MINISTERO DELL'UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA SCIENTIFICA PROGRAMMI DI RICERCA - ANNO 2001

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1 MINISTERO DELL'UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA SCIENTIFICA PROGRAMMI DI RICERCA - ANNO 2001 Coordinatore Scientifico: Francesco Paolo SCHENA Titolo della Ricerca: IgA nefropatia familiare. Costituzione di una banca di DNA per lo sviluppo di studi genetici Finanziamento assegnato: Rd-Ra: Durata: 24 Mesi Obiettivo della Ricerca Questo progetto è basato principalmente su uno studio collaborativo che vede insieme nefrologi, genetisti ed una piccola-media industria (PMI) aggregati per la realizzazione dei seguenti obiettivi: Fase 1. Collezionamento del DNA genomico da oltre 100 famiglie di pazienti affetti da IgAN familiare in cui i componenti di almeno tre generazioni siano stati esaminati. Nei familiari con microematuria persistente, si procederà, previo consenso informato, con altre indagini di laboratorio e strumentali. Pertanto saranno raccolti campioni di sangue da pazienti con IgAN e loro familiari, dopo accurato screening. La stessa procedura sarà eseguita in 100 famiglie di IgAN sporadica e 50 famiglie di pazienti con porpora di Schönlein-Henoch. Fase 2. La banca di DNA genomico servirà per studi di linkage finalizzati ad individuare regioni cromosomiche associate al locus malattia. La genotipizzazione si effettuerà con ABI PRISM Linkage Mapping. Specifiche regioni cromosomiche saranno esaminate nelle famiglie maggiormente "informative" sulla base 1)del numero di generazioni coinvolte dalla malattia; 2)tipo di trasmissione; 3)rischio relativo. Informazioni utili si otterranno anche dall analisi di coppie di fratelli affetti o da triadi (figlio affetto e genitori) collezionate. In tal modo si definiranno le regioni cromosomiche che sono trasmesse con maggiore frequenza nei familiari affetti. Quindi si evidenzieranno regioni file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (1 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

2 cromosomiche diverse associate alla IgAN familiare, IgAN sporadica e porpora di Schönlein-Henoch. Fase 3. Nelle regioni cromosomiche associate si valuterà la presenza di geni candidati. Seguiranno studi familiari e di associazione che permetteranno di approfondire i rapporti fenotipo-genotipo nella IgAN familiare, IgAN sporadica e porpora di Schönlein-Henoch. Sarà eseguito anche uno studio di singole variazioni nucleotidiche (SNP) limitato ad alcune regioni cromosomiche associate. Lo studio sarà eseguito dapprima su due pools di DNA ottenuti rispettivamente da pazienti e controlli e solo gli SNP che mostreranno squilibri in frequenza tra i due gruppi verranno analizzati sui singoli campioni. Dall analisi di singoli campioni sarà possibile valutare frequenze alleliche e genotipiche nei due gruppi e capire se qualche combinazione genotipica si associ preferenzialmente alla malattia. La ricerca di questi polimorfismi verrà condotta nei geni risultati associati. Se risulterà associato un marcatore localizzato in un gene di cui è nota la struttura, verranno analizzate la sequenza codificante, le giunzioni esone-introne e la regione promotrice. Se, invece, risulterà associato un marcatore localizzato in un gene per cui è disponibile solo la sequenza del trascritto verrà analizzato il cdna. La ricerca di nuovi polimorfismi di tipo SNP verrà condotta in un pannello di 10 pazienti in modo da aumentare la probabilità di identificare variazioni nucleotidiche coinvolte nella malattia. Saranno analizzati frammenti di bp amplificati da DNA genomico o da cdna dei pazienti. I nuovi polimorfismi così trovati verranno caratterizzati mediante sequenziamento diretto. I risultati ottenuti permetteranno una serie di correlazioni tra genotipo e fenotipo. I geni identificati saranno utilizzati per l allestimento di microchip per la diagnosi della malattia. Fase 4. La costruzione di DNA microarray specifici sarà effettuata con l uso di micropiastre su cui sarà depositato DNA a sequenza nota con l uso di apparecchiatura robotica. Le finalità da raggiungere potranno essere due: 1) identificazione di sequenza (gene wild type/mutato); 2)quantificazione di espressione del gene. Ogni microchip sarà validato in cieco su soggetti normali e pazienti con e senza IgAN. La PMI coinvolta curerà anche l acquisizione del brevetto e la diffusione commerciale del kit fabbricato. Innovazione rispetto allo stato dell'arte nel campo La IgA nefropatia (IgAN) o glomerulonefrite di Berger è la forma più frequente di nefrite nel mondo. Essa è caratterizzata da episodi ricorrenti di macroematuria in coincidenza di infezioni delle alte vie respiratorie (tonsilliti, faringiti, bronchiti) o di altre infezioni. In alcuni casi la malattia si può presentare con microematuria persistente associata o meno a proteinuria di grado variabile. La biopsia renale mostra all immunofluorescenza depositi mesangiali di IgA in tutti i glomeruli ed all esame istologico lesioni di grado variabile. La IgAN compare nella seconda e terza decade di vita, meno frequente nella prima decade. Questa malattia è la forma di nefrite che più frequentemente causa insufficienza file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (2 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

3 renale cronica terminale perchè dopo 15 anni dall epoca della biopsia renale il 40% dei pazienti è in trattamento dialitico. Il registro europeo degli uremici cronici in trattamento dialitico dimostra che la IgAN è la prima causa di glomerulonefrite che porta all uremia terminale con un incidenza crescente nel corso degli anni ed un sempre maggior interessamento del sesso maschile. La IgAN familiare è stata descritta per la prima volta da Tolkoff-Rubin et al. Da quel momento in poi molti casi sono stati pubblicati. Egido et al per la prima volta distinsero forme familiari da quelle sporadiche. La IgAN familiare è definita una malattia che interessa due o più componenti di una famiglia in cui la diagnosi è stata effettuata con la biopsia renale. La IgAN familiare è stata descritta da molti partecipanti a questo progetto e recentemente uno studio di linkage cooperativo internazionale, effettuato su 30 famiglie con IgAN familiare (24 italiane e 6 americane), ha dimostrato un associazione della malattia con la regione 6q22-23 (lod score = 5.6) nel 60% delle famiglie ipotizzando un ereditarietà di tipo autosomico dominante a penetranza incompleta. Tuttavia, nell ambito dello studio genetico cooperativo internazionale solo il 58% delle famiglie italiane mostrava un associazione con la regione 6q (lod score > 1); ciò significa che nelle restanti IgAN familiari si dovrà cercare l associazione con altre zone cromosomiche.uno studio clinico personale, in corso di pubblicazione, ha dimostrato che il decorso clinico della IgAN familiare è peggiore di quello della forma sporadica perchè il 60% dei pazienti con IgAN familiare presenta il raddoppio della creatininemia o l insufficienza renale cronica terminale dopo 15 anni di follow-up dall epoca della biopsia renale rispetto al 10% delle IgAN sporadiche. Da questi studi recenti si evince il notevole impatto scientifico e clinico della ricerca genetica atta ad individuare il/i gene/i responsabile/i della malattia ai fini di una medicina preventiva. Studi di associazione sui polimorfismi di geni candidati che possono essere responsabili dello sviluppo della malattia hanno dato risultati differenti. I limiti di questi studi sono rappresentati principalmente dal ridotto numero di pazienti esaminati, errori di stratificazione di popolazione e differenze etniche. Pertanto un approfondito studio genetico eseguito su una vasta casistica di famiglie e di pazienti con diverso fenotipo (insorgenza della malattia, entità della lesione istologica, decorso clinico) potrebbe portare un ulteriore contributo alla eziopatogenesi delle malattie con depositi mesangiali di IgA a livello renale. Criteri di verificabilità 1. Definizione di un protocollo per la diagnosi Creazione di un sito WEB e del database elettronico Raccolta di DNA e dati clinici da pazienti, familiari e controlli 2. Identificazioni di regioni cromosomiche associate alla IgAN 3. Identificazione di geni candidati responsabili della patogenesi e/o della file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (3 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

4 progressione della malattia. 4. Preparazione di kit microarray per l'identificazione di soggetti con rischio di malattia. Elenco delle Unità di Ricerca Sede dell'unità: Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como Responsabile scientifico: Francesco SCOLARI Finanziamento assegnato: 0 Compito dell'unità Sulla scorta delle considerazioni su-esposte, si evince che gli studi dell ultimo decennio hanno contribuito in maniera determinante alla caratterizzazione delle molecole che partecipano al processo fibrotico in corso di malattia renale. Tuttavia, dati che stabiliscano in maniera definitiva una relazione di causa-effetto fra TGFbeta, Ang II e PAI-1 e fibrosi renale, in particolare nell'igan, non sono a tutt oggi disponibili. Studi d associazione fra progressione del danno e genotipi hanno dimostrato un peggioramento rapido in pazienti con IgAN omozigoti per i genotipi D del gene ACE e T235C dell angiotensinogeno, ma l osservazione non è univoca e studi paralleli sembrano negarne un implicazione. Una ragione della variabilità dei risultati pubblicati sull argomento è individuabile nel fatto che il locus D/I non sia il sito che regola i livelli di ACE ma probabilmente uno ad esso legato in una situazione di linkage disequilibrium. Per quanto il locus D/I appaia legato al vero sito di regolazione è possibile che siano presenti ricombinazioni geniche per cui il sito regolatorio non sia più associato al genotipo D. Ne consegue che omozigoti D ricombinanti per il sito regolatorio non presentino alti livelli ACE. Tale difficoltà interpretativa può essere superata estendendo la caratterizzazione del gene ACE così da poter definire differenti aplotipi mediante i SNP (Single Nucleotide Polymorphism). In altre parole, tramite la definizione di un aplotipo del gene ACE esteso a differenti SNP è possibile suddividere condizioni di omozigosi DD in ulteriori categorie con differenti livelli di ACE e, potenzialmente, con evoluzioni variabili di malattia. Nuovi studi devono pertanto superare l attuale incompletezza, estendendo la caratterizzazione del gene ACE in casistiche sufficientemente numerose di pazienti con IgAN. Le varie fasi del nostro progetto si articolano in questo modo: 1. Creazione di un protocollo condiviso dai gruppi partecipanti per la diagnosi di IgAN sporadica e familiare e di porpora di Schonlein- Henoch. 2. Identificazione dei pazienti con IgAN e porpora di Schonlein-Henoch a carattere sia sporadico che familiare. file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (4 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

5 3. Collezionamento del DNA genomico di questi pazienti e dei loro familiari 4. Caratterizzazione dell aplotipo esteso del gene ACE e del polimorfismo funzionale 4G/5G del gene PAI-1 in una numerosa coorte di pazienti con IgAN ed evoluzione variabile verso l uremia. Negli stessi pazienti sarà in aggiunta valutato il genotipo dell osteopontina. In un secondo tempo sarà definita una possibile correlazione fra genotipi delle molecole sopra descritte e livelli renali delle stesse. Questo secondo obiettivo verte pertanto a consolidare l idea patogenetica che lega i livelli tissutali di molecole ai loro genotipi funzionali ed a correlare gli stessi con un evoluzione della malattia. Per la definizione dell aplotipo ACE esteso, i seguenti markers verranno considerati: 4504, 7831, 8128, Alu (I/D), Con la eccezione del sito ripetuto Alu, i polimorfismi descritti saranno determinati con amplificazione allele-specifica. PAI-1. Il genotipo polimorfico 4G/5G a livello 675 del promotore PAI-1 sarà valutato con amplificazione del sito con un oligonucleotide utilizzato come primer che introduce un sito Bsl1. Tale sito è valutabile con digestione BSL1, nel caso in cui sia presente il genotipo 5G. Osteopontina. L osteopontina è caratterizzata da un sito polimorfico nell introne 1 che consiste in una duplicazione TG o TGTG. L analisi del polimorfismo è effettuata con PCR a cui fa seguito la definizione della duplicazione con analisi di sequenza nucleotidica (ABI 377 Analyzer). L espressione renale di ACE, PAI-1 ed osteopontina sarà determinata con PCR semiquantitativa. Sede dell'unità: Università degli Studi di TRIESTE Responsabile scientifico: Antonio AMOROSO Finanziamento assegnato: Compito dell'unità 1. RACCOLTA DEI CAMPIONI BIOLOGICI DEI PAZIENTI E DEI CONTROLLI. Si intende esaminare le famiglie raccolte e non ancora esaminate per linkage, la popolazione di IgAN sporadiche e 500 individui normali. 2. STRATEGIE 2.1 Metodi di indagine dei polimorfismi dei geni candidati Un punto importante nella preparazione dei pools di DNA è che la composizione dei frammenti amplificati dal pool rifletta la quantità di ogni campione di DNA che costituisce il pool. Per questo: a) sarà introdotta nel pool la stessa quantità di DNA per ogni campione; b) saranno preparati pools di almeno 200 individui in modo da neutralizzare il più possibile le differenze individuali; c) tutti i campioni introdotti nel file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (5 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

6 pool verranno singolarmente tipizzati per 2 SNP in modo da verificare che le frequenze geniche ricavate dall analisi dei pools corrispondano a quelle reali. Se questo non si verificasse, i campioni responsabili dell errore saranno eliminati. Analisi degli SNP con i pools. Consultando le banche dati abbiamo identificato a tutt'oggi numerosi SNP in geni coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria che possono essere esaminati subito, e altri si aggiungeranno nel corso della ricerca. E stato recentemente messo a punto un metodo sensibile e riproducibile per determinare la frequenza dei due alleli di un marcatore SNP in un pool di DNA di diversi individui abbinando la tipizzazione dei due alleli con primer extension e la rilevazione quantitativa con DHPLC. Inoltre, si intende utilizzare un apparato di sequenza per l analisi dei frammenti di acidi nucleici e valutare se la morfologia dei picchi di fluorescenza può permetter di derivare la frequenze alleliche dei polimorfismi nei pools di DNA. Analisi degli SNP sui singoli campioni. Gli SNP che mostreranno una diversa distribuzione dei due alleli nel pool di pazienti e controlli saranno analizzati con i singoli campioni per confermare il risultato. Dall'analisi dei singoli campioni, inoltre, sarà possibile ricavare le frequenze genotipiche nei pazienti e nei controlli per valutare se all'associazione contribuisca preferenzialmente un determinato genotipo. Ricerca di nuovi SNP nei geni risultati associati La ricerca di questi polimorfismi sarà condotta nei geni risultati associati. Se risulterà associato un marcatore localizzato in un gene di cui è nota la struttura, saranno analizzate la sequenza codificante, le giunzioni esone-introne e la regione promotrice. Se risulterà associato un marcatore localizzato in un gene per cui è disponibile solo la sequenza del trascritto sarà analizzato il cdna. La ricerca di polimorfismi sarà condotta in un pannello di 10 pazienti IgAN in modo da aumentare la probabilità di identificare variazioni nucleotidiche coinvolte nella IgAN. Saranno analizzati frammenti di bp amplificati da DNA genomico o da cdna. I nuovi polimorfismi così trovati verranno caratterizzati per sequenza diretta 2.2 Studi di linkage Le nuove famiglie saranno esaminate dapprima per escludere un linkage con il locus IGA1. Le famiglie che non mostrano linkage significativi con IGAN1 saranno esaminate genome-wide. Sede dell'unità: Università degli Studi di BOLOGNA Responsabile scientifico: Alba VANGELISTA Finanziamento assegnato: Compito dell'unità file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (6 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

7 Nella fase 1 del progetto l'unità di Bologna collaborerà alla definizione di un protocollo diagnostico comune per IgAN familiare, IgAN sporadica e porpora di Schonlein-Henoch, alla raccolta di dati anagrafici, clinici, istologici e di laboratorio dei soggetti inclusi nello studio ed alla raccolta di campioni di sangue di pazienti e loro familiari. Nell'ambito del programma saranno adottati i seguenti criteri: La IgAN familiare sarà definita in base alla presenza di glomerulonefrite diagnosticata istologicamente in almeno due componenti della famiglia. In ogni famiglia saranno sottoposti ad esame delle urine tutti i componenti. I familiari con persistente microematuria saranno esaminati con la conta di Addis in contrasto di fase e l ecografia renale ed eventualmente sottoposti a biopsia renale, previo consenso informato. La IgAN sporadica sarà documentata dalla presenza della malattia in un solo componente della famiglia in cui almeno 3 generazioni evidenzieranno l assenza di microematuria o di malattie renali. La porpora di Schönlein- Henoch sarà diagnosticata sulla base della presenza di petecchie, dolori addominali e articolari, macro o microematuria e sull'evidenza istologica di depositi mesangiali di IgA. Nell'ambito dello studio ogni familgia sarà identificata da un proprio codice. Di ogni soggetto saranno immessi i dati anagrafici, clinici e di laboratorio. L'Unità di Bologna studierà gli aspetti istologici dei casi inclusi nello studio, che saranno classificati, in base alla classificazione internazionale della WHO, in G1 (forma lieve), G2 (forma moderata) e G3 (forma severa). I preparati istologici saranno inoltre revisionati da due osservatori indipendenti per una valutazione semiquantitativa delle lesioni. Saranno analizzati i preparati allestiti per la microscopia elettronica, con particolare attenzione allo spessore delle membrane basali glomerulari. Nel caso in cui non si disponesse di materiale incluso in resina, si provvederà al recupero del materiale incluso in paraffina che verrà estratto, nuovamente fissato e incluso in resina per l'esame al microscopio elettronico. I dati istologici e ultrastrutturali dei diversi gruppi saranno analizzati in maniera comparativa per verificare la presenza di lesioni morfologiche che possano caratterizzare una forma rispetto alle altre. Le lesioni istologiche saranno inoltre analizzate in funzione del quadro clinico al momento della biopsia e all'evoluzione nel tempo della nefropatia, alla ricerca di eventuali correlazioni. Nella fase 3 del progetto l'unità di Bologna focalizzerà la propria attività sulle correlazioni fra lesioni istologiche e genotipi identificati. Le biopsie renali saranno raggruppate sulla base degli studi genetici e si ricercheranno eventuali differenze in termini di lesioni istologiche in grado di influenzare l'evoluzione della nefropatia. Particolare attenzione sarà dedicata alla ricerca di correlazioni fra le alterazioni dello spessore delle membrane basali glomerulari e mutazioni dei geni che codificano per le catene del collagene IV per verificare l'esistenza di una primitiva alterazione delle membrane basali. Sede dell'unità: Università degli Studi di BARI file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (7 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

8 Responsabile scientifico: Francesco Paolo SCHENA Finanziamento assegnato: Compito dell'unità Fase 1 Preparazione del protocollo diagnostico in collaborazione con le altre Unità di Ricerca. Creazione del sito web che presenterà due sezioni. La prima conterrà informazioni cliniche e scientifiche su IgAN e porpora di Schönlein-Henoch. La seconda, consultabile solo dalle Unità partecipanti, sarà articolata in una prima parte con le notizie sullo stato del progetto ed in una seconda con il database. Per ogni famiglia sarà disegnato l albero genealogico con il software Cyrillic 2.1. Il database conterrà la scheda notizie di ogni soggetto con i dati clinici ed istologici. Tutti i dati saranno immessi ad intervalli di tempo variabili a seconda dell entità del danno renale. Nel follow-up saranno considerati due end-point: 1. raggiungimento dell uremia; 2. raddoppio della creatininemia. Saranno, inoltre, elencati i campioni di DNA e le quantità disponibili. Il database sarà costruito con il software File Maker 5 Developer dall Apuliabiotech. Collezionamento ed estrazione di DNA. Il DNA sarà isolato dai linfomonociti periferici mediante il kit GENOMIX (Talent). La durata della fase sarà 24 mesi. Fase 2 Per l analisi genome-wide verrano utilizzati 400 marcatori altamente polimorfici e distribuiti su tutto il genoma. La determinazione del genotipo relativo ad ogni marcatore avverrà mediante sequenziatore automatico. L analisi e l elaborazione dei dati verrà condotta mediante software operanti su piattaforma SUN-Solaris UltraSparK. In seguito ad una preliminare localizzazione del locus-malattia, verra condotto un posizionamento piu accurato incrementando la densita di marcatori nella regione candidata. L identificazione del/i locus/i associato/i sara caratterizzata da valori di LOD score a due punti superiori a 3. La selezione dei geni candidati nella regione critica sara condotta mediante l ausilio di banche dati disponibili su web. Particolare attenzione verra attribuita ai trascritti omologhi di geni responsabili di patologie autoimmuni. La durata della fase 2 sarà 6 mesi. Fase 3 Gli studi di associazione e familiari saranno effettuati sui pazienti collezionati in precedenza e nel corso dei due anni di progetto. L esame dei geni candidati sarà effettuato con le informazioni che proverranno dall analisi di linkage dell intero genoma. Il nostro studio propone di esaminare anche marcatori di tipo SNP (single nucleotide polymorphism) di geni candidati già disponibili nelle banche dati. Le frequenze alleliche di pazienti e controlli saranno paragonate per mezzo di tabelle di contingenza. La significatività statistica sarà valutata con test del Chi quadro con correzione di Yates. La durata della fase sarà 18 mesi. file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (8 of 9)22/05/ :43:34 a.m.

9 Fase 4 Allestimento di microchips per la diagnosi di IgAN. L ApuliaBiotech costruirà i microchip e sarà deputata all analisi mediante microarray dei polimorfismi presenti nei geni individuati nella fase 3. A tal fine i microchip saranno preparati su supporto di vetro con la metodica dello spotting ng di DNA genomico di ciascun paziente o soggetto normale saranno amplificati, marcati ed ibridizzati con il microarray. Il segnale ottenuto sarà rilevato e valutato utilizzando il sistema di acquisizione ed analisi Scanarray (Packard). Sulla base delle analisi dei dati ottenuti, l ApuliaBiotech assemblerà un prototipo di microchip contenente il numero minimo di sonde necessarie per la diagnosi di IgAN. Quest ultimo sarà validato in cieco su un set di soggetti normali e di pazienti con e senza IgAN. Sarà compito dell'apuliabiotech curare l'implementazione commerciale del microarray. La durata della fase sarà di 8 mesi. file:///c /Documents and Settings/Usuario/Escritorio/scheda.htm (9 of 9)22/05/ :43:34 a.m.