Variabilità analitica e biologica. Trattamento dei campioni.
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- Ippolito Palmisano
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1 Variabilità analitica e biologica. Trattamento dei campioni. Diagnostica biochimico-clinica clinica Lezione 2
2 La biochimica clinica Le principali finalità per la richiesta di indagini di laboratorio sono le seguenti: FINALITA DI SCREENING FINALITA DIAGNOSTICHE - confermare o escludere un sospetto diagnostico - per formularne un altro. Un singolo test, o gruppi di test, possono: - fornire informazioni prognostiche - essere utilizzati per il monitoraggio terapeutico o del decorso di una malattia
3 Biochimica clinica
4 Biochimica clinica
5 Le fasi dell esame/analisi di laboratorio
6 Le fasi dell esame/analisi di laboratorio
7 La fase pre-analitica Questo insieme di procedure è rappresentato da: -Preparazione del paziente -Raccolta del materiale -Prelievo del materiale -Trasporto o spedizione -Separazione (siero, plasma) -Conservazione del campione.
8 La fase pre-analitica La fase pre-analitica può essere soggetta a variabilità. Per migliore rappresentatività e costanza di composizione del campione, la variabilità si riduce quando: -Il paziente, ben informato e motivato, segue le istruzioni (modalità di raccolta, digiuno, riposo, ecc) -Le manovre di prelievo/raccolta sono corrette ed adeguate (ambiente, impiego di materiali e dispositivi idonei, ecc) -Il trasporto(invio) del materiale al laboratorio è adeguato.
9 INVIO REPARTI CLINICI ACCETTAZIONE AMBULATORI UTENZA ESTERNA SPEDIZIONE INTRA- O EXTRAMURALE RICEZIONE CONTROLLO SELEZIONE CHIMICA CENTRIFUGAZIONE SEPARAZIONE SIERO-PLASMA CONSEGNA ANALISTI EVENTUALE DEPROTEINIZZAZIONE EVENTUALE CONSERVAZIONE CONSERVAZIONE 4 C/-20 C
10 La fase pre-analitica Criteri di non accettabilità dei campioni biologici Identificazione assente Identificazione incompleta Mancanza di informazioni necessarie per l'esecuzione dei test Contenitore inidoneo (non conforme alle indicazioni o necessità del laboratorio, non sterile e/o a imperfetta chiusura, non esente da metalli in tracce, ecc.) Contenitore non integro Prelievo non corretto (effettuato durante terapia infusionale, senza impiego di terreni di trasporto, ecc.) Quantità insufficiente Rapporto sangue/anticoagulante inadeguato o scorretto Mancata aggiunta di idoneo conservante Presenza di coaguli (per esempio emocromo, test coagulativi) Emolisi evidente Conservazione a temperatura non corretta (emogasanalisi, ammoniemia, ecc.) Esposizione a luce solare diretta Congelamenti e scongelamenti ripetuti Paziente non a digiuno per esami come glucosio, lipidi, ecc. Paziente non sottoposto al previsto regime dietetico (per esempio sangue occulto) Paziente non a riposo per test in cui il riposo è indispensabile (per esempio dosaggio di renina)
11 La fase pre-analitica Sieratura e centrifugazione -30 in contenitori di vetro (> plastica) - 15 con attivatori della coagulazione (vetro/ caolino) -5 con idonee quantitàdi trombina -Tempi piùlunghi a 4 C Entro 1h dal prelievo Centrifugazione Separazione siero/plasma dalla parte corpuscolata
12 La fase pre-analitica Cause degli errori preanalitici,, che possono intervenire durante la conservazione del materiale Natura generale dell'alterazione Fisica Chimico-fisica Biochimica o biometabolica Processo specifico coinvolto Evaporazione Solubilità Adsorbimento Desorbimento Diffusione Fotolisi Denaturazione Polimerizzazione Aggregazione Alterazione dei sistemi energetici Alterazione dei gradienti di concentrazione Alterazione della permeabilità cellulare Alterazione della concentrazione dei metaboliti
13 La fase pre-analitica Temperatura di conservazione del materiale biologico 0 C C (Acqua e ghiaccio): Ormoni-Metaboliti a vita breve (NH + 4 Acido lattico) -20 C/-70 C/-142 C Nota:A temperatura ambiente non avvengono cambiamenti per 4h a carico di enzimi, metaboliti, elettroliti e minerali Conservazione al buio (Bilirubina, Porfirine, Vitamine) Liofilizzazione Modificazione del ph Conservazione dei campioni ph 2 per Ca, P e ossalati nelle urine (HCldiluito) ph 7-8 per Acido urico (Carbonato di sodio) Aggiunta di sostanze chimiche con funzioni particolari Alcuni analiti sono stabili, ad es bilirubina, colesterolo, trigliceridi, azoto urico, ALP, non subiscono alterazioni nei sieri conservati a contatto col coagulo per almeno 48 h a temperature comprese tra 4 C e 30 C.
14 La fase pre-analitica Conservazione combinata dei campioni
15 La fase pre-analitica, ricapitolando
16 Variabilità analitica Se si eseguono più misurazioni di una stessa quantità, raramente le misure coincidono: se ne trae la conclusione ovvia che i valori misurati sono in genere diversi dal vero valore della quantità oggetto di misura.
17 Variabilità analitica Se si eseguono più misurazioni di una stessa quantità, raramente le misure coincidono: se ne trae la conclusione ovvia che i valori misurati sono in genere diversi dal vero valore della quantità oggetto di misura. Scopo delle misure: Ottenimento del valore analitico che rappresenti una stima fedele del valore vero ATTENDIBILITA (Reliability Reliability) Qualità che caratterizza un risultato (o un metodo) analitico esprime la capacitàdella misura in esame di approssimare il valore vero ACCURATEZZA & PRECISIONE SPECIFICITA & SENSIBILITA
18 Variabilità analitica PRECISIONE: Concordanza tra i risultati di una serie di misure distinte ottenute con lo stesso metodo su aliquote di uno stesso campione IMPRECISIONE: Espressa quantitativamente dalla Deviazione standard (Dispersione o variabilità analitica)
19 Variabilità analitica Il concetto di precisione contiene anche quelli di ripetibilità e riproducibilità. La ripetibilità è la misura della deviazione dal valore medio dei risultati ottenuti da uno stesso operatore in un unica serie analitica e senza cambiare reattivi o apparecchiature (precisione entro la serie). La riproducibilità è la misura della deviazione dal valore medio dei risultati ottenuti in un arco variabile di tempo da operatori diversi che non conoscono l identità del campione analizzato e che usano lotti di soluzioni e reagenti diversi
20 Variabilità analitica ACCURATEZZA: Definisce il grado di concordanza tra il valore medio fornito dall analisi (valore analitico) ed il valore REALE (valore vero) del parametro analizzato in una serie distinta di repliche di una stessa analisi sul medesimo campione INACCURATEZZA: Differenza tra il valore medio sperimentale ed il valore vero
21 Variabilità analitica Impreciso e inaccurato Preciso ma inaccurato Impreciso ma accurato Preciso e accurato
22 Variabilità analitica
23 Variabilità analitica In pratica il controllo si effettua utilizzando sieri di controllo, cioè campioni appositamente predisposti con quantità note di vari componenti e sottoposti ad analisi contemporaneamente ai sieri dei pazienti. In ogni gruppo di analisi relative a sieri di pazienti vi saranno così dati che si riferiscono ad un siero di controllo. La concordanza tra i valori analitici e quelli noti dei composti usati come calibratori garantiràla correttezza analitica dei risultati.
24 Variabilità analitica SPECIFICITA : la specificità analitica indica la capacità del metodo di determinare un dato analita senza subire interferenze, ossia la capacitàdel metodo di distinguere tra una sostanza e possibili sostanze interferenti. SENSIBILITA : la sensibilità analitica è data dalla minima quantità di un analita rilevabile in un campione biologico.
25 Variabilità analitica Errori Errore di un analisi quantitativa Differenza tra il valore vero della sostanza dosata ed il valore analitico, ossia quello trovato con il procedimento analitico utilizzato (Errore totale) Risulta dalla somma di numerosi errori di natura diversa, suddivisibili in Errori sistematici ed Errori casuali.
26 Variabilità analitica Errori Errore sistematico: falsano il risultato analitico in maniera «sistematica», ossia ripetendosi tutte le volte che si effettua lo stesso tipo di analisi con lo stesso metodo. Causa nota o individuabile (cattiva taratura strumentale, concentrazioni o ph dei reagenti errate, ecc)
27 Variabilità analitica Metodi I metodi analitici devono essere scelti in base all accuratezza, accuratezza, alla precisione e alla facilità In base all accuratezza, i metodi analitici possono essere: Metodo definitivo: non ha fonti di inaccuratezza o ambiguità; Metodo di riferimento: inaccuratezza trascurabile rispetto alla sua imprecisione; Metodo ad errore noto: l entità dell errore è stata stabilita; Metodo ad errore ignoto: ad accuratezza ignota.
28 Qualità del laboratorio
29 Qualità del laboratorio Controllo di Qualità previsto per legge (art. 124 del DPCM del 10/2/84): -Uso giornaliero di standard per la calibrazione -Controllo settimanale con materiale a titolo noto* -Carte di controllo (registrazione grafica) *Per effettuare un valido controllo di qualità, si rende necessario l utilizzo di un materiale di controllo, omogeneo, stabile nel tempo, a composizione chimica e fisica nota e il piùpossibile vicina a quella dei campioni in esame. I CAMPIONI DI CONTROLLO DEVONO ESSERE ANALIZZATI CONTESTUALMENTE AI CAMPIONI IN ESAME IN MANIERA CASUALE
30 Qualità del laboratorio
31 Qualità del laboratorio
32 Qualità del laboratorio Carte di controllo Le carte di controllo (Shewart,, 1920) costituiscono la principale metodologia statistica utilizzata per il controllo di un processo produttivo. Consentono di : -Verificare se un processo èin stato di controllo o meno -Descrivere il comportamento di un processo in stato di controllo -Aiutare gli operatori della qualità a portare un processo nello stato di controllo Un processo produttivo raggiunge lo stato di controllo quando la sua normale variabilitàègarantita, cioè i valori ottenuti da tale processo sono compresi in limiti ben determinabili.
33 Qualità del laboratorio Carte di controllo STATO DI CONTROLLO: stato di un metodo analitico in cui le cause sistematiche di variabilità (variabilità sistematica) sono individuate ed eliminate (errori sistematici). Le forme di variabilità intrinseche al processo (variabilità naturale) non sono eliminabili, ma stanno alla base delle normali fluttuazioni del processo stesso (errori casuali). In presenza di variabilità sistematica il processo è detto FUORI CONTROLLO Una carta di controllo è pertanto uno strumento per ricercare, raggiungere e mantenere un processo (nel nostro caso un metodo analitico) in stato di controllo. Metodi di controllo: metodo di Shewart, metodo della somma cumulativa, metodo della media delle analisi replicate, metodo della media giornaliera.
34 Qualità del laboratorio Carte di controllo CARTA DI CONTROLLO GENERICA
35 Qualità del laboratorio Carte di controllo ESEMPIO: CARTA DI CONTROLLO SHEWART Dunque, lo scopo principale dei vari metodi proposti per il controllo di qualità è quello di rivelare gli errori di una misura analitica che si collochino al di fuori dei limiti di accettabilità, per poter dare affidabilità ai clinici sui risultati di laboratorio
36 Qualità del laboratorio Carte di controllo ESEMPIO: CARTA DI CONTROLLO SHEWART FUORI CONTROLLO
37 Qualità del laboratorio Carte di controllo
38 Qualità del laboratorio CONTROLLO DI QUALITA ESTERNO Si tratta di un controllo di qualità non più intra-laboratorio, ma INTER- LABORATORIO, in cui sono effettuate analisi di campioni provenienti dall esterno o da altri laboratori della stessa regione o da laboratori di altre nazioni. Analisi dei campioni da parte di un numero elevato di laboratori di riferimento (calcolo della media e della DS) Impiego dei cosiddetti valori di consenso, cioè i valori medi e DS ottenuti da tutti i partecipanti al controllo di qualità interlaboratorio (scartando i risultati aberranti e ricalcolando la media e la DS in base ai rimanenti risultati)
39 Qualità del laboratorio La VEQ (Valutazione Esterna della Qualità) èun programma di verifica effettuato da un ente esterno al laboratorio detto «ente di controllo» che di solito è rappresentato da una istituzione governativa, un organizzazione professionale o un azienda privata specializzata. Consiste nell invio di campioni contenenti diversi analiti a concentrazione sconosciuta ai laboratori partecipanti al programma, i quali analizzano i campioni e comunicano i dati all ente di controllo che provvederà all elaborazione statistica. Il valore conferito da ciascun laboratorio è confrontato con i corrispondenti valori di tutti gli altri partecipanti, ciò permette di ottenere informazioni sull andamento di un metodo, di uno strumento o di un reattivo. Dal confronto dei dati dei diversi partecipanti al programma di controllo esterno, ciascun laboratorio può rilevare eventuali inaccuratezze del proprio sistema ed essere stimolato a perfezionare le proprie scelte in un ambito di miglioramento continuo del sistema.
40 Qualità del laboratorio Un sistema di valutazione esterna della qualità deve possedere alcune caratteristiche per poter essere considerato qualificato : Calendario definito e ben cadenzato nell arco dell anno degli invii del materiale da analizzare e degli elaborati statistici; Garanzia dell anonimato dei partecipanti; Comunicazione tra gestore del sistema e partecipanti per l interpretazione dei risultati e delle eventuali problematiche analitiche; Uso di materiale certificato; Confronto tra partecipanti dislocati su territorio omogeneo.
41 Qualità del laboratorio Materiali analizzati : di solito si analizzano due sieri A e B a contenuto molto diverso di un singolo analita; questi possono essere miscelati opportunamente fino ad ottenere una serie di sieri (anche 10-12) 12) a diverse concentrazioni dell analita, impiegati per l analisi del controllo di qualità dei laboratori. A tutti i laboratori di riferimento vengono inviati gli stessi campioni; I risultati vengono, poi, inviati ad una sede centrale ed elaborati da un calcolatore, che fornisce i dati delle medie e delle DS; Tali valori vengono rinviati ai laboratori, includendo anche un istogramma che segnala le differenze tra il risultato del singolo laboratorio e quello medio.
42 Qualità del laboratorio SI ANALIZZANO DUE DIVERSI CAMPIONI: SI ANALIZZANO DUE DIVERSI CAMPIONI: A = campione ad alta concentrazione di analita B = campione a bassa concentrazione di analita M =media dei risultati forniti da tutti i laboratori sulle misure dei due campioni
43 Variabilità biologica e valori di riferimento Il dato di laboratorio serve per poter decidere un comportamento verso un paziente. Bisogna quindi avere il mezzo per confrontare il dato ottenuto con quello della popolazione da cui il paziente stesso ètratto. Si dovranno stabilire dei valori al di fuori dei quali si presume vi sia un anormalità con un limite di errore accettabile. Occorre osservare che il termine normale ha diversi significati: -in senso statistico definisce un tipo di distribuzione; -in senso epidemiologico può essere confuso con il valore tipico di una popolazione; - in senso clinico la parola normale spesso indica un assenza di una certa malattia. Si preferisce quindi parlare di VALORI VALORI DI RIFERIMENTO.
44 Variabilità biologica e valori di riferimento Valori normali: valori piùfrequentemente riscontrati negli individui sani Il modello sano non è un modello REALE facilmente identificabile: è solo un soggetto privo di malattia E un modello IDEALE Range ampio: etnia, sesso, età, abitudini alimentari
45 Distibuzione gaussiana dei parametri analitici
46 Variabilità biologica e valori di riferimento Da qui il postulato di Grasbeck, che definì il valore di riferimento, calcolato su una popolazione ristretta che abbia almeno caratteristiche genetiche ed ambientali molto omogenee e confrontabili con quelle del soggetto a cui il risultato di laboratorio si riferisce. Il dato analitico ha pertanto valore solo se confrontato con i valori di riferimento
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48 Variabilità biologica e valori di riferimento Fattori che influenzano i valori di riferimento: -Genetico: (gruppi sanguigni, antigeni di istocompatibilità); -Fisiologico: (età, sesso, eccesso di peso, fattori ambientali, stato nutrizionale, gravidanza, ora e giorno del prelievo, modalitàdi prelievo, postura); -Esogeno: (alimentazione, attività fisica, attività professionale, fattori psichici, abitudini di vita in genere, fumo, alcool, stress, ansia, dolore, assunzione di contraccettivi, assunzione di farmaci, altitudine, clima); -Variabilitàintraed interindividuale: (variabilitàbiologica della specie); -Variabilità biologica ritmica: (oscillazioni dei valori di alcuni analiti nel corso della giornata, della settimana, del mese)
49 Variabilità biologica e valori di riferimento Produzione dei valori di riferimento: -Selezione individui della popolazione di riferimento -Misura parametri (rigido controllo variabilità analitica + controllo qualità) -Presentazione dati in forma opportuna per il confronto Si definisce come intervallo di riferimento quello in cui ricade il 95% dei valori misurati sul campione preso come riferimento (con distribuzione gaussiana); il 2,5% dei valori alti ed il 2,5% di quelli bassi costituiscono i valori sospetti ; oltre i ±3DS si hanno valori patologici
50 Variabilità biologica e valori di riferimento Alcuni parametri biochimici possono seguire una distribuzione a campana, ma asimmetrica (non normale); se si passa ad una scala logaritmica sulle ascisse si rientra nel caso di prima.
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55 Variabilità biologica e valori di riferimento Per la diagnostica è utile: VP: risultati positivi per pazienti con patologia; VN: risultati negativi per pazienti senza patologia; FP: risultati positivi per pazienti senza patologia; FN: risultati negativi per pazienti con patologia. Sensibilità: frazione dei VP sul totale degli ammalati; Specificità: frazione dei VN sul totale dei sani; Prevalenza: numero dei malati sul totale dei pazienti esaminati; Valore predittivo +/-: numero dei valori veri +/- rispetto ai malati effettivi/non malati effettivi.
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57 Variabilità biologica e valori di riferimento Sensibilità (diagnostica) La sensibilitàèla capacitàdi identificare correttamente gli individui ammalati. In termini di probabilità, la sensibilità è la probabilità che un individuo ammalato risulti positivo al test; si può anche dire che essa è la proporzione degli individui ammalati che risultano positivi al test. Individui ammalati: (VP+FN) e, fra questi, i positivi al test sono rappresentati da (VP). La sensibilità si calcola come rapporto tra i veri positivi e tutti i malati, cioè:
58 Variabilità biologica e valori di riferimento Specificità (diagnostica) La specificitàèla capacitàdi identificare correttamente gli individui sani. In termini di probabilità, la specificitàèla probabilità che un individuo sano risulti negativo al test; si può anche dire che essa è la proporzione degli individui sani che risultano negativi al test. Individui sani: (FP+VN) e, fra questi, i negativi al test sono i soli (VN). La specificità si calcola con il rapporto tra veri negativi e tutti i sani, cioè:
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61 Variabilità biologica e valori di riferimento Test ideale: Sensibilità 100 % Specificità 100 % Test inutile: Sensibilità 50 % Specificità 50 % Test usuale: Sensibilità % Specificità %
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