE, Hardy J, Moglia A, Moggio M. Novel CLN3 mutation causing autophagic vacuolar myopathy. Neurology Jun 10;82(23): doi: /WNL Epub 2014 May 14. PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE] I.F

90 Si tratta dello studio clinico, morfologico e biomolecolare di due fratelli con quadro clinico di deficit del visus, crisi comiziali e cardiomiopatia in assenza di deficit motorio e con associato lieve decadimento cognitivo. La biopsia muscolare mostrava vacuoli autofagici e uno studio biomolecolare combinato (homozigosity mapping ed exome sequencing) ha consentito di individuare una nuova mutazione, p.gly165glu, nel gene CLN3. Kalko SG, Paco S, Jou C, Rodríguez MA, Meznaric M, Rogac M, Jekovec-Vrhovsek M, Sciacco M,Moggio M, Fagiolari G, De Paepe B, De Meirleir L, Ferrer I, Roig-Quilis M, Munell F, Montoya J, López-Gallardo E, Ruiz-Pesini E, Artuch R, Montero R, Torner F, Nascimento A, Ortez C, Colomer J, Jimenez-Mallebrera C. Transcriptomic profiling of TK2 deficient human skeletal muscle suggests a role for the p53 signalling pathway and identifies growth and differentiation factor-15 as a potential novel biomarker for mitochondrial myopathies. BMC Genomics Feb 1;15:91. doi: / PMID: [PubMed - in process] I.F E' noto che mutazioni nel gene timidina chinasi (TK2) causano una encefalomiopatia mitocondriale infantile con associata deplezione del DNA mitocondriale (mtdna). Lo scopo di questo lavoro è quello di individuare i meccanismi che sottendono la patologia al fine di individuare potenziali strategie terapeutiche. I risultati dello studio hanno consentito di individuare fattori regolatori trascrizionali che potrebbero spiegare l'alterata espressione del gene in oggetto a livello muscolare, in particolare p53, un soppressore tumorale, e GDF-15, un fattore di crescita e differenziazione attivo a livello muscolare e sierico, che potrebbe costituire un potenziale nuovo biomarcatore di disfunzione mitocondriale. Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Donati A, Minetti C, Moggio M, Mongini T, Servidei S, Tonin P, Toscano A, Uziel G, Bruno C, Ienco EC, Filosto M, Lamperti C, Catteruccia M, Moroni I, Musumeci O, Pegoraro E, Ronchi D, Santorelli FM, Sauchelli D, Scarpelli M, Sciacco M, Valentino ML, Vercelli L, Zeviani M, Siciliano G. The m.3243a>g mitochondrial DNA mutation and related phenotypes. A matter of gender? J Neurol Mar;261(3): doi: /s Epub 2013 Dec 29. PMID: [PubMed - in process] I.F Studio retrospettivo del fenotipo clinico di 126 pazienti italiani (facenti parte del database nazionale) portatori della mutazione puntiforme m.3243a>g del DNA mitocondriale (mutazione MELAS, encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica ed episodi strokelike ). Analisi e commenti in merito alla marcata eterogeneita clinica sottolineando come i sintomi più comuni siano costituiti da ipoacusia e diabete, seguiti da episodi stroke-like. Questi ultimi, almeno nella popolazione italiana, sembrano essere più frequenti nei soggetti di sesso maschile. Sancisi V, Germinario E, Esposito A, Morini E, Peron S, Moggio M, Tomelleri G, Danieli- Betto D, Tupler R. Altered Tnnt3 characterizes selective weakness of fast fibers in mice overexpressing FSHD region gene 1 (FRG1). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol Jan 15;306(2):R doi: /ajpregu Epub 2013 Dec 4. PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE] I.F Studio di un modello animale (topo FRG1) per la distrofia Facio-Scapolo-Omerale in cui si evince che la fibre muscolari rapide, le più compromesse dal processo distrofico, mostrano 90

91 anomalie nell isoforma veloce delle troponina muscolare. Ciò correla col riscontro nei pazienti distrofici di uno splicing aberrante nella troponina T scheletrica (TNNT3). Gli autori concludono che le alterazioni della troponina potrebbero rappresentare un marker biologico della gravità della malattia e della sua progressione. Linea 8:Terapia Genica e Cellulare De Palma C, Morisi F, Cheli S, Pambianco S, Cappello V, Vezzoli M, Rovere-Querini P, Moggio M,Ripolone M, Francolini M, Sandri M, Clementi E. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis Aug 7;5:e1363. doi: /cddis No abstract available. PMID: [PubMed - in process] I.F PROGETTI IN CORSO Prosegue il progetto Correlazioni genotipo fenotipo nella distrofia Facio Scapolo Omerale (FSHD) nell ambito del Consorzio Italiano per la FSHD con particolare attenzione per i casi con aplotipi permissivi A166. Lo studio è condotto su 23 famiglie che appartengono ai circa 700 casi indice studiati in corso del precedente progetto. Si tratta di un progetto in collaborazione con tutti i centri presenti in Italia che seguono pazienti affetti da tale malattia e che sono riuniti nel Telethon network of FSHD. E in fase di validazione la messa a punto di una nuova e aggiornata scheda di valutazione clinica di pazienti affetti da FSHD che, rispetto a quella in uso, permette un maggior dettaglio clinico e quindi migliori correlazioni genotipiche. E iniziato il percorso per un consenso attinente i requisiti diagnostici dei pazienti affetti da FSHD2, ovvero tutti quei pazienti che, pur presentando un quadro clinico compatibile con la distrofia FSHD, non sono portatori di una contrazione dell allele D4Z4. Continua lo studio di una famiglia composta da due germani, un maschio di 30 anni e una femmina di 23 anni, entrambi affetti da distrofia facio-scapolo omerale (FSHD) con compromissione clinica rispettivamente moderata e lieve. Entrambi sono portatori di un frammento corto D4Z4 sul cromosoma 4q35 considerato diagnostico della patologia in questione. Anche la madre e il nonno materno presentano lo stesso difetto genetico, ma non sono clinicamente compromessi. Ciò potrebbe essere spiegato da una penetranza incompleta della patologia, in alternativa, potrebbe trattarsi di una forma a trasmissione autosomica recessiva nella quale il frammento corto D4Z4, ereditato in questo caso per via materna, unitamente ad un fattore genetico sconosciuto ereditato per via paterna, determina la malattia. Nel corso dell ultimo anno, i risulati di uno studio di next generation sequencies (NGS) hanno evidenziato nei probandi una serie di alterazioni in eterozigosi di geni responsabili di altre malattie neuromuscolari Proseguono le indagini bioptiche morfologiche e biochimiche in pazienti affetti da Glicogenosi di tipo II e che assumono terapia con enzima ricombinante (ERT Therapy). Lo studio è coordinato dal nostro laboratorio assieme ai colleghi dell Istituto Besta e prevede una analisi bioptica muscolare dopo 6 mesi, un anno e due anni dall inizio della terapia. Oltre alle valutazioni morfologiche ed ultrastrutturali classiche, verrà indagato il sistema fagosomi/lisosomi con reazioni immunocitochimiche nonché eseguito un dosaggio biochimico dell enzima alpha glicosidasi. Si tratta di un progetto multicentrico che coinvolge tutte le UUOO che in Italia somministrano enzima ricombinante a pazienti affetti da glicogenosi tipo II. Il progetto, iniziato due anni fa, è proseguito nel 2013 con l acquisizione di 19 seconde biopsie provenienti, oltre che dal nostro Istituto, dai centri 91

92 nazionali parte del network. Sono in corso le valutazioni sopraindicate e confermiamo i risultati preliminari che sembrano attestare l efficacia della terapia. Nel corso dell ultimo anno il numero di pazienti è aumentato a 18. In tutti è stato dimostrato un incremento dell attivita enzimatica GAA nelle seconde biopsie e in nove di questi, tramite metodica di WB, è stato dimostrato un incremento della proteina GAA nelle seconde biopsie. E stato ultimato il progetto: studio della deplezione del DNA mitocondriale (mtdna) in soggetti affetti da atrofia muscolare spinale (SMA). Tale deplezione è ritenuta di tipo secondario, conseguente alla marcata ipotrofia muscolare indotta dalla patologia di base. Abbiamo pertanto iniziato una revisione sistematica di 17 biopsie muscolari provenienti da altrettanti pazienti affetti da SMA (tipo I, II o III). Dati preliminari mostrano come vi sia un deficit di citocromo c ossidasi (COX) nella maggior parte dei campioni bioptici, e come il deficit sia più marcato nella forma più grave e ad esordio precoce, la SMA I. Il deficit non interessa soltanto le fibre ipotrofiche, inoltre, lo studio parallelo di frammenti muscolari provenienti da pazienti pari-età affetti da altre patologie neurogene, mostra un attivita COX nella norma. Ciò supporta l ipotesi che la disfunzione mitocondriale nella SMA non sia di tipo secondario, ma, piuttosto, contribuisca all eziopatogenesi della malattia. I nostri dati hanno evidenziato una riduzione di espressione di geni deputati alla replicazione mitocondriale. Continua la rivalutazione retrospettiva di biopsie muscolari della nostra Banca per evidenziare miopatie indotte da mutazioni nei geni che causano miopatie miofibrillari e miopatie congenite. E stato completato il progetto Analisi biochimica, istologica e test comportamentali per lo studio della glicogenosi di tipo III nel modello murino knockout Agl in collaborazione con il Prof. Comi Giacomo Pietro, Laboratorio di Genetica e Biochimica - Dipartimento di Scienze Neurologiche dell Universita di Milano Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano. Abbiamo iniziato lo studio dei modelli knockout, trattati con terapia retro virale (adenovirus), per verificare se tale terapia porti ad una diminuzione delle vaste raccolte di glicogeno libero intramuscolare. Prosegue lo Studio istopatologico, morfometrico e ultrastrutturale del topo transgenico che overesprime DRP1, una proteina che svolge un ruolo critico nella fissione dei mitocondri; in collaborazione con il Prof. Clementi Emilio, Unità di Farmacologia, IRCCS San Raffaele, Milano. E stato ultimato il Progetto Vaccinazioni e malattie neuromuscolari. IL progetto, in collaborazione con i colleghi pediatri e quelli della UO di Igiene, ha affrontato il delicato aspetto delle vaccinazioni in pazienti affetti dalle più frequenti malattie neuromuscolari. FINANZIAMENTI IN CORSO Ministero della Salute Ricerca corrente 2015 "Storia naturale delle alterazioni istopatologiche muscolari in una larga coorte di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne sia in terapia steroidea, sia senza tale terapia" Telethon Network Progetto Telethon Network of Genetic Biobank anni Telethon Network Development of the Italian National Registry for FSHD anni

93 Telethon Network Building a Nation-wide Italian collaborative network for muscle glycogenoses: registry and natural history anni

94 94

95 SEDE DISTACCATA DEL CENTRO DINO FERRARI - UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO presso U.O. NEUROLOGIA STROKE UNIT LABORATORIO DI NEUROSCIENZE UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO IRCCS ISTITUTO AUXOLOGICO ITALIANO Responsabile Prof. Dott. Vincenzo Silani U.O. Neurologia: Dott.ssa Laura Adobbati Dirigente I Livello Stroke Unit IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Luca Maderna Dirigente I Livello,Neurofisiologo IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Stefano Messina Dirigente I Livello IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Andrea Ciammola Dirigente I Livello IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Barbara Corrà Dirigente I livello Stroke Unit IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Nicola Ticozzi Neurologo, Ricercatore Universitario Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott.ssa Claudia Morelli Neurologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Luca Campana Neurologo, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Riccardo Doronzo Neurologo, Consulente in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott.ssa Carolina Lombardi Neurofisiologa, Dirigente I Livello Centro Medicina del Sonno IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott.ssa Paola Mattaliano Neurofisiologo, Consulente in convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Niccolò Mencacci Neurologo, Dottorato UCL Institute of Neurology- Londra Dott. Alberto Lerario Dott. Alberto Doretti Dott. Federico Verde Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano 95

96 Dott. Davide Sangalli Dott.ssa Barbara Poletti Dott.ssa Annalisa Lafronza Dott. Laura Carelli Dott.ssa Federica Solca Dott. Paolo Banfi Barbara Riccardi Francesca Gregorini Patrizia Nelli IRCCS Istituto Auxologico Italiano Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Psicologa, Consulente in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano Psicologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Psicologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Psicologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Pneumologo, Consulente in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano Tecnico neurofisiologa IRCCS Istituto Auxologico Italiano Tecnico neurofisiologa IRCCS Istituto Auxologico Italiano Segreteria Scientifica U.O. Neurologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Laboratorio di Neuroscienze Dott.ssa Antonia Ratti Dott.ssa Lidia Cova Dott.ssa Isabella Fogh Dott.ssa Patrizia Bossolasco Dott.ssa Claudia Colombrita A Dott.ssa Cinzia Tiloca Dott.ssa Jenny Sassone Dott. ssa Elisa Onesto Dott.ssa Valentina Diana Dott. ssa Daniela Calini Dott.ssa Annamaria Maraschi 96 Biologa, Ricercatore Universitario ConfermatoUniversità degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biologa, Sovvenzione Associazione Centro Dino Ferrari King s College di Londra Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biologa, Assegni di ricerca Post doc -Tipo Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biotecnologa, Dottoranda Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biotecnologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biotecnologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano CTF, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

97 Dott.ssa Francesca Sassone Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano Rapporti di collaborazione: Nazionali: Centro Dino Ferrari IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS Istituto C. Besta, Milano IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS Istituto Mondino, Pavia Centro Clinico Nemo Dipartimento di Endocrinologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dipartimento di Farmacologia Università di Milano - CEND Neuroimaging Research Unit and Department of Neurology, Institute of Experimental Neurology, Division of Neuroscience and Department of Neuroradiology, Vita-Salute University and San Raffaele Scientific Institute, Milan IRCCS Istituto Mondino, Pavia Prof. Nereo Bresolin, Prof. Giacomo Comi Dott.Maurizio Moggio, Prof. Elio Scarpini, Dott.ssa Daniela Galimberti, Dott.ssa Stefania Corti, Dott. Roberto Del Bo Dott.ssa Cinzia Gellera, Dott.Tagliavini Dott. Franco Taroni Prof. Paolo Rebulla Dott.ssa Lorenza Lazzari Prof. Giorgio Lambertenghi, Dott. Fabio Blandini, Dr.ssa Marie Armentero Dott. Christian Lunetta Prof. L. Persani Dott. Luigi Sironi, Dott. A.E. Rigamonti, Prof. Massimo Filippi Dott. ssa Federica Agosta Prof. Giacomo Comi Prof. Andrea Falini Dott. Fabio Blandini, Dott.ssa Cristina Cereda Internazionali: University of Massachussetts Medical School of Boston Università di Ulm, Germania Dipartimento di Neurologia King s College, London Prof. Robert H. Brown, John Landers Prof. Albert Ludolph Prof. Al-Chalabi, Christian Shaw 97

98 Dipartimento di Neurologia Dipartimento di Neurologia Università di St. Gallen, Svizzera Prof. John Powell Prof. Markus Weber 98

99 ATTIVITÀ SCIENTIFICA ANNO 2014 La Sede Distaccata del Centro "Dino Ferrari" presso la U.O. di Neurologia e Laboratorio di Neuroscienze dell' Università di Milano - IRCCS Istituto Auxologico Italiano ha prodotto nel 2014 una serie di lavori scientifici incrementando l attivita clinica e diversificandosi a cogliere la complessità della patologia neurodegenerativa. E proseguita l operazione di formazione dei più giovani ricercatori e medici che con successo sono stati inviati in Laboratori sia in Nord America che in Europa. La crescita degli investimenti in apparecchiature dedicate alla genetica ed alla biologia molecolare ha dato rilievo alle collezioni di materiale biologico ed ha permesso continuare l operato del Consorzio SLAGEN con un lavoro sinergico tra 6 diverse Istituzioni Italiane. Il Centro Dino Ferrari è stato l interlocutore per informazioni sulle casistiche Italiane per quanto riguarda le malattie neurodegenerative e la SLA in particolare. Il mondo della Demenza Fronto- Temporale (FTD) è divenuto continuo con quello della SLA dopo le recenti evidenze biologiche e il Centro ha aderito all Italian Frontotemporal dementia network (FTD Group SINDEM). Le équipe multidisciplinari sono state l obiettivo perseguito per le diverse patologie e ciò ha permesso di sviluppare tematiche di ricerca come Brain-Computer Interface (BCI) ed Eye Tracking (ET) per la comunicazione dei pazienti. Un moderno ed umano approccio alle più temibili malattie neurodegenerative quali SLA, Demenze, Malattie di Huntington, Malattia di Parkinson rappresenta l obiettivo perseguito della U.O. di Neurologia di cui il Centro Dino Ferrari fa parte operante, vicino alla matrice storica della IRCCS Fondazione Ca Granda Ospedale Maggiore di Milano dove è originariamente nato. L aprirsi degli interessi alla patologia cerebrovascolare è stato di dovere dopo l affidamento della nuova Stroke Unit dal 2007 e ciò ha fornito nuovi spunti di ricerca intersecati alla patologia neurodegenerativa. In particolare è maturato un largo interesse per la patologia amiloidotica primitiva dei vasi cerebrali. Nel 2014 è stata ulteriormente sviluppata la Neurofisiologia con studio anche della patologia nel sonno, mediante proficua interazione con la U.O. di Cardiologia diretta dal Prof. Gianfranco Parati. Il momento riabilitativo ha molto occupato l attenzione del Centro Dino Ferrari che ha collaborato a disegnare le fasi successive alla diagnosi nelle diverse patologie, proponendo studi clinici ed innovativi approcci riabilitativi spesso in sintonia con gli organismi Sanitari Regionali anche per l analisi dei costi. La ricercata interazione tra eccellenza clinica e ricerca di base si è espressa nel 2014 con il completamento della pù vasta metanalisi di GWA in oltre campioni di DNA con identificazione di un locus sul cromosoma 17 associato alla SLA sporadica (Fogh et al., Hum Mol Gen 2014). Inoltre, nell ambito di un vasto progetto colalborativo è stato identificato il gene TUBA4A quale associato alla SLA (Smith et al., Neuron, 2014) ed identificato un biomarcatore liquorale nei pazienti affetti da SLA/FTD e portatori di espansione per C9orf72 (Su et al., Neuron, 2014). Una review dedicata alla terapia della SLA è stata firmata dal prof. Silani unitamente a H. Mitsumoto e Brooks (Mitsumoto, Brooks e Silani, Lancet Neurol, 2014). Di rilievo anche l evidenza di una interazione tra parkina e i recettori GluK2 nella Malattia di Parkinson ( Maraschi et al., Nature Comm 2014). Di recente un vasto studio dell esoma (circa 3000 esomi) di pazienti affetti da SLA ha maturato una accettazione dei dati sulla prestigiosa rivista Science (Cirulli et al., in press, 2015) La Sede Distaccata del Centro Dino Ferrari ha ulteriormente ottimizzato gli investimenti in ricerca presso il Centro di Ricerche e Tecnologie Biomediche di Cusano Milanino dove ha locazione il Laboratorio di Neuroscienze. L acquisizione dell apparecchiatura Illumina, piattaforma per l analisi più approfondita di polimorfismi a singolo nucleotide (SNIP) in relazione alle patologie neurodegenerative di cui il Centro "Dino Ferrari" per tradizione si 99

100 occupa, ha permesso il completamento appunto del progetto di associazione genica tipo genoma wide (GWA) per la definizione di geni di suscettibilità nella SLA sporadica dopo creazione del Consorzio SLAGEN per la raccolta dei campioni di DNA e una sincronia di ricerca presso Centri Italiani di grande prestigio. La diagnostica molecolare è stata ulteriormente arricchita potendo fornire oggi un pannello diagnostico completo per le malattie del motoneurone (SLA), per i disturbi extrapiramidali (Malattia di Huntington e di Parkinson) e per alcune miopatie (Distrofia Miotonica, Miopatia Oculo-Faringea, etc.). L' attivita clinica presso l U.O. di Neurologia Stroke Unit dell IRCCS Istituto Auxologico Italiano è stata ulteriormente sviluppata con la creazione di èquipe multidisciplinari per le diverse patologie neurodegenerative (SLA, Disturbi del Movimento, Malattie Cerebrovascolari, Disturbi Cognitivi). Sono stati ampliati, in particolare, gli ambulatori ed i servizi dedicati all' inquadramento multidisciplinare dei Disturbi Cognitivi e dei Disturbi del Movimento. È stata completata la richiesta per il riconoscimento di un Centro Regionale dedicato ai Disturbi Cognitivi (I e II livello). È proseguita sotto la direzione della U.O. di Neurologia l attivita della moderna Stroke Unit con 6 letti di cui 4 con monitorizzazione fissa che ha comportato l acquisizione e la formazione di nuovo personale specializzato, medico che infermieristico. È stata avviata una intensa attività clinica con monitoraggio innovativo di diversi parametri funzionali e studio del sonno in pazienti ricoverati per ictus acuto, in stretta collaborazione con la U.O. di Cardiologia diretta dal Prof. Gianfranco Parati. La collaborazione con il Dipartimento di Neuroscienze della IRCCS Fondazione Ca Granda Ospedale Maggiore Università di Milano ha permesso di completare con successo molteplici procedure di trombolisi endovenosa ed endoarteriosa con limitata incidenza di effetti collaterali, contando sulla consulenza neurochirurgica della medesima istituzione. L acquisizione di una nuova RM 3T rappresenta il presupposto per una nuova ricerca volta, in particolare, allo studio della patologia neurodegenerativa e cerebrovascolare. Il Servizio di Neurofisiologia coordinato dal Dott. Luca Maderna ha dato impulso sia dell attivita clinica che di ricerca di base con sviluppo di tecniche innovative di registrazione del muscolo diaframma utile a porre indicazione precoce per la ventilazione non invasiva in pazienti affetti da SLA e diverse patologie muscolari (Distrofia Miotonica di Steinert), allo studio del nervo periferico mediante utilizzo di Ecodoppler ed all apprendimento di una moderna tecnica per la determinazione del numero di motoneuroni fisiologicamente attivi (MUNE). L' attività didattica è stata espletata nel 2014 per Specializzandi in Neurologia affidati alla U.O. di Neurologia, Studenti in Medicina e Chirurgia che hanno selezionato la struttura per elaborare la Tesi di Laurea e Studenti in Biologia o Biotecnologie che hanno scelto di frequentare il Laboratorio di Neuroscienze per il tirocinio pre-laurea elaborando la Tesi. Dottorandi di Ricerca hanno concluso il loro iter con la discussione delle relative Tesi. I rapporti con diversi ricercatori del Centro "Dino Ferrari" sono stati molto attivi con l' avanzamento di comuni progetti. In particolare, il progetto di studio relativo alla caratterizzazione istochimica ed immunoistochimica di prelievi bioptici di nervo e di muscolo di pazienti affetti da diversa patologia neuromuscolare (Prof. Maurizio Moggio) con analisi biochimica o molecolare in casi selettivi (Prof. Giacomo Comi). La ricerca di base si è articolata in diverse tematiche che hanno rappresentato la fisiologica evoluzione di studi in parte avviati nel 2013, in armonia con le problematiche cliniche istituzionali di cui il Centro "Dino Ferrari" si interessa. In particolare, la Dott.ssa Antonia Ratti ha dato ulteriore impulso agli studi di ribonomica aprendo nuovi scenari per la comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie neurodegenerative (memoria-ippocampo-demenza e malattie del motoneurone) e ha definito ulteriormente il ruolo patogenetico di angiogenina, TDP43, FUS/TLS, Optineurina nei pazienti affetti da SLA sporadica. Particolare rilievo è stato dato allo studio di pazienti con SLA e Demenza Fronto-Temporale: dal Settembre 2011 è stato formulato un importante 100

101 impiego di ricerca per la definizione delle espansioni del gene C9orf72 nella popolazione dei pazienti affetti da SLA, Demenza Fronto-Temporale e svariata patologia extrapiramidale. La Dott.ssa Lidia Cova ha concluso la caratterizzazione di cellule staminali neurali endogene in un modello di ratto iperteso che spontaneamente sviluppa ictus accanto alla iniziale definizione dell uso di traccianti per monitorare le cellule dopo trapianto utilizzando RM 7 Tesla. La Dott.ssa Jenny Sassone ha continuato la caratterizzazione di tessuti periferici di pazienti affetti da Malattia di Huntington definendo ulteriormente la patologia mitocondriale e le basi molecolari della neurotossicità glutammatergica in un modello cellulare di PARK-2. Il Dott. Nicola Ticozzi ha completato una serie di lavori di estremo interesse quali lo sviluppo ulteriore del progetto di Exome Sequencing supportato da Arisla EXOMEFALS che è esitato nelal scoperta di TUBA4A e l avvio dello studio nei trios (ricerca di mutazioni de novo acquisendo, oltre il DNA del probando, anche il DNA dei genitori quando vioventi). Nel 2014 il Centro ha mantenuto la funzione direttiva nell ambito dell' European ALS Consortium (EALSC), organizzazione Europea dedicata allo sviluppo delle problematiche inerenti le malattie del motoneurone (il Prof. V. Silani ne è stato Chairman). Diversi Teaching Course sono stati organizzati nell ambito della European Academy of Neurology (EAN): il Prof. Silani è co-chairman del l EAN Subspeciality Scientific panel ALS and Frontotemporal Dementia.. Il Centro è inoltre rappresentato in diverse Commissioni della Regione Lombardia avendo attivamente partecipato alla elaborazione di diverse linee guida relative alla SLA, Malattia Neuromuscolari, Extrapiramidali e Demenza. Il Prof. Vincenzo Silani è parte all editorial Board di European Neurology, ALS e American Joural of Neurodegenerative Diseases. La migliore espressione dell attivita svolta dalla Sede Distaccata del Centro Dino Ferrari sta nell ulteriore consenso internazionale raggiunto nel 2014 anche per un rilevante numero di ricercatori (no. 4) che stanno svolgendo o hanno completato periodi formativi in qualificati Laboratori in Europa o nel Nord-America con cui il Centro Dino Ferrari ha scambi collaborativi di elevato livello. In particolare, la Dr. Isabella Fogh ha la responsabilità presso il King s College di Londra dell ulteriore completamento dell analisi relativa al GWA delle forme sporadiche di SLA, il Dott. Niccolò Mencacci si trova a Londra presso il Laboratorio diretto dal Prof. John Hardy per un PhD in Neurogenetica. La Dott.ssa Claudia Morelli ed il Dott. Nicola Ticozzi sono anche i primi due neurologi Italiani divenuti Fellows dell European Board of Neurology dopo avere sostenuto il relativo esame internazionale all ENS di Barcellona (2013). PRINCIPALI ARGOMENTI DI RICERCA: 1. CARATTERIZZAZIONE DEI LIVELLI CIRCOLANTI DI ADIPONECTINA IN PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIE NEURODEGENERATIVE Nel corso del 2014 sono stati analizzati mediante enzyme-linked immunosorbent assay kits (ELISA) 150 sieri così distribuiti: 38 donatori metabolicamente sani, 8 soggetti obesi, 46 pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), 6 pazienti affetti da Demenza Frontotemporale (FTD), 8 pazienti affetti da Malattia di Alzheimer (AD) e 46 pazienti con altre patologie neuronali (OND). Tutti i soggetti erano abbinati per età e sesso. E stato possibile confermare mediante questo studio alcuni dati di letteratura. I soggetti obesi hanno infatti mostrato un ridotto livello di adiponectina sierica mentre livelli statisticamente superiori a quelli dei controlli sono stati riscontrati nei pazienti affetti da AD. Nuovi risultati sono inoltre emersi da questa ricerca. In particolare, i pazienti affetti da FTD presentavano valori elevati di adiponectina sierica confermando la correlazione tra l aumento di questa adipochina e la demenza. Per quanto riguarda i pazienti affetti da SLA nella loro globalità, i 101

102 valori di adiponectina non risultavano diversi da quelli dei controlli sani o dei pazienti affetti da OND e nessuna correlazione veniva evidenziata con il peso corporeo ed i livelli di HDL/colesterolo. Suddividendo però i pazienti per sesso, emergeva un andamento opposto dei valori sierici. I livelli di adiponectina dei pazienti maschi risultavano statisticamente inferiori a quelli dei pazienti femmine e dei soggetti sani dello stesso sesso. Un andamento opposto si osservava per le pazienti SLA che mostravano livelli statisticamente più elevati sia rispetto alle donne controllo che agli uomini SLA. Questo dato, mai riportato in letteratura, merita di essere ulteriormente indagato in particolare alla luce di nuovi dati di letteratura che indicano una diversa sopravvivenza e progressione di malattia legata all adiposita sub-cutanea e correlata al sesso del paziente. FATTORI GETICI ASSOCIATI ALL ANGIOPATIA ILOID CEREBRALE 3. STUDIO DEI FATTORI GENETICI ASSOCIATI ALL ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRALE 2. STUDIO DEI FATTORI GENETICI ASSOCIATI ALL ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRALE. Sono stati collezionati complessivamente 20 casi di pazienti affetti da angiopatia amiloide cerebrale (CAA) secondo i criteri di Boston oltre a 13 controlli. Sono stati sottoposti a screening ematologico, MAP 24 ore, TAC e RMN encefalo con sequenze in GE, ad alcuni di essi hanno completato anche la valutazione NP. Tutti sono stati prelevati per eseguire il sequenziamento degli esoni dei geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi della malattia. UDIO DFATTORI GENETICI ASSOCIATI ALL ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRALE 3. CARATTERIZZAZIONE DELL ESPRESSIONE DI RNA NEGLI ESOSOMI DERIVATI DAL SANGUE PERIFERICO DEI PAZIENTI SLA Nel presente progetto ci si proponeva di analizzare il profilo dell RNA esosomiale nel siero di pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) rispetto a controlli comparabili per età. Nel corso dell anno l attiva collaborazione tra la clinica (Dip. Neurologia dell Ospedale S. Luca diretta dal Prof. Silani) e la Dr.ssa Cova del Laboratorio di Neuroscienze ha portato alla raccolta standardizzata di: 1. n 31 campioni di siero da pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) sporadica o legata a mutazioni specifiche, 2. n 18 campioni comparabili da soggetti sani 3. n 52 campioni di pazienti affetti da altre patologie del sistema nervoso centrale Tutti i prelievi di sangue effettuati vengono raccolti ed immediatamente processati per produrre nel più breve tempo possibile (1 ora al massimo) campioni omogenei (1 ml di siero per ogni paziente) direttamente congelati e mantenuti a -80 C fino al momento dell utilizzo. Per l estrazione degli esosomi si è preferito ricorrere a un kit commerciale specifico per garantire l uniformita dei campioni ottenuti. Nel corso di quest anno si è preceduto inoltre alla validazione degli esosomi ottenuti (indispensabile per i successivi saggi di espressione di mrna e microrna) tramite: a) analisi al citofluorimetro (FACS) accoppiate a microbiglie per visualizzare gli esosomi le cui ridotte dimensioni impedisconono una visualizzazione diretta); b) kit ELISA specifici per il marcatore cd63 (selettivamente espresso dagli esosomi); c) analisi in microscopia elettronica (sia su siero che su surnatante ottenuto da fibroblasti in coltura di pazienti SLA): d) estrazione di mrna e anche di piccole molecole come i microrna per l analisi in RealTime di trascritti comuni (housekeeping) e/o riconosciuti come altamente espressi negli esosomi sierici; e) analisi in Risonanza Magnetica (NMR) dei campioni di esosomi. Le procedure di ottimizzazione delle metodiche complesse elencate ha richiesto tutto un notevole sforzo personale, la collaborazione attiva di altri collaboratori del Laboratorio (in 102

103 particolare la Dr.ssa Patrizia Bossolasco), dalla clinica (in particolare del Dr. Alberto Doretti e della Sig.ra Patrizia Nelli), con il Politecnico di Milano e di Zurigo (ETH) e ha reso necessaria l attivazione di una consulenza specifica con il Consorzio MIA dell Universita Milano Bicocca diretto dal Dr Antonello Villa. Complessivamente l insieme dei dati raccolti ha confermato che gli esosomi prodotti da siero di pazienti possiedono un elevato standard di purezza e concentrazione assolutamente paragonabili a quelli presentati nelle pubblicazioni di letteratura e costituiscono quindi una ottima base di partenza per le successive analisi. L analisi in NMR ha anche evidenziato dati interessanti e peculiarità specifiche dei campioni SLA da sviluppare ed approfondire. 4. DETERMINAZIONE LIQUORALE DEI LIVELLI LIQUORALI DI TDP-43 E FUS IN PAZIENTI AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA Lo studio si inserisce nell ambito della ricerca tesa a definire possibili marcatori biologici liquorali della Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA). L angiogenina è stata dosata a livello liquorale in 80 pazienti affetti da malattia del motoneurone (inclusi due casi sporadici mutati nel gene TARDBP e un caso familiare portatore di mutazione nel gene SOD1) e 81 soggetti di controllo. Non sono state evidenziate differenze significative tra i pazienti SLA e i soggetti di controllo ma, dato interessante, nei pazienti SLA le concentrazioni liquorali di angiogenina non correlavano con sesso ed età, contrariamente a quanto osservato nei controlli. Infatti, in questo gruppo abbiamo rilevato valori liquorali di angiogenina maggiori nei soggetti di sesso maschile rispetto a quelli di sesso femminile ed una correlazione positiva con l eta. Tali risultati potrebbero indicare un alterata espressione di angiogenina nei pazienti SLA rispetto ai controlli. Non è stata trovata alcuna differenza tra i pazienti con malattia ad esordio bulbare o spinale, né una correlazione tra i valori di angiogenina liquorali e la durata di malattia. I pazienti affetti da SLA e decadimento cognitivo tipo demenza fronto-temporale (SLA-FTD) presentavano invece valori di angiogenina liquorale più elevati rispetto ai pazienti SLA senza decadimento cognitivo. Interessante è anche il riscontro, nel gruppo di controllo, di valori liquorali di angiogenina significativamente più elevati nei soggetti affetti da FTD rispetto ai controlli affetti da altre malattie. Questi dati suggeriscono un possibile ruolo di angiogenina nella FTD. Nel corso del 2012 si è proceduto all'analisi del gene ANG codificante per angiogenina nei pazienti con SLA-FTD (7 soggetti) e nei pazienti affetti da FTD (5 soggetti). Nessuno di loro è risultato mutato per ANG. Questo lavoro fornisce dati interessanti nell ambito della ricerca di biomarcatori liquorali nella SLA e ha permesso di fare esperienza nell utilizzo della metodica ELISA su liquor nel Laboratorio di Neuroscienze, fungendo da propedeutica alla determinazione mediante ELISA di TDP-43. Si è proceduto al dosaggio di TDP-43 ricombinante mediante colorazione Comassie, al fine di determinare le concentrazioni standard della proteina da utilizzare per l ELISA. Tuttavia, riteniamo che i kit ELISA per la determinazione, rispettivamente, di TDP- 43 full-length e TDP-43 fosforilata, recentemente messi in commercio, rappresentino un alternativa che potrebbe facilitare dal punto di vista metodologico lo studio. Non esistendo alcun dato in proposito in letteratura, auspichiamo di procedere anche alla determinazione liquorale di FUS a livello liquorale, una volta conclusi i dosaggi di TDP CELLULE STAMINALI UMANE: USO DI FLUOROCROMI E/O NANOPARTICELLE MAGNETICHE Nel corso dell anno di ricerca 2014, si è proceduto nella marcatura genetica delle cellule staminali derivate da liquido amniotico (hafcs) provenienti da eccedenze diagnostiche 103

104 derivanti dalla Citogenetica di Istituto, previo consenso informato, in collaborazione con l Universita degli Studi di Milano (Prof Lucignani-Dr.ssa Ottobrini, Dipartimento di Fisiopatologia Medico-chirurgica e dei Trapianti). Le cellule son state infettate con un costrutto retrovirale esprimente la Luciferasi come gene reporter. L attivita della Luciferasi e la vitalità cellulare sono state monitorate immediatamente dopo trasfezione e nel corso dell espansione successiva (da giorno 3 al 21giorno di coltura). L infezione è stata ottimizzata utilizzando diversi tempi di incubazione (4, 8 e 16 ore) e due reagenti carriers (Polybrene e Polilisina). L attivita luciferasica è stata verificata per ogni tempistica e condizione utilizzando un apposito test biochimico che ha evidenziato come solo l utilizzo di Polisina porti a una riduzione del segnale nel tempo. La vitalità cellulare al FACS non ha invece mostrato differenze significative né tra cellule infettate e controllo né tra le diverse condizioni e carriers. Analogamente, l analisi al microscopio confocale post infezione ha evidenziato come nel tempo il vettore resti integrato nelle cellule con un alta efficienza di espressione ed infezione ai diversi passaggi in coltura. La strategia tramite inserzione del gene luciferasi permette di quantificare la concentrazione della proteina reporter prodotta o della sua attività enzimatica in vitro ed in vivo. In particolare, il lentivirus codificante il gene Luciferasi è stato utilizzato per la marcatura genetica bioluminescente sfruttandone le proprietà di alta attività specifica e mancanza di attività endogena (basso background). L analisi è stata effettuata tramite un apposito strumento (IVIS Spectrum/CT device) nelle cellule in vivo (utilizzando diverse concentrazioni cellulari) dimostrando una diretta correlazione tra la quantita di cellule marcate e l intensita del flusso fotonico. Inoltre è stata testata l attivita luciferasica direttamente nell animale (topo nudo) in diversi distretti tissutali (iniezione sottocutanea, intramuscolare e intracerebrale) tramite imaging bioluminescente (BLI) sia in 2D che in 3D. Le analisi delle immagine ottenute in 2D ha permesso di evidenziare come l intensita del segnale bioluminescente fosse ridotta per i siti di iniezione più profondi (intramuscolo e intracranico). L acquisizione del segnale ripetuta nel tempo tramite BLI combinata alla Tomografia computerizzata ha permesso inoltre di dimostrare la corretta localizzazione del segnale bioluminescente in relazione alle coordinate sterotassiche di iniezione con una persistenza del segnale nel tempo. L insieme dei dati prodotti verra utilizzato per l ottimizzazione del modello sperimentale animale murino con lesione da neurotossina 6 idrossidopamina (6-OHDA) e imaging delle staminali impiantate. Il presente progetto ha permesso di raggiungere quindi molteplici risultati grazie alla cooperazione dei vari gruppi partecipanti, sia intra- che inter- Istituto. I risultati ottenuti sono stati utilizzati per la preparazione di n 1 presentazioni poster al: CONGRESSO CONGIUNTO AINPeNC AIRIC e Corso di Aggiornamento NEUROPATOLOGIA E NEUROIMAGING organizzato dall Istituto Auxologico Italiano a Verbania il 5-7 Giugno COMPRENSIONE IL CONTINUUM BIOLOGICO TRA SLA E FTD: VERSO UN PIÙ EFFICACE MODELLO ASSISTENZIALE PER I PAZIENTI Nel corso dell anno 2014 sono proseguiti gli studi genetici sui pazienti affetti da SLA familiare e sporadica reclutati presso l Istituto Auxologico Italiano. In particolare, è stato effettuato uno studio caso-controllo, exome-wide di varianti rare, che ha permesso di identificare nuove mutazioni patogenetiche associate alla SLA nel gene TUBA4A, codificante la subunita 4A della tubulina alfa e coinvolto nell integrita del citoscheletro neuronale 104

105 7. SICUREZZA ED EFFICACIA DELL INIBIZIONE DI SOD1 DA PIRIMETAMINA NELLA SLA FAMILIARE Tra il gennaio 2013 ed il gennaio 2014 sono stati arruolati sette pazienti. Di questi, due hanno completato lo studio, uno ha ritirato il proprio consenso per motivi personali dopo avere eseguito le prime due visite (in ottava settimana), uno ha interrotto lo sperimentazione per aggravamento clinico con impossibilità a raggiungere l'istituto per le valutazioni, tre proseguono regolarmente lo studio. Nessun paziente al momento ha riportato reazioni avverse gravi derivanti dalla terapia sperimentale. Una paziente ha presentato una reazione avversa di lieve entità, che non ha comportato una modificazione dell'iter sperimentale, mentre un'altra paziente ha riportato una reazione avversa di moderata entità, attesa, con necessità di ridurre la posologia della pirimetamina somministrata. Sono state regolarmente effettuate le valutazioni cliniche, strumentali e laboratoristiche, come previsto dal protocollo. Si è in particolare provveduto al prelievo ed alla conservazione del materiale biologico (plasma, linfociti, globuli rossi e liquor), come da protocollo. 8. ANALISI DI GLUK2 QUALE NUOVO TARGET TERAPEUTICO PER I PARKINSONISMI GIOVANILI AUTOSOMICI RECESSIVI (ARJP) NEI NEURONI PRIMARI, NEI MODELLI ANIMALI DI PARK2 E NELLE CELLULE IPS DA PAZIENTI PARK2 Nel corso dell anno 2014 abbiamo valutato, come da programma, i livelli delle subunità dei recettori Glutammato nei topi parkin-q311x. Abbiamo osservato come l unica ad aumentare significativamente sia la subunità Gluk2 dei recettori Kainato. Nessuna variazione nei recettori NMDA, una diminuzione in AMPAR1, probabilmente dovuto ad un meccanismo compensatorio. Abbiamo valutato le correnti KAR nel modello animale, utilizzando slices di VentralTegumentalArea (VTA), area ricca in neuroni dopaminergici. La visualizzazione dei neuroni di interesse è stata possibile grazie all incrocio del nostro modello parkin-q311x con il topo TH-GFP, che permette con l espressione del fluoroforo GFP di marcare le cellule TH positive (dopaminergiche), visibili al semplice miscroscopio. L analisi delle correnti è stata possibile grazie al trattamento delle fettine con Kainato (agonista) e NS102 (antagonista selettivo dei recettori KAR), in modo da riuscire a visualizzare la componente kainato, come corrente NS102 sensibile. Da questi esperimenti è stato possibile osservare come la componente Kainato nel modello PARK2 sia superiore rispetto al controllo. Questo ci dimostra come una perdita di funzione di parkin induca non solo un accumulo del recettore Gluk2, ma anche che tale accumulo corrisponde con un incremento delle correnti KAR mediate. Per la valutazione dell effetto eccitotossico in modelli PARK2 mutati, abbiamo valutato due noti marker di eccitotossicità (Calcineurina A e spectrin) in lisati di Substantia Nigra del modello animale parkin-q311x, osservando un aumento di entrambi i livelli. 9. VALIDAZIONE ITALIANA DI UNO STRUMENTO DI SCREENING COGNITIVO (EDINBURGH COGNITIVE AND BEHAVIOURAL ALS SCREEN ECAS) IN PAZIENTI AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA Il presente studio è stato volto a validare, su una popolazione italiana, lo strumento di screening cognitivo ECAS, al fine di disporre di una misura sensibile alle alterazioni cognitive presenti nella SLA e somministrabile anche in presenza di limitazioni nelle capacità verbo-motorie. Come ulteriori sotto-obiettivi, in questo ambito, risultano: 105

106 - L indagine delle componenti di validita concorrente e di costrutto dell ECAS, condotta mediante l inclusione, nel protocollo di assessment, di prove testali standardizzate e tradizionalmente impiegate nell indagine del funzionamento cognitivo globale e dell efficienza frontale sia nella SLA, che in altre patologie. - La messa a punto e somministrazione di un questionario di valutazione dell usabilita percepita dai partecipanti rispetto allo strumento ECAS, utile ai fini di eventuali future revisioni dello stesso. - L integrazione dello screening cognitivo e comportamentale con ulteriori dati concernenti il profilo clinico-neuropsicologico (anosognosia e anosodiaforia), mediante l inclusione di domande concernenti il livello di consapevolezza, da parte dei pazienti, delle eventuali alterazioni cognitive e comportamentali presenti. Ulteriore obiettivo è rappresentato dall indagine della correlazione presente tra gli indici cognitivi rilevati mediante le prove testali ed i dati di genetica e di laboratorio, che consentirà di identificare peculiari pattern genotipo-fenotipo, utili al fine di meglio caratterizzare i profili clinici presenti nella patologia e, pertanto, fornire ulteriori evidenze di natura diagnostica e prognostica. A conclusione dello studio, la rilevazione delle prestazioni ottenute alle prove neuropsicologiche, in particolar modo concernenti le abilità fronto-esecutive, rende possibile ricavare indici relativi all integrita cognitiva dei pazienti e quindi di valutare la capacità di assumere decisioni relative a questioni finanziarie, ai trattamenti invasivi proposti nel corso della malattia e alle decisioni di fine vita nei pazienti affetti da SLA negli stadi più avanzati di malattia. 10. IMPORTANZA DELL ECTASIA ARTERIOSA DEL CIRCOLO POSTERIORE NELL EZIOPATOGENESI DELLO STROKE Sono stati arruolati nello studio 160 pazienti della Stroke Unit, così classificati: 27 pazienti con stroke vertebro-basilare 133 pazienti con stroke in altro territorio vascolare L eziologia degli eventi ischemici è stata stabilita utilizzando la scala TOAST. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a TC encefalo e/o RMN encefalo; 20 pazienti sono stati sottoposti ad AngioTC del circolo intracranico. Sono state ottenute misure del diametro vertebrale per tutti i 160 pazienti, su immagini bidimensionali degli esami EDTSA eseguiti con Ecografo GE Vivid 7 ed EsaoteMyLabClassC. L analisi dei dati ha dimostrato che l ipoplasia vertebrale sinistra valutata con EDTSA è correlata in modo statisticamente significativo con lo stroke del circolo posteriore. L analisi successiva confronterà i dati attuali con quelli provenienti dalle immagini neuroradiologiche e si concentrerà sulla correlazione eventuale fra anatomia sfavorevole e sindrome metabolica. 11. IL METABOLISMO MITOCONDRIALE NEI FIBROBLASTI DI PAZIENTI AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA Il presente progetto si propone di studiare l attivita mitocondriale in modelli cellulari di malattia ottenuti direttamente da paziente con mutazioni in geni coinvolti nella regolazione degli RNA. Nello specifico verranno studiati colture primarie di fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nei geni TARDBP, FUS e C9ORF72. In tali modelli cellulari di malattia in cui l espressione dei mutanti TDP-43, FUS e C9ORF72 è a livelli fisiologici e non indotta, valuteremo e confermeremo se e come il metabolismo energetico e l attivita mitocondriale sono alterati e se tali alterazioni sono specifiche per TDP-43 o comuni anche agli altri geni e ai casi sporadici senza mutazioni. Obiettivo secondario sarà quello di capire il meccanismo molecolare attraverso cui si esplica tale effetto, ovvero se una disregolazione a vari livelli del 106

107 metabolismo degli RNA mediata dai diversi mutanti può influenzare indirettamente anche la funzionalità mitocondriale oppure se le proteine mutanti direttamente agiscono e si localizzano nel mitocondrio, come recentemente suggerito in letteratura da dati sperimentali preliminari. Nel corso del primo anno di progetto abbiamo studiato e caratterizzato l attivita mitocondriale in fibroblasti derivanti da pazienti SLA con mutazioni nei geni TARDBP (n=4) e C9ORF72 (n=4) rispetto a fibroblasti di individui sani di controllo (banca Telethon, n=4). In particolare abbiamo determinato il potenziale di membrana mitocondriale, i livelli di ATP e la massa. Tutti gli esperimenti sono stai eseguiti mantenendo per 48h le cellule in carenza di glucosio e in presenza di galattosio per favorire un metabolismo ossidativo rispetto alla glicolisi e cercare di mimare così un metabolismo simile a quello post-mitotico neuronale. I nostri risultati indicano alterazioni nell attivita mitocondriale in entrambi i gruppi di fibroblasti SLA in modo mutazione-dipendente. Nei fibroblasti TARDBP, infatti, si osserva una riduzione del potenziale di membrana mitocondriale, mentre nei fibroblasti C9ORF72 si osserva una iperpolarizzazione accompagnata da aumentati livelli di ATP. Il dosaggio delle attività dei singoli complessi della catena respiratoria non indica, però, difetti di attività enzimatica in entrambi i casi. Abbiamo studiato la morfologia mitocondriale, quale potenziale indice di funzionalità mitocondriale, mediante transfezione e visualizzazione dei mitocondri con il plasmide dsmitored e analisi dei parametri di form factor (FF) e aspect ratio (AR) con software di analisi ImageJ e di plug-in specifici. La morfologia mitocondriale appare alterata in modo significativo nei fibroblasti TARDB-mutati con una evidente frammentazione del network mitocondriale rispetto ai fibrobalsti di controllo. L analisi dei fattori proteici coinvolti nei processi di fusione (MFN1) e fissione (FIS1) mediante WB conferma che la dinamica mitocondriale è alterata nei fibroblasti SLA con mutazioni nel gene TARDBP. 12. SCREENING MUTAZIONALE DEI GENI TARDBP E FUS IN PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIA DI PARKINSON E PARKINSONISMI Il presente progetto ha come obiettivo lo screening mutazionale dei geni TARDBP e FUS in una coorte di pazienti affetti da Malattia di Parkinson (PD) e da Parkinsonismi primari, tra cui degenerazione cortico-basale (CBD) e paralisi sopranucleare progressiva (PSP). Diverse evidenze cliniche suggeriscono che mutazioni di tali geni, già associati alle forme familiari e sporadiche di Sclerosi Laterale Amiotrofica, possono essere implicati anche nel PD e in disturbi del movimento correlati. In questo primo anno abbiamo analizzato il gene TARDBP una coorte costituita da 782 pazienti PD (212 casi familiari e 570 casi sporadici) e da 157 Parkinsonismi primari (CBD e PSP). L analisi molecolare è stata condotta sull esone 6 del gene TARDBP, mediante sequenziamento diretto di Sanger sui campioni di DNA estratti da sangue periferico. Sebbene il gene TARDBP sia formato da 5 esoni codificanti, nel nostro studio abbiamo deciso di analizzare l esone 6 codificante per il 60% della proteina TDP-43, perché in base ai dati epidemiologici rappresenta un hot spot mutazionale con oltre 50 varianti missenso finora identificate nella SLA. La nostra indagine ha permesso di rilevare quattro mutazioni missenso (p.gly294val; p.gly295ser; p.asn267ser, p.ser393leu) in sei pazienti. Quattro di questi individui sono affetti da PD, mentre gli altri due pazienti sono, rispettivamente, un caso di degenerazione cortico-basale e un caso di paralisi sopranucleare progressiva. Le quattro varianti da noi identificate sono state in precedenza riportate come mutazioni patogenetiche in pazienti SLA (http://alsod.iop.kcl.ac.uk/) e risultano assenti in oltre controlli di dataset pubblici (6503 individui di NHLBI Exome Sequencing Project, 1092 individui di 1000 Genome Project). In particolare, la variante TARDBP p.asn267ser sembra essere associata ad un fenotipo clinico variabile, essendo stata da noi identificata sia in due pazienti 107

108 con Parkinsonismo sia in un paziente con PD tipico. Studi in silico e funzionali condotti suggeriscono che tale variante possa determinare la formazione di nuovo sito di fosforilazione con possibili effetti sui livelli proteici di TDP-43 (Borroni et al, Hum Mutat. 2009). Anche la variante p.gly295ser, che determina la sostituzione di un amminoacido del dominio C- terminale con una serina, potrebbe aumentare lo stato di fosforilazione della proteina. Nel nostro studio non abbiamo invece identificato la mutazione p.ala382thr, che per un effetto fondatore era stata precedentemente identificata in oltre il 30% dei casi SLA e in una significativa porzione (~2.5%) di pazienti PD sporadici nella popolazione sarda (Quadri et al, Neurogenetics 2011). I risultati preliminari del nostro studio sembrano suggerire un ruolo patogenetico delle mutazioni di TARDBP anche in altri disordini neurodegenerativi diversi da SLA/FTD. 14. IDENTIFICATION OF DE NOVO MUTATIONS IN AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS USING A TRIOBASED EXOME SEQUENCING APPROACH Nel corso dell anno 2014 sono state validate le mutazioni de novo evidenziate mediante exome sequencing nei trio selezionati (costituiti da un individuo affetto da SLA e dai suoi genitori non affetti). Gli esoni contenenti le mutazioni de novo sono stati amplificati mediante PCR utilizzando primer customizzati e successivamente sequenziati mediante Sanger sequencing. La frequenza mutazionale dei geni candidati è stata successivamente valutata in due coorti costituite da 600 pazienti con SLA familiare e 200 pazienti con SLA sporadica. 15. IDENTIFICATION OF RISK VARIATS ASSOCIATED WITH SUSCEPTIBILITYTO SPORADIC AMYOTROPHIC LATERAL SCEROSIS USING AN EXOME SEQUENCINGAPPROACH La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa a prognosi infausta causata dalla perdita selettiva dei motoneuroni. Circa il 10% dei casi di SLA sono familiari (FALS) e gli studi genetici hanno permesso l individuazione delle mutazioni causative nella maggior parte di essi. Al contrario, l'eziologia della SLA sporadica (SALS) è in gran parte sconosciuta, benché si ritenga che fattori genetici giochino un ruolo importante nel determinare la suscettibilità alla malattia. L'identificazione di tali fattori di rischio darebbe un enorme contributo alla comprensione attuale della patogenesi della SLA. In questo progetto ci proponiamo quindi di compiere uno studio caso-controllo di sequenziamento dell esoma (exome sequencing) al fine di identificare varianti rare associate alla suscettibilità per SALS, di validarle in una coorte indipendente di pazienti e di stabilirne il ruolo funzionale nella patogenesi della malattia. Il nostro studio è stato progettato per sfruttare al meglio il campionamento selettivo di pazienti SLA con esordio precoce, suggestivo per una forte componente genetica, e per adottare metodi complementari per l'analisi statistica, al fine di massimizzare le possibilità di successo. Obiettivi: Il progetto IrisALS è articolato su tre obiettivi principali: a) Selezione dalla nostra banca biologica di 500 campioni di DNA da pazienti SALS ad esordio precoce (< 40 anni ), omogenei dal punto di vista fenotipico e ben caratterizzati dal punto di vista clinico; exome sequencing dei campioni selezionati al fine di individuare polimorfismi (SNP) rari potenzialmente associati alla malattia. b) Conduzione di un analisi bioinformatica caso-controllo utilizzando diversi modelli statistici, al fine di ordinare gli SNP identificati sulla base della loro probabilità di contribuire alla patogenesi di SALS. Gli esomi di controllo saranno ottenuti dai database 1000Genomes project, NHLBI Exome Sequencing Project e da campioni già sequenziati nel nostro laboratorio. c) Validazione dei top ranking SNP tramite: 108

109 1) analisi in silico di 500 esomi FALS già sequenziati da noi e dai nostri collaboratori per valutare il loro possibile contributo alla patogenesi delle forme familiari di SLA; 2) confronto con i dati GWAS già generati dal nostro laboratorio, al fine di identificare SNP comuni; 3) genotipizzazione high-throughput dei 6000 top ranking SNP in una coorte aggiuntiva di SALS e controlli; 4) sequenziamento diretto dei geni contenenti i 20 top ranking SNP per identificare ulteriori varianti; 5) determinazione del ruolo patogenetico dei top ranking SNP. CENTRO SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA (SLA) Nell'anno 2014, circa 350 pazienti affetti da patologia motoneuronale (prevalentemente SLA) sono stati esaminati nel Centro SLA. Alla valutazione clinica sono state accostate diverse indagini ed iniziative terapeutiche: ricerca di mutazioni per i geni SOD1, angiogenina, SETX, VAPB, TDP43, FUS/TLS, OPT, VCP, C9orf72, Profilina1, Malattia di Kennedy, SMN in parte presso il Laboratorio di Neuroscienze ed in parte in collaborazione con l'istituto C. Besta di Milano (Dott.ssa Cinzia Gellera). Tali indagini hanno permesso di identificare mutazioni in pazienti apparentemente affetti da SLA sporadica (TARDP per TDP-43, FUS/TLS, C9orf72 in particolare). Oggi il Centro offre la diagnostica molecolare delle principali patologie motoneuronali; sviluppo di nuovi parametri neurofisiologici per definizione del numero residuo di Unità Motorie (MUNE) ed analisi neurofisiologica della funzionalità diaframmatici per porre indicazione alla NIV; analisi delle caratteristiche nutrizionali con studio della PEG, BMI, etc, in collaborazione con l'unità di Endocrinologia dell'irccs Istituto Auxologico Italiano; valutazione neuropsicologica longitudinale del paziente affetto da SLA mediante valutazione seriata per evidenziare specifici deficit neuropsicologici; particolare attenzione al coinvolgimento fronto-temporale anche con tecniche di eye-tracking e sviluppo di BCI (studio ECAS); partecipazione a nuovi trial terapeutici (Pirimetamina nella SLA Familiare SOD1 mutata). Il Centro "Dino Ferrari" ha partecipato a diverse iniziative nazionali ed internazionali per l'ottimizzazione delle cure palliative, la definizione dei costi della malattia, l' educazione dei medici e paramedici in stretto rapporto con l'aisla (Associazione Italiana Sclerosi Laterale Amiotrofica), la definizione dei criteri di invalidità in collaborazione con la Regione Lombardia. Il Centro "Dino Ferrari" è implicato nel Gruppo di Studio Malattie del Motoneurone della Società Italiana di Neurologia - SIN) e nell European ALS Consortium. Il Prof. Silani è divenuto membro del Website Management Committee della World Federation of Neurology in rapporto alla ALS/MND. Nell' ambito dell ALS European Consortium il Prof. Silani ha tenuto vari Teaching Courses nell ambito dell ENS ed EFNS. Nell' ambito della nascente EAN il Prof. V. Silani è stato nominato referente per il gruppo Malattie del Motoneurone e Demenza Frontotemporale con il Prof. Albert Ludolph. 109

110 CENTRO DISTURBI COGNITIVI Nel corso del 2014 è stato progressivamente creato un centro di riferimento con particolare attenzione alle principali patologie associate a decadimento mentale e disturbi cognitivi. Particolare attenzione è stata dedicata alle Demenza Frontotemporale (FTD) curando, in particolare, le interazioni specifiche con la SLA. L Interazione con l Associazione Italiana FTD è stata particolarmente fruttuosa. CENTRO MALATTIE EXTRAPIRAMIDALI Nel corso dell'anno 2014, oltre 300 nuovi pazienti circa affetti da diversi disordini extrapiramidali del movimento (Morbo di Parkinson, Paralisi Sopranucleare Progressiva, Atrofia Multisistemica e Degenerazione Cortico-Basale, Corea di Huntington, ect.) sono stati esaminati e trattati presso il Centro Disturbi del Movimento che ha eseguito circa 900 visite ambulatoriali. È stata creata una stretta collaborazione con l'associazione Parkinson Milano di cui il Prof. Silani fa parte del Comitato Scientifico creando un interscambio scientifico e di pazienti. È stata creata una èquipe multispecialistica per la presa in carico del paziente. Il Centro è riconosciuto nell'ambito del NECTAR (Network for European CNS Transplantation and Regeneration) dedicato alle malattie extrapiramidali. Maggior impeto è stato dato inoltre alla creazione di un Centro dedicato alla Malattia di Huntington con creazione di una equipe plurispecialistica formata da neurologi, psichiatri, neuropsicologi e fisiatri nell'intento di fornire un approccio interdisciplinare al paziente, garantendo così un supporto ed un riferimento costante nel tempo che è stato esteso anche ai familiari. Nell'ambito della Malattia di Huntington l'assenza di una cura risolutiva della malattia comporta un particolare impatto emotivo nel soggetto che ancora asintomatico decide di testarsi per la mutazione. Ciò impone un continuo supporto psicologico al paziente durante tutto il lungo processo che porta alla diagnosi pre-clinica. Per questo è stato sviluppato ed applicato un protocollo di test predittivo nella Malattia di Huntington secondo le linee guida dell'international Huntington Association e della Federazione Mondiale di Neurologia. Sono state seguite dodici famiglie affette da Malattia di Huntington e seguiti sei pazienti nell'iter del test predittivo. Dal 2005 il Centro è in grado di formulare diagnosi molecolare di Malattia di Huntington. Alla valutazione clinica sono state accostate diverse indagini ed iniziative terapeutiche quali lo studio del sonno nei pazienti affetti da M. di Huntington in collaborazione con il Centro del Sonno (Dott.ssa Carolina Lombardi). Particolare attenzione è oggi dedicata alla cura della disfagia, principale causa di morte dei pazienti accanto alle complicanze polmonari. Il Dott. Andrea Ciammola ha dato particolare impulso a questa iniziativa unitamente alla équipe multidisciplinare. CENTRO DISTURBI COGNITIVI Nell'anno 2014 vi è stato un ulteriore incremento di pazienti rivoltisi al nostro centro per una valutazione diagnostica di tipo neuropsicologico; infatti sono state effettuate oltre prestazioni neuropsicologiche e psicodiagnostiche per pazienti degenti in regime di ricovero ordinario o in Day Hospital, nonché 900 colloqui psicologici clinici in pazienti affetti da molteplici forme di coinvolgimento cognitivo a partire dal Mild Cognitive Impairment (MCI), Malattia di Alzheimer, Demenza Fronto-Temporale, Demenza a Corpi di Lewy, Parkinson s Demenza, Demenza di Huntington, Paralisi Sopranucleare Progressiva, Degenerazione Cortico-Basale ecc. Al già presente ambulatorio neuropsicologico convenzionato S.S.N. è stato aggiunto un nuovo ambulatorio di Valutazione Multidimensionale dei Disturbi Cognitivi (VMD) condotto congiuntamente da neurologo/neuropsicologo nell ottica di fornire al paziente affetto da patologia cognitiva un approccio multidisciplinare che tenga conto delle molteplici problematiche che spesso ne caratterizzano il decorso clinico. Particolare 110

111 attenzione è stata posta alla valutazione neuropsicologica longitudinale dei pazienti affetti da patologia motoneuronale (SLA, PLS) esaminati nel Centro SLA. Sono stati effettuati, in collaborazione con altri presidi ospedalieri quali l Ospedale S. Anna di Como ed il Centro UVA di Bussolengo a Verona, studi sugli aspetti cognitivi, psico-emotivi e di personalità nella Sclerosi Multipla, nella SLA, nelle cefalee e nella Malattia di Parkinson. Si sono inoltre organizzati diversi eventi formativi ECM in merito all inquadramento dei disturbi cognitivi, agli aspetti di diagnosi differenziale e gestione dei disturbi psico-emotivi delle malattie neurodegenerative. Particolare attenzione ha richiesto la messa a punto, con il Centro dedicato alla Malattia di Huntington, di un protocollo di test predittivo per la malattia che ha visto nel supporto psicologico fornito ai pazienti, ai loro familiari ed ai soggetti asintomatici che si sottopongono al test, un ruolo fondamentale. Sempre più spazio è stato dato al caregiver nell ascolto delle problematiche di gestione quotidiana della patologia cognitiva dei loro congiunti allo scopo di migliorare la qualità diagnostica, clinica ed assistenziale fornita a questa tipologia di pazienti. La consulenza del Centro Disturbi Cognitivi è stata offerta anche al CIERRECI, nuova struttura dell IRCCS Istituto Auxologico Italiano per lo studio dell invecchiamento. E in fase di considerazione l apertura di un Centro Disturbi Cognitivi con l approvazione della Regione Lombardia. CENTRO DI MEDICINA DEL SONNO E continuata nel corso del 2014 l attivita del Centro di Medicina del Sonno presso l IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Ospedale San Luca, diretto dal Prof. G.F. Parati e dal Prof. V. Silani e coordinato dalla dott.ssa Lombardi. Nello 2014 sono state eseguite circa oltre 700 visite ambulatoriali e polisonnografie portatili, 150 video polisonnografie in laboratorio di medicina del sonno, 50 monitoraggi polisonnografici prolungati (24 ore) e 10 actigrafie. Le patologie osservate nel centro, vista anche l ispirazione volutamente multidisciplinare, riguardano ad ampio spettro le malattie cardiovascolari associate a disturbi respiratori durante il sonno (ipertensione arteriosa, scompenso cardiaco, stroke) e tutte le patologie neurologiche coinvolgenti il sonno, comprendendo quindi i disturbi del respiro in corso di sonno (Sindrome delle Apnee Ostruttive nel Sonno OSAS -, Sindrome delle Apnee Centrali, Ipoventilazione Centrale, alterazioni del pattern ventilatorio nelle patologie neuromuscolari), le ipersonnie (narcolessia, ipersonnie secondarie a malattie neurodegenerative), le parasonnie REM e NREM (disturbo comportamentale della fase REM, sonnambulismo, bruxismo ecc), le epilessie ad estrinsecazione prevalentemente notturna (Nocturnal Frontal Lobe Epilepsy) i disturbi del movimento in corso di sonno (Sindrome delle Gambe senza Risposo) e tutte le forme di insonnia. Oltre alle attività assistenziali, il Centro cura un ampia sfera di ricerca. STROKE UNIT Nel 2014 l attivita della Stroke Unit a direzione neurologica si è ulteriormente consolidata con ottimizzazione della moderna struttura che offre 6 letti di cui 4 completamente monitorizzati con possibilità di inquadramento del paziente affetto da evento cerebrovascolare acuto. L attivita direttiva della Dott.ssa Laura Adobbati, coordinatrice, è stata particolarmente efficace, avendo portato gli standards dell attivita della Stroke Unit a livello competitivo sia dal punto di vista medico che organizzativo. Il paziente che accede al Pronto Soccorso in tempo utile viene rapidamente inquadrato e può essere sottoposto nei casi indicati a trombolisi intravenosa, intrarteriosa o posizionamento di stent in rapida sequenza anche per la attiva collaborazione con la U.O. di Neuroradiologia e Neurochirurgia dell IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore di Milano. L angiografia diagnostica classica viene eseguita nella sala angiografica dell Istituto Auxologico Italiano come il posizionamento di stents extracranici 111

112 ed una serie di procedure è stata conclusa con successo: 15 trombolisi intravenose sono state eseguite nel 2014 con successo e senza complicanze. Un numero rilevante di trombolisi intrarteriose sono state completate con successo e senza rilevanti effetti collaterali. La stretta collaborazione con la UO di Cardiologia diretta dal prof. Gianfranco Parati garantisce un attento monitoraggio cardiologico con una ottimizzazione del monitoraggio clinico per la migliore impostazione terapeutica e lo studio del sonno è stato completato con la collaborazione del Centro del Sonno (dott.ssa Carolina Lombardi) e della consulenza pneumologica (Dott. Paolo Banfi ed èquipe). Una stretta collaborazione è in corso con l U.O.di Neurochirurgia della Fondazione Ospedale Maggiore di Milano (Consulente Dott. Mario Locatelli) e con la U.O. di Neuroradiologia del medesimo Istituto anche per lo sviluppo della RM 3 Tesla acquisita dell Istituzione. Il percorso del paziente post-ictus è assicurato da due U.O. di Riabilitazione nella Istituzione. Oltre all allestimento del database, diversi studi sono stati impostati tra i quali quello del sonno e delle apnee ostruttive in stretta relazione con l evento ischemico e la ricerca genetica nelle forme familiari. In stretta collaborazione con le altre Stroke Unit di Milano e con la Regione Lombardia, la Stroke Unit collabora a diversi studi programmatici regionali offrendo la propria disponibilità e competenza. Particolare attenzione è rivolta alla patologia cerebrovascolare rare per mitocondriopatie, per esempio,che vengono attivamente studiate con esecuzione di biopsie muscolari e ricerca di mutazioni in collaborazione con il Centro Dino Ferrari dell IRCCS Ospedale Maggiore di Milano. Le potenzialità diagnostiche e d intervento della Stroke Unit in acuto sono ad ora ottimizzate dalla pronta disponibilità di una RM 1.5 Tesla ed, ora, di una RM 3 Tesla per cui è stata programmata un attivita di ricerca volta ulteriormente ad ottimizzare la diagnosi precoce dell evento ischemico nella prospettiva della più adeguata terapia. PRODUZIONE SCIENTIFICA 2014 Pubblicazioni su Riviste Internazionali Indicizzate 1. Rossi G., Bastone A., Piccolil E., Morbin M., Mazzoleni G., Fugnanesi V., Beeq M., Del favero E., Cantù L., Motta S., Salsano E., Pareyson D., Erbetta A., Elia A., Silani V., Morelli C., Salmona M, Tagliavini F. Different mutations at V363MAPT codon are associated wtiyh atipica clinical phenotypes and sow unusual structural and functional features. Neurobiol Aging Feb; 35(2): doi: /j.neurobiolaging Epub 2013 Sep 7. [Epub ahead of print]; I.F Ticozzi N., Tiloca C., Calini D., Gagliardi S. Altieri A., Colombrita C., Cereda C., Ratti A., Pezzoli G., Borroni B., Goldwurm S., Padovani A., Silani V. C9ORF72 repeat expansions are restricted to the ALS-FTD spectrum. Neurobiol Aging Apr; 35(4):936.e13-7. doi: /j.neurobiolaging Epub 2013 Oct 2; I.F Lehnert S., Costa J., de Carvalho M., Kirby J., Kuzma M., Morelli C., Robbrecht W., Shaw P., Silani V., Steinacker P., Tumani H., Van Damme P., Ludolph A., Otto M. Multicenter quality control evaluation of different biomarker candidates for Amyotrophic Lateral Sclerosis. 112

113 Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener Sep; 15(5-6): doi: / Epub 2014 Feb 28. [Epub ahead of print] PMID: [PubMed - as supplied by publisher]; I.F Akimoto C., Volk A.E., van Blitterswijk M., Van den Broeck M., Leblond C.S., Lumbroso S., Camu W., Neitzel B., Onodera O., van Rheenen W., Pinto S., Weber M., Smith B., Proven M., Talbot K., Keagle P., Chesi A., Ratti A., van der Zee J., Alstermark H., Birve A., Calini D., Nordin A., Tradowsky D.C., Just W., Daoud H, Angerbauer S, Dejesus-Hernandez M, Konno T, Lloyd-Jani A, de Carvalho M, Mouzat K, Landers JE, Veldink JH, Silani V, Gitler AD, Shaw CE, Rouleau GA, van den Berg LH, Van Broeckhoven C, Rademakers R, Andersen PM, Kubisch C. A blinded international study on the reliability of genetic testing for GGGGCC-repeat expansions in C9orf72 reveals marked differences in results among 14 laboratories. J Med Gen. 2014; 51: doi: /jmedgenet Epub 2014 Apr 4; I.F Mitsumoto H., Brooks B.R., Silani V. Clinical trials in amyotrophic lateral sclerosis: why so many negative trials and how can trials be improved? Lancet Neurol. 201; 13: ; I.F van Doormaal P.T., Ticozzi N., Gellera C., Ratti A., Taroni F., Chiò A., Calvo A., Mora G., Restagno G., Traynor B.J., Birve A., Lemmens R., van Es M.A., Saris C.G., Blauw H.M., van Vught P.W., Groen E.J., Corrado L., Mazzini L., Del Bo R., Corti S., Waibel S., Meyer T., Ludolph A.C., Goris A., van Damme P., Robberecht W., Shatunov A., Fogh I., Andersen P.M., D'Alfonso S., Hardiman O., Cronin S., Rujescu D., Al-Chalabi A., Landers J.E., Silani V., van den Berg L.H., Veldink J.H. Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter sulrival study. Neurobiol Aging Oct;35(10):2420.e13-4. doi: /j.neurobiolaging Epub 2014 Apr 19. PMID: [PubMed - as supplied by publisher]; I.F Diekstra F.P., Van Deerlin V.M., Swieten J.C., Al-Chalabi A., Ludolph A.C., Weishaupt J.H., Hardiman O., Landers J.E., Brown, Jr. R.H., van Es M.A., Pasterkamp R.J., Koppers M., Andersen P.M., Estrada K., Rivadeneira F., Hofman A., Uitterlinden A.G., van Damme P., Melki J., Meininger V., Shatunov A., Shaw C.E., Leigh P.N., Shaw P.J., Morrison K.E., Fogh I., Chiò A., Traynor B.J., Czell D., MD, Weber M., Heutink P., de Bakker P.I.W., Silani V., Robberecht W., van den Berg L.H., Veldink J.H. C9orf72 and UNC13A are shared risk loci for ALS and FTD: a genome-wide metaanalysis. Ann Neurol. 2014; 76, doi: /ana Epub 2014 Jun 27; I.F Su Z., Zhang Y., Gendron T.F., Bauer P.O., Chew J., Yang W.-Y., Fostvedt E., Jansen- West K., Belzil V.V., Desaro P., Johnston A., Overstreet K., Oh S.Y., Todd P.K., Berry J.D., Cudkowicz M.E., Boeve B.F., Dickson D., Floeter M.K., Traynor B.J., Morelli C., Ratti A., Silani V., Rademakers R., Brown R.H., Rothstein J.D., Boylan K., Petrucelli L., Disney M.D. 113

114 114 Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r(ggggcc)-associated defects in c9ftd/als. Neuron Sep 3;83(5): doi: /j.neuron Epub 2014 Aug 14; I.F Banfi P., Ticozzi N., Lax A., Guidugli GA, Nicolini A., Silani V. A Review of Options for Treating Sialorrhea in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Respir Care. 2015; 60 (3) Sep 16. pii: respcare [Epub ahead of print]; I.F Smith B.N., Ticozzi N., Fallini C., Gkazi A.S., Topp S., Kenna K.P., Scotter E.L., Kost J., Keagle P., Miller J.W., Calini D., Vance C., Eric W. Danielson E.W., Troakes C., Tiloca C., Al-Sarraj S., Lewis E.A., King A., Colombrita C., Pensato V., Castellotti B., de Belleroche J., Baas F., ten Asbroek A. LMA., Sapp P.C., McKenna-Yasek D., McLaughlin R.L., Polak M., Asress S., Esteban-Pérez J., Muñoz-Blanco J.L., Simpson M., SLAGEN Consortium, van Rheenen W., Diekstra F.P, Lauria G., Duga S., Corti S., Cereda C., Corrado L., Sorarù G., Morrison K.E., Williams K.L., Nicholson G.A., Blair I.P., Leblond C.S., Rouleau G.A., Hardiman O., Veldink J.H., van den Berg L.H., Al- Chalabi A., Pall H., Shaw P.J., Turner M.R., Talbot K., Taroni F., García-Redondo A., Wu Z., Jonathan D. Glass J.D., Gellera C, Ratti A., Brown R.H., Jr., Silani V., Shaw C.E. Landers J.E. Exome-Wide Rare Variant Analysis Identifies TUBA4A Mutations Associated with Familial ALS Neuron Oct 22;84(2): doi: /j.neuron Epub 2014 Oct 22; I.F Maraschi A., Ciammola A., Folci A., Sassone F., Ronzitti G., Cappelletti G., Silani V. Sato S., Hattori N., Mazzanti M., Chieregatti E., Mulle C., Passafarro M., Sassone J. Parkin regulates kainate receptors by interacting with the GluK2 subunit. Nature Communications Oct 15;5:5182. doi: /ncomms6182; I.F Ronchi D., Riboldi G., Del Bo R., Ticozzi N., Scarlato M., Galimberti D., Corti S., Silani V., Bresolin N., Comi G.P. CHCHD10 mutations in Italian patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis Brain. 2015; doi: /brain/awu384; I.F Fogh I., Ratti A., Gellera C., Lin K., Tiloca C., Moskvina V., Corrado L., Sorarù G., Cereda C., Corti S., Gentilini D., Calini D., Castellotti B., Mazzini L., Querin G., Gagliardi S., Del Bo R., Conforti F.L., Siciliano G., Inghilleri M., Saccà F., Bongioanni P., Penco S., Corbo M., Sorbi S., Filosto M., Ferlini A., Di Blasio A.M., Signorini S., Shatunov A., Jones A., Shaw P.J., Morrison K.E., Farmer A.E., Van Damme P., Robberecht W., Chiò A., Traynor B.J., Sendtner M., Melki J., Meininger V., Hardiman O., Andersen P.M., Leigh N.P., D Glass J.D., Overste D.,Diekstra F.P., Veldink J.H., van Es M.A., Shaw C.E., Weale M.E., Lewis C.M., Williams J., Brown R.H., Landers J.E., Ticozzi N., Ceroni M., Pegoraro E., Comi G.P., D Alfonso S., van den Berg L.H., Taroni F., Al-Chalabi A., Powell J. and Silani V., the SLAGEN Consortium and Collaborators. A genome-wide association meta-analysis identifies a novel locus at 17q11.2 associated with sporadic amyotrophic lateral sclerosis.

115 Human Molecular Genetic Apr 15;23(8): doi: /hmg/ddt587. Epub 2013 Nov 20; I.F Agosta F., Canu E., Inuggi A., Chiò A., Riva N., Silani V., Calvo A., Messina S., Falini A., Comi G., Filippi M.. Resting state functional connectivity alterations in primary lateral sclerosis. Neurobiol Aging, 2014; 35: doi: /j.neurobiolaging Epub 2013 Oct 12; I.F Smith BN, Vance C, Scotter EL, Troakes C, Wong CH, Topp S, Maekawa S, King A, Mitchell JC, Lund K, Al-Chalabi A, Ticozzi N, Silani V, Sapp P, Brown RH Jr, Landers JE, Al-Sarraj S, Shaw CE. Novel mutations support a role for Profilin 1 in the pathogenesis of ALS. Neurobiol Aging Oct 31. pii: S (14) doi: /j.neurobiolaging [Epub ahead of print] I.F Mencacci NE, Isaias IU, Reich MM, Ganos C, Plagnol V, Polke JM, Bras J, Hersheson J, Stamelou M, Pittman AM, Noyce AJ, Mok KY, Opladen T, Kunstmann E, Hodecker S, Münchau A, Volkmann J, Samnick S, Sidle K, Nanji T, Sweeney MG, Houlden H, Batla A, Zecchinelli AL, Pezzoli G, Marotta G, Lees A, Alegria P, Krack P, Cormier-Dequaire F, Lesage S, Brice A, Heutink P, Gasser T, Lubbe SJ, Morris HR, Taba P, Koks S, Majounie E, Raphael Gibbs J, Singleton A, Hardy J, Klebe S, Bhatia KP, Wood NW; International Parkinson s Disease Genomics Consortium and UCL-exomes consortium. Parkinson's disease in GTP cyclohydrolase 1 mutation carriers. Brain Sep;137(Pt 9): doi: /brain/awu179. Epub 2014 Jul 2. I.F Borroni B, Turrone R, Galimberti D, Nacmias B, Alberici A, Benussi A, Caffarra P, Caltagirone C, Cappa SF, Frisoni GB, Ghidoni R, Marra C, Padovani A, Rainero I, Scarpini E, Silani V, Sorbi S, Tagliavini F, Tremolizzo L, Bruni A, The FTD Group- SINDEM Italian Frontotemporal Dementia Network (FTD Group-SINDEM): sharing clinical and diagnostic procedures in Frontotemporal Dementia in Italy. Neurol Sci Dec 3. doi /s I.F TOT. I.F Registri Registro Nazionale delle Malattie Rare - Istituito dall Istituto Superiore di Sanita. Studio Epidemiologico sull incidenza delle malattie rare: 40 nuovi casi Registro Lombardo della Sclerosi Laterale Amiotrofica. Studio epidemiologico su pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica: 32 Corsi ECM 115

116 La Malattia di Parkinson ed i parkinsonismi Sala Convegni CIERRECI Milano, 27/03/2014 Le Demenze Fronto-temporali (FTD) Sala Convegni Ospedale San Luca Milano, 25/09/2014 Ictus Ischemico Sala Convegni Ospedale San Luca Milano, 20/11/2014 La malattia di Huntington Sala Convegni Ospedale San Luca Milano, 11/12/2014 Charcotiadi : i giovedì dell aggiornamento clinico Clinico Laboratorio di Neuroscienze Clinico/laboratorio Lezioni magistrali I mercoledì dell aggiornamento di laboratorio Discussione dei dati di laboratorio relativi ai differenti gruppi di ricerca I mercoledì del gruppo di lavoro SLA/FTD Aggiornamenti sulle Linee Guida Novità cliniche e terapeutiche Sperimentazioni nazionali ed internazionali ATTIVITÀ PROMOZIONE E DIDATTICA Partecipazione Editorial Board Internazionali Amyotrophic Lateral Sclerosis and other Neuron Disorders European Neurology American Journal of Neurodegenerative Diseases Stage all estero di ricercatori: Dott.ssa Cinzia Calzarossa Karolinska, Stoccolma, Svezia Dott.ssa Claudia Fallini Massacchussets, Atlanta, USA Dott.ssa Isabella Fogh - King s College London, UK Dott. Niccolò Mencacci UCL Institute of Neurology London, UK 116

117 SEDE DISTACCATA DEL CENTRO DINO FERRARI PRESSO IL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE, CITOGENETICA, ANALISI BIOCHIMICO-CLINICHE, BIOINFORMATICA- IRCCS E. MEDEA Responsabile Prof Nereo Bresolin Personale strutturato: Dott Maria Teresa Bassi- Biologo IRCCS E. Medea Dott. Maria Clara Bonaglia- Biologo IRCCS E. Medea Dott. Rachele Cagliani- Biologo IRCCS E. Medea Dott Roberto Giorda - Biologo IRCCS E. Medea Ing Uberto Pozzoli Bioingegnere IRCCS E. Medea Dott. ME Raggi- Biologo IRCCS E. Medea Dott. Manuela Sironi - Biologo IRCCS E. Medea Dott. Chiara Vantaggiato - Biologo IRCCS E. Medea Dott. Alessia Arnoldi - Biologo IRCCS E. Medea Dott. Silvana Beri - Biologo IRCCS E. Medea Personale Borsista laureato: Dott. Francesca Ciceri, Biologo Borsista IRCCS E. Medea Dott. Marianna Castelli, Biologo Borsista IRCCS E. Medea Dott. Andrea Citterio, Biotecnologo Borsista Dott. Sara Bertuzzo, Biologo Borsista IRCCS E Medea Dott Alessandra Mozzi, Biotecnologa IRCCS E.Medea Dott Jacopo Vertemara, Biotecnologo IRCCS E.Medea Ing. Erika Molteni, Ingengere Biomedico IRCCS E.Medea Dottorandi: Dott. Diego Forni, Biotecnologo - Universita di Milano Dott. Chiara Pontremoli, Biologa - Universita di Milano Dott. Shikha Vashisht, Biotecnologa - SEMM Personale tecnico strutturato Cinzia Baschirotto - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Giulietta Gottardi - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Paola Pozzi - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Chiara Mapelli- tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Stefania Riva - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Giorgia Menozzi- Programmatrice IRCCS E. Medea 117

118 ATTIVITA SCIENTIFICA ANNO 2014 L attivita del laboratorio dell IRCCS E. Medea - Ass.ne La Nostra Famiglia, sede distaccata del Centro Dino Ferrari, nel corso del 2014 si e focalizzata su diverse linee di ricerca distribuite nelle sezioni di biologia molecolare, citogenetica e bioinformatica. Nelle sezioni di biologia molecolare e citogenetica sono attualmente in corso progetti incentrati sulla caratterizzazione genetico-molecolare di forme di 1) ritardo mentale, autismo ed epilessia 2) patologie e neurodegenerative dell eta pediatrica o giovane-adulta. L attivita della sezione di bionformatica si sta concentrando da alcuni anni sull applicazione di approcci innovativi per analizzare i dati di variabilità genetica nell'uomo. Nell ambito della ricerca su patologie con ritardo mentale sindromico e autismo si e continuata l attivita iniziata nell anno precedente sulla caratterizzazione di casi di sindrome di Phelan McDermid (PMS, MIM ) dovute a delezione di una porzione del cromosoma 22 che contiene il gene SHANK3. Questo gene fa parte della famiglia dei geni Shank; le proteine Shank sono caratterizzate dalla presenza di piu domini funzionali e sono implicate nell attivita sinaptica e nel processo di maturazione delle spine dendritiche neuronali. Tutti i pazienti con PMS mostrano ritardo dello sviluppo e del linguaggio; molti hanno problemi motori, comportamenti di tipo autistico, e talvolta sintomi epilettici. E stata creata un associazione per la questa patologia l Associazione Italiana per la Sindrome di Phelan- McDermid ONLUS (AISPHEM ONLUS). L IRCCS E. Medea, attraverso una partecipazione attiva di AISPHEM, ha avviato l implementazione di una biobanca per la collezione di campioni biologici di pazienti con PMS con l obiettivo di promuovere la ricerca nel campo di questa malattia. I pazienti che hanno ricevuto una diagnosi di Sindrome di Phelan-McDermid sono per la maggior parte bambini. Recentemente sono stati identificati anche alcuni pazienti adulti estremamente utili per lo studio dell evoluzione clinica e della storia naturale della sindrome. Sono poco chiare le cause dell estrema variabilita dei sintomi clinici, solo parzialmente imputabili alle diverse dimensioni della porzione di cromosoma 22 deleto nei diversi pazienti. E in corso pertanto presso l IRCCS E. Medea un progetto di ricerca clinicogenetico che prevede l analisi di una coorte di 60 pazienti di eta differenti, tra cui bambini, adolescenti e adulti affetti da PMS. L obiettivo è delineare con maggiore precisione le correlazioni genotipo/fenotipo attraverso un approccio clinico inter-disciplinare e un followup sistematico. Cercheremo di conoscere anche il funzionamento del loro cervello mediante studi elettroencefalografici (EEG) e di risonanza magnetica (MRI 3 Tesla). Allo stesso tempo, verificheremo se i pazienti, al di là della comune delezione del cromosoma 22, abbiano altre modifiche genetiche (mutazioni/polimorfismi) che possano spiegare la variabilità dei sintomi nei diversi pazienti con PMS mediante tecniche di next-generation sequencing. I dati sono in corso di analisi. Una seconda linea di ricerca si occupa di malattie del motoneurone ad insorgenza precoce ed in particolare di paraparesi spastiche ereditarie. Si e proseguita l attivita di genotipizzazione della casistica dei pazienti a disposizione per i geni nuovi identificati nel 2013 con l identificazione di nuove mutazioni in SPG56, SPG46, SPG54 e SPG11. Contemporaneamente abbiamo completato lo studio degli effetti di mutazioni in spastizina in cellule (fibroblasti e linfoblasti) di pazienti con mutazioni missenso e troncanti nel gene, precedentemente identificate nel laboratorio. Nel 2014 abbiamo proseguito l analisi della funzione di spastizina nell autofagocitosi e la caratterizzazione dei difetti di maturazione degli autofagosomi in presenza di mutazioni missenso e troncanti di spastizina. Dopo aver dimostrato che spastizina interagisce con Beclin1, abbiamo dimostrato anche che questa proteina un componente dei complessi 118

119 autofagici di Beclin1, ma è esclusa dal complesso Atg14-Beclin1. Beclin1 regola l autofagocitosi formando un complesso centrale con Vps15 e Vps34 e regolando l attivita della chinasi Vps34 tramite l interazione con una varieta di proteine, tra cui Atg14L, UVRAG e Rubicon. Il complesso generato dall interazione con Atg14 regola la sintesi del PI3P, la formazione delle isolation membranes e la generazione degli autofagosomi. Il complesso generato dall interazione con Uvrag regola sia la formazione che la maturazione degli autofagosomi (Liang et al., 2006, 2008). Infine il legame di Rubicon al complesso contenete Uvrag regola negativamente la maturazione degli autofagosomi (Zhong et al., 2009). Per identificare altre proteine che intervengono nella maturazione degli autofagosomi abbiamo analizzato l effetto delle mutazioni di spastizina sulle interazioni tra UVRAG e i suoi effettori e sullo stato di attivazione di RAB7. A tal proposito non si e osservata nessun effetto delle mutazioni di spastizina sullo stato di attivazione di RAB7. Abbiamo inoltre proseguito nell analisi del ruolo di spastizina nel traffico endosomiale studiando l internalizzazione e la degradazione del recettore EGFR. Tali studi sono in corso. Nei neuroni primari abbiamo dimostrato che la spastizina colocalizza parzialmente con il PI3P, gli endosomi precoci ed il reticolo endoplasmatico, confermando i dati dei localizzazione della forma transfettata nelle cos7 e suggerendo che la proteina potrebbe effettivamente avere un ruolo nella regolazione del traffico endosomale. Abbiamo poi testato l effetto del silenziamento della spastizina nelle prime fasi del differenziamento neuronale utilizzando colture embrionali di ippocampo ottenute da embrioni al 18 giorno di vita embrionale. Il silenziamento della spastizina ha determinato una diminuzione nella lunghezza del neurite nei neuroni derivanti dalle P19, in modo analogo a quanto osservato nell ippocampo. L attivita della sezione di bioinformatica si sta concentrando da alcuni anni sull applicazione di approcci innovativi per analizzare i dati di variabilità genetica nell'uomo. Tali approcci prevedono l'utilizzo di strumenti di genetica di popolazione per identificare geni o regioni geniche che sono stati sottoposti a selezione naturale, partendo dal presupposto che le forze selettive agiscono su un locus specifico appunto perché tale locus contiene una variante polimorfica funzionale e che tali forze lasciano un segno che può essere utilizzato per identificare le varianti selezionate. E' noto che, durante la storia evolutiva dell'uomo, pathways specifici fondamentali per la sopravvivenza sono stati soggetti a pressione selettiva, ed è per questo che abbiamo applicato le metodiche di genetica di popolazione a geni di interesse biomedico quali, ad esempio, geni coinvolti nella regolazione della pressione arteriosa, nel pathway della coagulazione e fibrinolisi, nella regolazione metabolica. Abbiamo inoltre studiato i geni coinvolti nella risposta immune e nell'autoimmunità. Abbiamo inolte messo a punto un approccio complementare che prevede l'analisi evolutiva a livello interspecifico (tra mammaiferi o tra primati) al fine di identificare siti o regioni di particolare importanza dal punto di vista funzionale. Ricerche svolte presso il nostro laboratorio hanno dimostrato che le malattie infettive hanno agito come una potente forza selettiva sul genoma umano. Conseguentemente, il pattern di variabilità genetica nell'uomo è determinato anche dalla esposizione agli agenti patogeni subita dalle popolazioni umane in diverse aree geografiche. In particolare, tale sovrapposizione è evidente per i geni che codificano per molecole regolatorie dell'attivazione dei linfociti T (Forni et al., Immunity, 2013). Inoltre, abbiamo potuto identificare nuove varianti di suscettibilità al morbo di Crohn applicando un approccio evolutivo (Cagliani et al., Mol Biol Evol, 2013). In particolare, abbiamo dimostrato che numerose varianti di rischio per tale malattia sono aumentate in frequenza nelle popolazioni umane a causa di una pressione selettiva esercitata da protozoi. 119

120 Similmente, è probabile che la variabilità genetica in loci coinvolti nello sviluppo delle facoltà cognitive sia stata modellata da forze selettive. Ad esempio, abbiamo studiato il gene THBS4, che codifica per una glicoproteina coinvolta in diversi processi tra cui imfiammazione e sinaptogenesi. Il gene THBS4 è espresso a livelli molto più alti nel cervello umano rispetto ai cervelli di scimpanze e macachi e la proteina si accumula nell placche di beta-amiloide. Abbiamo identificato una regione del gene THBS4 che è stata sottoposta a selezione bilanciante durante la storia evolutiva dell'uomo. Tale regione porta varianti che modulano l'espressione cerebrale del gene e che hanno un effetto sulla modulazione del volume di sostanza grigia (misurati tramite risonanza magnetica) in pazienti affetti da malattia di Alzheimer (Cagliani et al., 2013). Nel corso del 2012 il laboratorio di Bioinformatica ha iniziato a mettere a punto una serie di strumenti per l'analisi dei dati prodotti da due sequenziatori NGS recentemente acquisiti. Sfruttando le competenze e gli strumenti messi a punto nel corso degli anni (in particolare la libreria GeCo++), è stato possibile implementare software di analisi particolarmente avanzati. Particolare cura è stata posta nella configurazione di una infrastruttura hardware/software in grado di garantire, oltre alla suddetta flessibilità nelle analisi, la possibilità di mettere a disposizione dei diversi gruppi strumenti accessibili attraverso interfacce web relativamente semplici nell'utilizzo e che non richiedano conoscenze informatiche troppo avanzate. L'idea è quella di costruire una sistema che possa integrare informazioni di diversa natura (database di annotazioni, dati clinici, software per l'analisi funzionale) per rispondere in modo il piu' possibile intuitivo ai quesiti posti da ogni esperimento. I software a disposizione consentono di analizzare i dati da diversi punti di vista: l'analisi dell'effetto di una variante su di un trascritto viene effettuata valutandone la sua posizione, l'effetto sul prodotto proteico, sullo splicing e sull'espressione. Ciascuna di queste tipologie di analisi richiede l'accesso a database di annotazioni, motivi regolatori, fattori di trascrizione, nonché' l'impiego di software specifici. Per un impiego efficace è necessario dunque avere a disposizione un sistema informatico in grado di correre diversi software contemporaneamente, garantendo l'accesso alle fonti di dati e integrando poi i risultati in tabelle di semplice lettura e consultazione. I progetti di ricerca del nostro laboratorio, quasi sempre di natura genome-wide, ci hanno consentito non solo di mettere a punto algoritmi specifici per i diversi aspetti di queste analisi ma anche di sviluppare il software proprio tenendo conto delle esigenze di flessibilità e integrazione citate sopra. In particolare la libreria GeCo++, che è stata sviluppata nel nostro laboratorio come supporto a progetti di ricerca genome wide. Ha trovato una efficace applicazione nei problemi posti dal sequenziamento NGS e, in particolare dall'analisi terziaria dei risultati. In altre parole l'aver pensato in termini genome wide fin dal momento della prima versione del genoma umano, ci consente ora di affrontare le problematiche NGS in modo efficiente sia in termini di tempi di realizzazione degli strumenti di analisi che di risorse necessarie. Elenco delle Ricerche sviluppate nel corso del 2014 presso il laboratorio di biologia molecolare citogenetica e bioinformatica: 120 1) Caratterizzazione dei meccanismi patogenetici coinvolti in forme recessive di paraparesi spastica ereditaria ad insorgenza precoce 2) Variabilità fenotipica e aploinsufficienza nella sindrome di Phelan/McDermid: identificazione di nuovi geni mediante sequenziamento dell'esoma. 3) Alterazioni bioenergetiche e delle vie di clearance cellulare: ruolo nella patogenesi delle patologie degenerative del sistema muscolare e nervoso.

121 4) Sviluppo di soluzioni Next Generetion (NGS) per la diagnosi delle epilessie idiopatiche e forme isolate e sindromiche di disabilità intellettiva 5) Malattie del motoneurone: analisi di modelli di Drosophila per lo studio del ruolo del metabolismo lipidico nei processi neurodegenerativi 6) Approccio integrato (genetica di popolazione e next generation sequencing) per l'identificazione di varianti funzionali con effetto patologico. 7) Analisi RNA - seq per l'identificazione de - novo di isoforme di trascrizione e di splicing in pazienti neuromuscolari 8) Applicazione di un approccio di Next-Generation-Sequencing per l'identificazione di varianti causative/predisponenti a malattie autoimmuni (Sclerosi Multipla e Morbo di Crohn) 9) Implementazione di una biobanca per ricerca secondo un pre-esistente studio di fattibilità basato sul coinvolgimento delle Associazioni dei pazienti. Progetti attivi nel Lipid metabolism in the legia: genes, biomarkers, and models for therapy (NEUROLIPID)- ( ) ERARE JTC -Role of DRP1 and mitochondrial dynamics in neuronal and muscular disorders: molecular mechanisms and therapeutics implications ( ) prog GR (Ministero della salute) - Definizione del difetto molecolare in una popolazione di soggetti affetti da forme sindromiche di ritardo mentale e quadri neurodegenerativi: analisi di sequenze, meccanismi molecolari e analisi statistica delle varianti funzionali associate. (5X mille) Collaborazioni Prof E. I Rugarli- Institute for Genetics CECAD Research Center University of Cologne Joseph-Stelzmann-Str Köln Germany Prof W Griffith- Institute of Mass Spectrometry College of Medicine Grove Building Swansea University Singleton Park Swansea SA2 8PP Wales, UK. Prof Luca De Gioia - Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milan- Bicocca, Milan, Italy. Prof. Mario Clerici -Department of Physiopathology and Transplantation, University of Milan, Milan, Italy. and Don C. Gnocchi Foundation ONLUS, IRCCS, Milan, Italy. Edward J Hollox - Department of Genetics, University of Leicester, Leicester LE2 1TE, UK Prof Giuseppe Bianchi - Nephrology and Dialysis Unit, San Raffaele Scientific Institute, University Vita Salute San Raffaele, Milan, Ita Nasser M. Al-Daghri - Biomarker research program, Biochemistry Department, College of Science, King Saud University, Riyadh 11451, Kingdom of Saudi Arabia (KSA) and Prince Mutaib Chair for Biomarkers of Osteoporosis, Biochemistry Department, College of science, King Saud University, Riyadh, KSA Dott. Franca Guerini - Don C. Gnocchi Foundation ONLUS, IRCCS, Milan, Italy Dott. Mara Biasin - Department of Biomedical and Clinical Sciences, University of Milan, Milan, Italy Prof. Roberto de Franchis - IBD Unit, Chair of Gastroenterology, Luigi Sacco University Hospital, Milan Dott. Sergio Lo Caputo - S. Maria Annunziata Hospital, Florence, Italy Dott. Rosanna Asselta - Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Milano, Milano, Italy. Dott. Juan Antonio Pineda - Infectious Diseases and Microbiology Clinical Unit. Valme Hospital, Seville, Spain 121

122 Dott. Antonio Rivero-Juarez - Maimonides Institut for Biomedical Research (IMIBIC)-Reina Sofia Universitary Hospital-University of Cordoba, Spain Dott. Antonio Caruz - Immunogenetics Unit, Department of Experimental Biology, University of Jaen, Jaen, Spain Dott. Manuel Comabella - Hospital Universitari Vall d Hebron (HUVH). Barcelona, Spain Dott. Matteo Fumagalli - UCL Genetics Institute, Department of Genetics, Evolution and Environment, University College London, Gower Street, London WC1E 6BT, United Kingdom Dott. Matteo Cereda - Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), Milan, Italy Prof. Jernej Ule - Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology, Queen Square, London WC1N 3BG, UK Bonaglia Maria Clara, Giorda Roberto, Zanini Sergio (2014); a new patient with a terminal de novo 2p25.3 deletion of 1.9 mb associated with early-onset of obesity, intellectual disabilities and hyperkinetic disorder; Molecular Cytogenetics, 7:53 Doi: / PMID: I.F. 2013: 2,662 Cagliani Rachele*, Forni Diego*, Tresoldi Claudia, Pozzoli Uberto, Filippi Giulia, Rainone Veronica, De Gioia Luca, Clerici Mario, Sironi Manuela (2014); rig-1-like receptors evolved adaptively in mammals, with parallel evolution at lgp2 and rig-1; Journal of Molecular Biology, 426(6): * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /j.jmb PMID: I.F. 2013: 3,959 Cagliani Rachele, Forni Diego, Biasin Mara, Comabella Manuel, Guerini Franca Rosa, Riva Stefania, Pozzoli Uberto, Agliardi Cristina, Caputo Domenico, Malhotra Sunny, Montalban Xavier, Bresolin Nereo, Clerici Mario, Sironi Manuela (2014); ancient and recent selective pressures shaped genetic diversity at aim2-like nucleic acide sensors; genome biology and evolution, 6(4): Doi: /gbe/evu066 PMID: I.F. 2013: 4,532 Cereda Matteo, Pozzoli Uberto, Rot Gregor, Juvan Peter, Schweitzer Anthony, Clark Tyson, Ule Jernej (2014); rnamotifs: prediction of multivalent rna motifs that control alternative splicing; Genome Biology, 15(1):R20 Doi: genomebiology.com/2014/15/1/r20pmid: Co-corresponding authors I.F. 2013: 10,465 Citterio Andrea, Arnoldi Alessia, Panzeri Elena, D'Angelo Maria Grazia, Filosto Massimiliano, Dilena Robertino, Arrigoni Filippo Silvio Aldo, Castelli Marianna, Maghini Cristina, Germiniasi Chiara, Menni Francesca, Martinuzzi Andrea, Bresolin Nereo, Bassi Maria Teresa (2013); mutations in cyp2u1, ddhd2 and gba2 genes are rare causes of complicated forms of hereditary spastic paraparesis; journal of Neurology, 261(2): Doi: /s PMID: I.F. 2013: 3,

123 Costa Cinzia*, Prontera Paolo*, Sarchielli Paola, Tonelli Alessandra, Bassi Maria Teresa, Cupini Letizia Maria, Caproni Stefano, Siliquini Sabrina, Donti Emilio^, Calabresi Paolo^ (2014); a novel atpia2 gene mutation in familial hemiplegic migraine and epilepsy; Cephalalgia, 34(1): Brief report * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro ^ Autori che hanno contribuito come co-senior authors Doi: / PMID: I.F. 2013: 4,121 De Palma Clara, Morisi Federica, Pambianco Sarah, Assi Emma, Touvier Thierry, Russo Stefania, Perrotta Cristiana, Romanello Vanina, Carnio Silvia, Cappello Valentina, Pellegrino Paolo, Moscheni Claudia, Bassi Maria Teresa, Sandri Marco, Cervia Davide, Clementi Emilio (2014); deficient nitric oxide signalling impairs skeletal muscle growth and performance: involvement of mitochondrial dysregulation; Skeletal Muscle, 4(1):22 Co-corresponding authors Doi: /s PMID: Di Bella Daniela, Pareyson Davide, Savoiardo Mario, Farina Laura, Ciano Claudia, Caldarazzo Serena, Sagnelli Anna, Bonato Sara, Nava Simone, Bresolin Nereo, Tedeschi Gioacchino, Taroni Franco, Salsano Ettore (2014); subclinical leukodystrophy and infertility in a man with a novel homozygous clcn2 mutation; Neurology, 83(13): Doi: /WNL PMID: I.F. 2013: 8,303 Eicher John D., Powers Natalie R., Miller Laura L., Mueller Kathryn L., Mascheretti Sara, Marino Cecilia, Willcutt Erik G., Defries John C., Olson Richard K., Smith Shelley D., Pennington Bruce F., Tomblin Bruce J., Ring Susan M., Gruen Jeffrey R. (2014); characterization of the dyx2 locus on chromosome 6p22 with reading disability, language impairment, and iq; Human Genetics, 133(7): Doi: /S PMID: I.F. 2013: 4,522 Fanizza Isabella, Bertuzzo Sara, Beri Silvana, Scalera Elisabetta, Massagli Angelo, Sali Maria Enrica, Giorda Roberto, Bonaglia Maria Clara (2014); genotype-phenotype relationship in a child with 2.3 mb de novo interstitial 12p13.33-p13.32 deletion; European Journal of Medical Genetics, 57(7): Doi: /j.ejmg PMID: I.F. 2013: 1,486 Forni Diego, Cleynen Iasbelle, Ferrante Marc, Cassinotti Andrea, Cagliani Rachele, Ardizzone Sandro, Vermeire Severine, Fichera Maria, Lombardini Marta, Maconi Giovanni, De Franchis Roberto, Asselta Rosanna, Biasin Mara, Clerici Mario*, Sironi Manuela* (2014); abo histo-blood group might modulate the predisposition to crohn's disease and affects disease behavior; Journal of Crohn's and Colitis, 8(6): * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /j.crohns PMID:

124 I.F. 2013: 3,562 Forni Diego*, Cagliani Rachele*, Tresoldi Claudia, Pozzoli Uberto, De Gioia Luca, Filippi Giulia, Riva Stefania, Menozzi Giorgia, Colleoni Marta, Biasin Mara, Lo Caputo Sergio, Mazzotta Francesco, Comi Giacomo Pietro, Bresolin Nereo, Clerici Mario, Manuela Sironi (2014); an evolutionary analysis of antigen processing and presentation across different timescales reveals pervasive selection; Plos Genetics, 10(3):e * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /journal.pgen PMID: I.F. 2013: 8,167 Forni Diego*, Pozzoli Uberto*, Cagliani Rachele, Tresoldi Claudia, Menozzi Giorgia, Riva Stefania, Guerini Franca Rosa, Comi Giacomo Pietro, Bolognesi Elisabetta, Bresolin Nereo, Clerici Mario, Sironi Manuela (2014); genetic adaptation of the human circadian clock to day-lenght latitudinal variations and relevance for affective disorders; Genome Biology, 15(10):499 * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /s PMID: I.F. 2013: 10,465 Fumagalli Matteo, Sironi Manuela (2014); human genome variability, natural selection and infectious diseases; Current Opinion in Immunology, 30:9-16 Doi: /j.coi PMID: I.F. 2013: 7,867 Giannoccaro Maria Pia, Liguori Rocco, Arnoldi Alessia, Donadio Vincenzo, Avoni Patrizia, Bassi Maria Teresa (2014); atypical late onset hereditary spastic paraplegia with thin corpus callosum due to novel compound heterozygous mutations in the spg11 gene; Journal of Neurology, 261(9): , Letter to the Editor Doi: /s PMID: I.F. 2013: 3,841 Gorio Alfredo, Torrente Yvan, Madaschi L., Di Stefano A.B., Pisati Federica, Marchesi Chiara, Belicchi Marzia, Di Giulio A.M., Bresolin Nereo (2014); erratum to "fate of autologous dermal stem cells transplanted into the spinal cord after traumatic injury (tsci)" - neuroscience 125 (2004) ; Neuroscience, 269: Correction Doi: /j.neuroscience I.F. 2013: 3,327 Guerini Franca Rosa, Clerici Mario, Cagliani Rachele, Malhotra Sunny, Montalban Xavier, Forni Diego, Agliardi Cristina, Riva Stefania, Caputo Domenico, Galimberti Daniela, Asselta Rosanna, Fenoglio Chiara, Scarpini Elio, Comi Giacomo Pietro, Bresolin Nereo, Comabella Manuel*, Sironi Manuela* (2014); no association of if116 (interferon-inducible protein 16) variants with susceptibility to multiple; Journal of Neuroimmunology, 271(1-2):49-52 * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro 124

125 Doi: /j.jneuroim PMID: I.F. 2013: 2,786 Guerini Franca Rosa, Agliardi Cristina, Sironi Manuela, Arosio Beatrice, Calabrese Elena, Zanzottera Milena, Bolognesi Elisabetta, Ricci Cristian, Costa Andrea Saul, Galimberti Daniela, Griffanti Ludovica, Bianchi Anna, Savazzi Federica, Mari Daniela, Scarpini Elio, Baglio Francesca, Nemni Raffaello, Clerici Mario (2014); possibile association between snap-25 single nucleotide polymorphisms and alterations of categorical fluency and functional mri parameters in alzheimer's disease; Journal of Alzheimer's Disease, 42(3): Doi: /JAD PMID: I.F. 2013: 3,612 Hardwick Robert J., Menard Anne, Sironi Manuela, Milet Jacqueline, Garcia Andre, Sese Claude, Yang Fengtang, Fu Beiyuan, Courtin David, Hollox Edward J. (2014); haptoglobin (hp) and haptoglobin-related protein (hpr) copy number variation, natural selection, and trypanosomiasis; Human Genetics, 133(1):69-83 Doi: /s xPMID: I.F. 2013: 4,522 Liguori Rocco, Giannoccaro Maria Pia, Arnoldi Alessia, Citterio Andrea, Tonon Caterina, Lodi Raffaele, Bresolin Nereo, Bassi Maria Teresa (2014); impairment of brain and muscle energy metabolism detected by magnetic resonance spectroscopy in hereditary spastic paraparesis patients type 28 with ddhd1 mutations; Journal of Neurology, 261(9): Co-corresponding authors Doi: /s PMID: I.F. 2013: 3,841 Locatelli Federica*, Pozzi Marco*, Avantaggiato Paolo, Lanfranchi M., Tufarulo L., Amorelli Valeria, Rizzi Gina, Radice Sonia, Galbiati Sara, Clementi Emilio, Strazzer Sandra (2014); pharyngeal spasticity due to dantrolene; Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 39(4): * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /jcpt PMID: I.F. 2013: 1,533 Magri Francesca Maria Benedetta, Govoni Alessandra, Brusa R., Angelini Corrado, D'Angelo Maria Grazia, Mongini Tiziana, Toscano Antonio, Siciliano Gabriele, Tomelleri Giuliano, Mora Marina, Nigro V., Pegoraro Elena, Morandi Lucia, Musumeci Olimpia, Sciacco Monica, Ricci Giulia, Moroni Isabella, Gandossini Sandra, Del Bo Roberto, Fortunato Francesco, Ronchi Dario, Corti Stefania, Moggio Maurizio, Bresolin Nereo, Comi Giacomo Pietro (2014); the italian registry of limb girdle muscular dystrophy: natural history, genotype-phenotype correlations and outcome measures; Abstract G.P th International Congress of the World Muscle Society - Berlin, Germany, ; Neuromuscular Disorders; 24(9-10):892 Doi: /j.nmd I.F. 2013: 3,

126 Marino Cecilia*, Scifo Paola*, Della Rosa Pasquale, Mascheretti Sara, Facoetti Andrea, Lorusso Maria Luisa, Giorda Roberto, Consonni Monica, Falini Andrea, Molteni Massimo, Gruen Jeffrey R., Perani Daniela (2014); the dcdc2/intron 2 deletion and white matter disorganization: focus on developmental dyslexia; Cortex, 57: * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /j.cortex PMID: I.F. 2013: 6,042 Mascheretti Sara, Riva Valentina, Giorda Roberto, Beri Silvana, Lanzoni Lara Francesca Emilia, Cellino Maria Rosaria, Marino Cecilia (2014); kiaa0319 and robo1: evidence on association with reading and pleiotropic effects on language and mathematics abilities in developmental dyslexia; Journal of Human Genetics, 59(4): Doi: /jhg PMID: I.F. 2013: 2,526 Mezzelani Alessandra, Landini Martina, Facchiano Francesco, Raggi Maria Elisabetta, Villa Laura, Molteni Massimo, De Sanctis Barbara, Brera Carlo, Caroli Anna Maria, Milanesi Luciano, Marabotti Anna (2014); environment, dysbiosis, immunity and sex-specific susceptibility: a translational hypothesis for regressive autism pathogenesis; Nutritional Neuroscience, in press Doi: / Y PMID: I.F. 2013: 2,114 Mezzelani Alessandra, Landini Martina, Galluccio N., Merelli I., Raggi Maria Elisabetta, Ciceri Francesca, Villa Laura, Molteni Massimo, Bonfanti Arianna, Massagli Angelo, Camposeo Maria Serena, Milanesi Luciano (2014); sex-specific neurotoxicity as possible cause of regressive autism; Abstract 3rd International Summit on Toxicology & Applied Pharmacology, Chicago, USA, ; Journal of Clinical Toxicology, 4(4) Doi: / S1.012 Mozzi Alessandra*, Forni Diego*, Cagliani Rachele, Pozzoli Uberto, Vertemara Jacopo, Bresolin Nereo, Sironi Manuela (2014); albuminoid genes: evolving at the interface of dispensability and selection; Genome Biology and Evolution, 6(11): * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /gbe/evu235PMID: I.F. 2013: 4,532 Nizzardo Monica, Simone Chiara, Salani Sabrina, Ruepp Marc-David, Rizzo Federica, Ruggieri Margherita, Zanetta Chiara, Brajkovic Simona, Moulton Hong M., Muehlemann Oliver, Bresolin Nereo, Comi Giacomo Pietro, Corti Stefania (2014); effect of combined systemic and local morpholino treatment on the spinal muscular atrophy delta7 mouse model phenotype; Clinical Therapeutics, 36(3): e5 Doi: /j.clinthera PMID:

127 I.F. 2013: 2,586 Orsucci Daniele, Petrucci Loredana, Caldarazzo Ienco Elena, Chico Lucia, Simi Paolo, Fogli Antonella, Baldinotti Fulvia, Simoncini Costanza, Logerfo Annalisa, Carlesi Cecilia, Arnoldi Alessia, Bassi Maria Teresa, Siciliano Gabriele, Bonuccelli Ubaldo, Mancuso Michelangelo (2014); hereditary spastic paraparesis in adults. a clinical and genetic perspective from tuscany; Clinical Neurology and Neurosurgery, 120:14-19 Doi: /j.clineuro PMID: I.F. 2013: 1,248 Querin G.*, Bertolin C.*, Martinuzzi Andrea, Bassi Maria Teresa, Arnoldi Alessia, Polo A., Pegoraro Elena, Sorarù G. (2014); the blurred scenario of motor neuron disorders linked to spatacsin mutations: a case report; European Journal of Neurology, 21(10):e85-e86, Letter to the Editor * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /ene.12481PMID: I.F. 2013: 3,852 Remiche Gautier, Ronchi Dario, Magri Francesca, Lamperti Costanza, Bordoni Andreina, Moggio Maurizio, Bresolin Nereo, Comi Giacomo Pietro (2013); extended phenotype description and new molecular findings in late onset glycogen storage disease type ii: a nothern italy population study and review of the literature; Journal of Neurology, 261(1):83-97 Doi: /s PMID: I.F. 2013: 3,841 Riboldi Giulietta, Zanetta Chiara, Ranieri Michela, Nizzardo Monica, Simone Chiara, Magri Francesca, Bresolin Nereo, Comi Giacomo Pietro, Corti Stefania (2014); antisense oligonucleotide therapy for the treatment of c9orf72 als/ftd diseases; Molecular Neurobiology, 50(3): Doi: /s PMID: I.F. 2013: 5,286 Riva Valentina, Marino Cecilia, Giorda Roberto, Molteni Massimo, Nobile Maria (2014); the role of dcdc2 genetic variants and low socioeconomic status in vulnerability to attention problems; European Child & Adolescent Psychiatry, in press Doi: /s PMID: I.F. 2013: 3,554 Riva Valentina, Battaglia Marco, Nobile Maria, Cattaneo Francesca, Lazazzera Claudio, Mascheretti Sara, Giorda Roberto, Merette Chantal, Emond Claudia, Maziade Michel, Marino Cecilia (2014); grin2b predicts attention problems among disadvantaged children; European Child & Adolescent Psychiatry, in press Doi: /s PMID: I.F. 2013: 3,554 Romaniello Romina, Zucca Claudio, Tenderini Erika, Arrigoni Filippo Silvio Aldo, Ragona Francesca, Zorzi Giovanna, Bassi Maria Teresa, Borgatti Renato (2013); a novel mutation in stxbp1 gene in a child with epileptic encephalopaty and an atypical electroclinical pattern; 127

128 journal of Child Neurology, 29(2): Doi: / PMID: I.F. 2013: 1,666 Romaniello Romina, Arrigoni Filippo Silvio Aldo, Cavallini Anna, Tenderini Erika, Baschirotto Cinzia, Triulzi Fabio, Bassi Maria Teresa, Borgatti Renato (2013); brain malformation and mutations in alpha and beta-tubulin genes: a review of the literature and description of two new cases; Developmental Medicine and Child Neurology, 56(4): Doi: /dmcn.12370PMID: I.F. 2013: 3,292 Romaniello Romina, Arrigoni Filippo Silvio Aldo, Bassi Maria Teresa, Borgatti Renato (2014); mutations in alpha and beta-tubulin encoding genes: implications in brain malformations; Brain and Development, in press Doi: /j.braindev PMID: I.F. 2013: 1,542 Ruggieri Margherita, Riboldi Giulietta, Brajkovic Simona, Bucchia Monica, Bresolin Nereo, Comi Giacomo Pietro, Corti Stefania (2013): induced neural stem cells: methods of reprogramming and potential therapeutic applications; Progress in Neurobiology, 114C(March 2014):15-24 Doi: /j.pneurobio PMID: I.F. 2013: 10,301 Area: 3 - AREA NEUROBIOLOGIA, BIOLOGIA COMPUTAZIONALE, FARMACOLOGIA Saracchi Enrico, Castelli Marianna, Bassi Maria Teresa, Brighina Erika, Cereda Diletta, Marzorati Laura, Patassini Mirko, Appollonio Ildebrando, Ferrarese Carlo, Brighina Laura (2014); aq novel heteroygous setx mutation in a patient presenting with chorea and motor neuron disease (2014); Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration, 15(1-2): Doi: / PMID: I.F. 2013: 2,591 Saulle Irma, Biasin Mara, Gnudi Federica, Ibba Salomè, Garziano Micaela, Sironi Manuela, Trabattoni Daria, Lo Caputo Sergio, Mazzotta Francesco, Caruz Antonio, De Gioia Luca, Clerici Mario (2014); evolutionary analysis identifies an mx2 haplotype associated with NATURAL RESISTANCE TO hiv-1 infection; Abstract OA08.02 HIV Research for Prevention, HIV R4P Abstracts, Cape Town, South Africa, ; AIDS Research and Human Retroviruses, 30(S1):A24-A25 Doi: /aid PMID: I.F. 2013: 2,457 Sironi Manuela*, Biasin Mara*, Cagliani Rachele, Gnudi Federica, Saulle Irma, Ibba Salomè, Filippi Giulia, Yahyaei Sarah, Tresoldi Claudia, Riva Stefania, Trabattoni Daria, De Gioia Luca, Lo Caputo Sergio, Mazzotta Francesco, Forni Diego, Pontremoli Chiara, Pineda Juan A., Pozzoli Uberto, Rivero-Juarez Antonio, Caruz Antonio, Clerici Mario (2014); 128

129 evolutionary analysis identifies an mx2 haplotype associated with natural resistance to hiv-1 infection; Molecular Biology and Evolution, 31(9): * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /molbev/msu193 PMID: I.F. 2013: 14,308 Sironi Manuela, Cagliani Rachele, Pontremoli Chiara, Rossi Marianna, Migliorino Guglielmo, Clerici Mario, Gori Andrea (2014); the ccr5delta32 allele is not a major predisposing factor for severe h1n1pdm09 infection; BMC Research Notes, 7:504 Doi: / PMID: Sironi Manuela*, Biasin Mara*, Gnudi Federica, Cagliani Rachele, Saulle Irma, Forni Diego, Rainone Veronica, Trabattoni Daria, Garziano Micaela, Mazzotta Francesco, Real Luis Miguel, Rivero-Juarez Antonio, Caruz Antonio, Lo Caputo Sergio, Clerici Mario (2014); a regulatory polymorphism in havcr2 modulates susceptibility to hiv-1 infection; Plos One, 9(9):e * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: /journal.pone PMID: I.F. 2013: 3,534 Theofilopoulos Spyridon, Griffiths William J., Crick Peter J., Yang Shanzheng, Meljon Anna, Ogundare Michael, Kitambi Satish Srinivas, Lockhart Andrew, Tuschl Karin, Clayton Peter T., Morris Andrew A., Martinez Adelaida, Reddy M. Ashwin, Martinuzzi Andrea, Bassi Maria Teresa, Honda Akira, Mizuochi Tatsuki, Kimura Akihiko, Nittono Hiroshi, De Michele Giuseppe, Carbone Rosa, Criscuolo Chiara, Yau Joyce L., Seckl Jonathan R., Schüle Rebecca, Schöls Ludger, Sailer Andreas W., Kuhle Jens, Fraidakis Matthew J., Gustafsson Jan-Ake, Steffensen Knut R., Björkhem Ingemar, Ernfors Patrik, Sjövall Jan, Arenas Ernest, Wang Yuqin (2014); cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver x receptors; The Journal of Clinical Investigation, 124(11): Doi: /JCI68506 PMID: I.F. 2013: 13,765 Vantaggiato Chiara, Cantoni Orazio, Guidarelli Andrea, Romaniello Romina, Citterio Andrea, Arrigoni Filippo Silvio Aldo, Doneda Chiara, Castelli Marianna, Airoldi Giovanni, Bresolin Nereo, Borgatti Renato, Bassi Maria Teresa (2014); novel setx variants in a patient with ataxia, neuropathy and oculomotor apraxia are associated with normal sensitivity to oxidative dna damaging agents; Brain and Development, 36(8): Doi: /j.braindev PMID: I.F. 2013: 1,542 Vantaggiato Chiara, Clementi Emilio, Bassi Maria Teresa (2014); zfyve26/spastizin: a close link between complicated hereditary spastic paraparesis and autophagy; Autophagy, 10(2): Doi: /auto.27173PMID: I.F. 2013: 11,

130 Vetro Annalisa*, Dehghani Mohammad Reza*, Kraoua Lilia, Giorda Roberto, Beri Silvana, Cardarelli Laura, Merico Maurizio, Manolakos Emmanouil, Parada-Bustamante Alexis, Castro Andrea, Radi Orietta, Camerino Giovanna, Brusco Alfredo, Sabaghian Marjan, Sofocleous Crystalena, Forzano Francesca, Palumbo Pietro, Palumbo Orazio, Calvano Savino, Zelante Leopoldo, Grammatico Paola, Giglio Sabrina, Basly Mohamed, Chaabouni Myriam, Carella Massimo, Russo Gianni, Bonaglia Maria Clara, Zuffardi Orsetta (2014); testis development in the absence of sry: chromosomal rearrangements at sox9 and sox3; European Journal of Human Genetics, in press * Autori che hanno collaborato in ugual misura al lavoro Doi: /ejhg PMID: I.F. 2013: 4,225 Centro Dino Ferrari Il Direttore Prof. Nereo Bresolin 130

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