PROGETTO VERSO IL FUTURO CON L INGEGNERIA GENETICA a.s. 2012/2013

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1 PROGETTO VERSO IL FUTURO CON L INGEGNERIA GENETICA a.s. 2012/2013 PROTOCOLLI SPERIMENTALI FASE 1: Preparazione delle cellule competenti modificato da Maniatis Metodo Materiali Motivazioni Strumenti Utilizzare i ceppi di E.coli Top 10 o DH5α ed effettuare prima dell'esperimento un controllo di fertilità in LB agar e di sensibilità all ampicillina in LBagar + Amp. 1. Inoculare una colonia singola in 20mL di LB broth e incubare in agitazione o/n a 37 C Ceppi di E.coli Top 10 o DH5α Terreno LB (Luria Bertani)broth 10 g triptone 5 g estratto di lievito 10 g NaCl Aggiungere 950 ml di dh 2 O, aggiustare il ph a 7.0 con 5 N NaOH. Portare il volume a 1 L con dh 2 O. Autoclavare a 121 C per 15 minuti. Per i terreni solidi aggiungere 15 g/l di Bacto Agar. I controlli permettono di verificare che il ceppo test cresca in LB agar e non cresca in LBagar + Amp, essendo sensibile all ampicillina. Bilancia, autoclave, incubatore per piastre, incubatore con agitazione ( a più di 100 oscillazioni per minuto, meglio a ). Anse sterili, spatole, vetreria, Bunsen con treppiedi e reticella Cappa di sicurezza per microbiologia 2. Trasferire un aliquota della brodocoltura o/n in LB broth sterile in beuta, effettuando una diluizione 1:100 (es. 250 µl di inoculo in 25 ml di brodo fresco) e controllare l O.D. a λ=595nm. L O.D. non dovrebbe essere superiore a Ampicillina Concentrazione stock: 50 mg/ml in dh 2 O (conservare in aliquote a 20 C). Concentrazione d uso: 50 µg/ml Terreno LB broth sterile Pipette sterili e pipettatrici automatiche, micropipette con puntali Spettrofotometro e cuvette Incubatore con agitazione

2 Far crescere in agitazione a 37 C da 3 a 4 ore circa. 3. Controllare l O.D. a λ=595nm, avendo presente che le cellule vanno raccolte quando la brodocoltura ha raggiunto un O.D.,a λ =595nm, pari a 0.4. Se l O.D. va bene raffreddare le cellule, incubandole per 10 min in ghiaccio tritato. 4. Trasferire 2 ml della brodocoltura in provettine da 2 ml, preparando tanti campioni quante saranno le trasformazioni da effettuare. Oltre ai campioni preparare anche le provette per i controlli negativi della trasformazione. re a rpm per 2 min a 4 C o a 4200 rpm per 10 min a 4 C 5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di ogni campione in 1 ml di soluzione fredda di MgCl 2 e CaCl re a rpm per 2 min a 4 C 7. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di ogni campione in 50 µl di soluzione 0,1M di CaCl 2 freddo. Contenitore con ghiaccio Provettine da 2 ml, puntali sterili Soluzione fredda di MgCl 2 e CaCl 2 80mM MgCl 2 e 20mM CaCl 2 Soluzione 0,1M CaCl 2 freddo, contenitore con ghiaccio Per una trasformazione efficace è importante che il numero di cellule vitali non superi 10 8 cell/ml. Per la maggior parte dei ceppi di E.coli una O.D., a λ =595nm, pari a 1 corrisponde a circa 10 9 cell/ml. L incubazione in ghiaccio serve per bloccare la crescita. Il trattamento a freddo e con le soluzioni saline serve ad indebolire le membrane per permettere l ingresso del DNA plasmidico. In particolare gli ioni Ca 2+ andrebbero a neutralizzare le cariche negative del DNA e ne Spettrofotometro e cuvette, tritaghiaccio refrigerata, micropipette Micropipette, micropipette

3 8. Utilizzare le cellule subito per la trasformazione, mantenendole comunque in ghiaccio, o conservarle a 20 C per una notte e usarle il giorno dopo. Contenitore con ghiaccio faciliterebbero il passaggio attraverso le membrane. Le cellule competenti sono molto fragili. Micropipette N.B. Tutte le soluzioni devono essere sterili (sterilizzazione in autoclave oppure per filtrazione con filtri da 0,22 µm) e tenute in ghiaccio. Le operazioni vanno effettuate in sterilità Come controllo, da utilizzare nella trasformazione, possono essere conservate anche delle cellule non rese competenti cioè alla condizione del punto 3. FASE 2: Trasformazione batterica (metodo heat shock) Metodo Materiali/ avvertenze Motivazioni Strumenti 1. Spostare le cellule competenti (E. 50 µl di cellule competenti Coli, TOP10) dal freezer al ghiaccio (E. Coli, TOP10) e tenerle in ghiaccio per un paio di DNA plasmidico con resistenza minuti prima dell aggiunta del all Ampicillina DNA plasmidico. Per ogni Nota: tenere sempre le cellule trasformazione batterica usare 50 µl competenti in ghiaccio, mai a Le cellule competenti sono molto fragili! Freezer 20 C per conservare cellule e DNA Tritaghiaccio di cellule competenti. temperatura ambiente prima della trasformazione 2. Aggiungere 25 ng (o al massimo 50 ng) di DNA plasmidico alle cellule competenti. Se la soluzione di DNA plasmidico è 10 ng/µl, aggiungere 2.5 µl (oppure 5 µl). Come controllo negativo della trasformazione impiegare provette con 50 µl di cellule competenti a cui non va aggiunto il DNA plasmidico. Le prove di controllo seguiranno 25 ng (o 50 ng) di DNA plasmidico contenitore con ghiaccio tritato pennarello vetrografico puntali sterili Campioni da preparare: Micropipette

4 l iter dei campioni. Incubare in ghiaccio per 30 min. cellule + DNA controllo negativo: cellule senza DNA 3. Incubare le cellule a 42 C per 40 sec (shock termico). Con tempi superiori le cellule si rovinano e muoiono. Lo shock termico sembra favorire l ingresso del DNA nelle cellule Bagnetto termostatato a 42 C 4. Incubare le cellule in ghiaccio per 2 min. contenitore con ghiaccio tritato 5. Aggiungere alle cellule batteriche 250 µl di LB broth fresco (senza antibiotici!) ed incubare in agitazione a 37 C per 40 min. 6. Piastrare in LB agar + Amp aliquote differenti di cellule trasformate quali: 5 µl di cellule trasformate 10 µl di cellule trasformate 50 µl di cellule trasformate 100 µl di cellule trasformate. Piastrare anche aliquote di 20 o 50 µl delle cellule di controllo non Terreno LB (Luria Bertani) broth 10 g triptone 5 g estratto di lievito 10 g NaCl Aggiungere 950 ml di dh 2 O, aggiustare il ph a 7.0 con 5 N NaOH. Portare il volume a 1 L con dh 2 O. Autoclavare. Per i terreni solidi aggiungere 15 g/l di Bacto Agar. Ampicillina Concentrazione stock: 50 mg/ml in dh 2 O (conservare in aliquote a 20 C). Concentrazione d uso: 50 µg/ml Spatole ad L sterili Puntali sterili L incubazione a 37 C per 40 min serve alle cellule per riprendersi dopo lo shock termico, effettuare un ciclo di replicazione ed esprimere il gene per la resistenza all ampicillina. La presenza dell antibiotico nel terreno di coltura inibisce la crescita delle cellule non trasformate, selezionando le trasformate che, riproducendosi, formeranno colonie visibili ad occhio nudo. Micropipette Agitatore termostatato a 37 C Micropipette Incubatore per le piastre a 37 C.

5 trasformate sia su LB agar + Amp(controllo negativo) sia su LB agar senza ampicillina (controllo positivo). Incubare o/n a 37 C. 7. Osservare le piastre con le cellule trasformate e procedere al calcolo dell efficienza di trasformazione. A tal fine scegliere le piastre con colonie ben isolate e contabili. Contarle direttamente o, se troppe, dividere la piastra in 4 settori. Contare le colonie di due settori contrapposti, fare la media e moltiplicare per 4. Si ottiene il n di colonie per piastra. Procedere alla lettura delle piastre con i controlli. Pennarello vetrografico, righello, cartoncino nero L efficienza di trasformazione viene espressa come n cellule trasformate/µg DNA e calcolata con la seguente formula: n colonie di una piastra x fattore diluizione/ngdna x 1000 Va bene un efficienza di trasformazione dell ordine di 10 5 o 10 6 cellule trasformate / µg DNA. N.B. La presenza di piccole colonie (colonie satelliti) vicine alle altre può essere dovuta alla crescita di cellule sensibili all antibiotico che hanno potuto crescere grazie al consumo dell antibiotico da parte delle cellule trasformate Contacolonie 8. Conservare le piastre da utilizzare in frigorifero. Raccogliere in sacchetti autoclavabili le piastre da eliminare in modo da poterle sterilizzare, prima di procedere all eliminazione. Sacchetti per autoclave Frigorifero Autoclave NOTA Il giorno prima dell inizio della fase 3 allestire la brodo coltura fresca del clone trasformato prelevando una colonia singola positiva cresciuta su LBagar+Amp e inoculandola in 2mL di LB broth+amp. Incubare in agitazione a 37 C o/n. Allestire tanti inoculi quante sono le prove da effettuare. Al momento dell utilizzo l inoculo deve essere ben torbido, con O.D. maggiore di 1.8.

6 FASE 3: Minipreps di DNA (metodo: Wizard Minipreps DNA Purification System) Metodo Materiali/ avvertenze Motivazioni Strumenti 1. Trasferire 2 ml di coltura Provette da 2 ml Pipettatrice automatica con pipetta batterica cresciuta o/n in una sterile o micropipetta provetta da 2 ml. 2. re la coltura batterica per 3 min a rpm a temperatura ambiente. 3. Scartare il surnatante, capovolgendo la provetta su carta assorbente, e risospendere il pellet in 200 µl di Cell Resuspension Solution (nessuna traccia di pellet deve essere visibile). Nota: Il pellet deve essere ben visibile, altrimenti non ci sono sufficienti batteri per purificare il DNA. Cell Resuspension Solution 50 mm Tris Hcl ph 8 10 mm EDTA 100 µl/ml RNasi A NOTA: si tratta di una soluzione in cui vengono risospese le cellule a ph ottimale (basico) per salvaguardare il DNA durante la lisi. La presenza della ribonucleasi A permette la degradazione dell RNA che si libera nella fase di lisi alcalina. L EDTA blocca le DNasi Micropipitte con puntali 4. Aggiungere 200 µl di Cell Lysis Solution e agitare per inversione delicatamente (7 8 volte) per favorire la lisi delle cellule (non utilizzare il vortex in questo passaggio). Incubare 5 min a temperatura ambiente Cell Lysis Solution 0.2 N NaOH 1% SDS La presenza di un forte detergente anionico (l SDS, sodio dodecil solfato) e il ph fortemente basico determina la rottura della parete cellulare e la denaturazione del DNA cromosomiale. Il DNA plasmidico, sebbene la soluzione alcalina distrugga l appaiamento delle basi nel genomico, rimane intatto (se vengono rispettati i tempi!) a causa della sua topologia (anche il DNA plasmidico si denatura ma i due filamenti di DNA rimangono connessi l uno all altro come se fossero due anelli l uno nell altro). Micropipitte con puntali Bagnetto termostatato

7 5. Aggiungere 10 µl di soluzione di proteasi alcalina, invertire 4 volte e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Proteasi alcalina Sostanzialmente l SDS denatura il DNA cromosomiale perché essendo più grande lo attacca prima. Se si lascia più tempo c è il rischio che anche il DNA plasmidico possa essere degradato. Micropipitte con puntali 6. Aggiungere 350 µl di Neutralization Solution e mescolare per inversione (no vortex!) delicatamente 7 8 volte. Neutralization Solution 1.32 M potassio acetato ph 4.8 Nota: il ceppo TOP10 è EndAperciò bastano 350 µl di soluzione, in caso di ceppi EndA+, aggiungere 400 µl e attendere 10 min a temperatura ambiente prima di centrifugare. Il DNA genomico denaturato forma dei grandi complessi ricoperti da SDS. Questi macrocomplessi precipitando inglobano anche carboidrati e proteine. EndA indica la mancanza del gene che codifica per le endonucleasi. Il ceppo TOP10 EndA è un ceppo ingegnerizzato! Micropipitte con puntali 7. re a rpm per 10 min. 8. Trasferire tutto il surnatante in una colonnina Wizard. Colonnine Wizard per purificazione DNA plasmidico In questo passaggio il DNA genomico denaturato e i detriti cellulari precipitano. 9. re a rpm per 1 min. Il DNA plasmidico passa attraverso la colonnina e rimane attaccato alla membrana, mentre il resto passa attraverso il filtro finendo sul fondo

8 10. Scartare l eluato 11. Aggiungere 750 µl di Washing Solution e centrifugare a rpm per 1 min 12. Scartare l eluato 13. Aggiungere 250 µl di Washing Solution e centrifugare a rpm per 1 min. 14. Scartare l eluato. Washing Solution 80 mm potassio acetato 8.3 mm Tris HCl 40 µm EDTA aggiungere etanolo prima dell utilizzo. della provetta. Il tampone Washing Solution serve per lavare la membrana a cui si è legato il DNA e a ripulirla da eventuali impurità che si sono legate nel passaggio precedente. Questo passaggio permette di eliminare l eccesso di sali che sono precipitati con il DNA (è un lavaggio). Micropipette con puntali Micropipette con puntali 15. re di nuovo a rpm per 2 min. 16. Trasferire la colonnina in una provetta da 1.5 ml e aggiungere al centro della colonna 40 µl di 10 mm TrisHCl ph 8 oppure acqua deionizzata 17. Incubare 1 min a temperatura ambiente 18. re a rpm per 2 min. Tampone 10 mm TrisHCl ph 8 L acqua non deve contenere nucleasi che possono rompere il DNA. Nota: fare attenzione a non toccare la membrana con il puntale Questo passaggio serve per eliminare completamente le tracce di etanolo presenti nella Washing Solution e che possono essere rimaste sulla membrana. Questo passaggio serve per permettere al tampone di diffondersi nella membrana e di staccare il DNA. In questo passaggio il DNA viene eluito, rimanendo in soluzione; non precipita. Micropipette con puntali

9 FASE 4: Controllo del DNA mediante elettroforesi su gel d agarosio 1 Metodo materiali motivazioni Strumenti 1. Sciogliere 1 g di agarosio in 100 ml di tampone TAE 1X. Agarosio per biologia molecolare 100 ml di gel sono sufficienti per una cella elettroforetica di medie dimensioni, Bunsen oppure microonde. per una cella piccola calcolare 70 ml/gel 50X tampone TAE 2. Portare la miscela ad ebollizione 242 g Tris base 57.1 ml Acido Acetico Glaciale 100 ml EDTA 0.5 M Portare il volume a un litro con dh 2 O e autoclavare. 3. Lasciare raffreddare e aggiungere 10 µl di SYBR GREEN (diluizione 1:10.000) SYBR GREEN (Molecular Probes), agente intercalante Il sybr green si lega al DNA e lo colora. Le bande colorate possono essere viste con un transilluminatore a luce blu. Il sybr green è un colorante del DNA alternativo all etidio bromuro che, essendo mutageno, presenta rischi per la manipolazione e l eliminazione. Il sybr green ha passato i test di laboratorio e non presenta attività mutagena o ha attività veramente molto Micropipetta con puntali

10 4. Predisporre la cella elettroforetica sigillando i lati della slitta con del nastro adesivo da autoclave e posizionando il pettine. Versare il gel nella slitta e lasciare solidificare. Nastro adesivo da autoclave bassa tanto da non essere classificato come rifiuto pericoloso dalla U.S. Federal regulations. Va in ogni caso maneggiato con le dovute attenzioni. Camera elettroforetica e pettine per pozzetti 5. Trasferire 12 µl di DNA estratto in una provetta pulita, aggiungere 4 µl di tampone di caricamento. 6X Tampone di Caricamento per campioni di DNA 0.25 % (w/v) blu di bromofenolo 0.25% (w/v) xilene cianolo 30% (w/v) glicerolo in dh 2 O I coloranti presenti nel tampone servono per valutare la migrazione del DNA che essendo incolore non si vede. Lo xilene (azzurro) migra lentamente, come un frammento di DNA di circa 4000 pb, mentre il blu di bromofenolo migra più velocemente, come un frammento di DNA di circa 300 pb. Oltre alla banda blu può esserci una banda gialla dovuta alla dissociazione del blu di bromofenolo o alla presenza di qualche altro componente nella miscela La corsa va fermata quando la banda blu è a 1 o 2 cm dalla fine del gel. Il glicerolo serve per rendere più densa la soluzione di DNA e farla entrare meglio nel pozzetto. Micropipetta con puntali

11 6. Posizionare la cella su un cartone nero e caricare tutti i 16 µl di campione di DNA + il tampone in un pozzetto. Oltre ai campioni di DNA estratti dalle cellule trasformate possono essere caricati anche: DNA plasmidico puro, come controllo 1 kb DNA ladder, come marcatore della dimensione delle molecole di DNA (2 µl marker +2 µl loading dye + 8 µl d H 2 O) estratti da cellule non trasformate Avviare la corsa elettroforetica: con voltaggio V, il tempo della corsa è di circa 40 minuti. 7.Trasferire il gel sulla piastra del transilluminatore a luce blu e procedere all osservazione e alla lettura delle bande Nota: se il campione caricato dovesse risalire dal pozzetto (per presenza di etanolo nel campione)), aggiungere altri 4 µl di tampone di caricamento. Generatore di voltaggio Safe Imager