CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE MALATTIA DI AUJESZKY (Dirigente Responsabile Dr. Paolo Cordioli)

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1 CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE MALATTIA DI AUJESZKY (Dirigente Responsabile Dr. Paolo Cordioli) Allegato 1 +3 Relazione sull attività dell anno 2009 Piano di attività per l anno Obiettivi strategici L attività del Centro di Referenza, con sede presso il reparto di Virologia di Brescia, per il periodo ha riguardato il monitoraggio nei confronti dell infezione da virus della malattia di Aujeszky degli allevamenti ubicati nei territori di competenza dell IZSLER. Il Centro di Referenza ha provveduto nell anno 2009 all organizzazione di un ring test in modo da monitorare nel tempo le prestazioni dei laboratori coinvolti nel piano di sorveglianza sierologica della Malattia di Aujeszky. Inoltre, sono stati ottenuti risultati preliminari sulle condizioni favorenti la circolazione virale all interno degli allevamenti e che permetteranno la formulazione di un protocollo per il raggiungimento ed il mantenimento dello stato d indennità. 2. Attività Diagnostica 2.1. Validazione di metodiche diagnostiche. Nell anno 2009 è stata allestita una nuova metodica sierologica, impiegando un ceppo virale, denominato PrioCHECK PRV gb NIA-3 antigen, fornito dal dr. L. Jacobs della ditta Prionics Lelystad. Il virus è stato coltivato sulla linea cellulare SK-6, anch essa fornita dalla ditta olandese, mantenute in coltura in terreno DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium), con aggiunta di siero fetale bovino al 5% e antibiotici penicillina e streptomicina all 1%. Per la produzione dell antigene sono state infettate diverse bottiglie rotanti di cellule SK-6 a monostrato preformato e ad effetto citopatico completo le bottiglie sono state sottoposte ad un ciclo di gelo/scongelo. Il criolisato è stato, quindi, raccolto e centrifugato per 10 min a 800 rpm ed il surnatante centrifugato per 3 ore a rpm. Rimosso il surnatante, il pellet è stato risospeso in PBS addizionato di Triton X100 allo 0,5% concentrando X50 rispetto al volume di partenza. L antigene parzialmente purificato è stato, quindi, impiegato in una metodica ELISA competitiva per la ricerca di anticorpi verso la glicoproteina E (ge) del virus della Malattia di Aujeszky, per l adsorbimento delle micropiastre e impiegando come anticorpo di rilevazione (anticorpo marcato) un anticorpo monoclonale specifico (3E3). Il vantaggio di questa metodica è la rapidità di esecuzione ed, attualmente, è in corso la validazione. Nell ambito della diagnostica virologica, inoltre, sono state valutate diverse metodiche per la ricerca del genoma virale, tra cui le metodiche PCR descritte da Katz and Pedersen (1992) che amplifica una porzione del gene della glicoproteina gi e della timidino-kinasi, Jacobs et al. (1997) per la glicoproteina ge e la metodica real time PCR descritta da Ma et al. (2008) anch essa ge specifica, che è risultata essere più sensibile. Durante il 2009 sono

2 state effettuate prove per la messa a punto della metodica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), un metodo di amplificazione degli acidi nucleici, che amplifica DNA con alta specificità, sensibilità e rapidità in condizioni isotermiche (60-65 C). L amplificazione e la rilevazione della sequenza d interesse sono completate in un singolo step, incubando i campioni, i primer e la DNA polimerasi ad una temperatura costante di 63 C. La reazione procede a temperatura costante usando la reazione di dislocazione della catena dell acido nucleico (strand displacement). Comparata con la PCR tradizionale, la reazione LAMP mostra una maggiore sensibilità e specificità attribuita ad amplificazioni continue in condizioni isotermiche ed all utilizzo di 6 differenti primer specificatamente studiati per riconoscere 8 distinte regioni del gene target. La LAMP è una tecnica di amplificazione genica innovativa, che si è diffusa in modo particolare dal 2003 dopo le emergenze dei virus West Nile e SARS. Da allora la tecnica LAMP è stata applicata con successo nella diagnosi clinica di virus a DNA ed RNA, batteri e parassiti. Per la Malattia di Aujeszky sono stati utilizzati 6 primer che amplificano un frammento di 188 bp del gene DNA-binding protein (DBP). I prodotti amplificati possono essere separati in gel di agarosio all 1,5% in 0,5x TBE buffer a 120V per 1h e visualizzati tramite colorazione con SYBR Green (Fig. 1). Fig. 1: prodotto LAMP di PRV su gel di agarosio. Il prodotto amplificato LAMP non corrisponde ad una singola banda, ma ad una serie di bande stratificate, dato che il metodo LAMP può formare prodotti amplificati di diverso peso molecolare consistenti in ripetizioni invertite in modo alternato della sequenza target. I risultati possono essere anche visualizzati direttamente ad occhio nudo in base al precipitato bianco di magnesio pirofosfato generato nella reazione (Fig. 2) o alla colorazione verde prodotta attraverso l intercalazione della colorazione con Picogreen (Invitrogen, USA) (Fig. 3).

3 A. Torbidità B. Colorazione ad occhio nudo C. Colorazione in fluorescenza Fig. 2 e 3: Tubi contenenti prodotto amplificato LAMP, visualizzato in base alla torbidità del magnesio pirofosfato (A), in presenza di colorante fluorescente visualizzato ad occhio nudo (B) o illuminato alla lampada UV (C). Per confermare la specificità del prodotto di amplificazione, inoltre, 2μl della miscela di reazione sono stati digeriti con Hinc II a 37 C per 4h (Fig. 4). Fig. 4: reazione LAMP dopo digestione con Hinc II. Come riportato in bibliografia, la sensibilità della metodica LAMP risulta essere volte superiore a quella della PCR tradizionale. 2.2 Attività analitica Le indagini sierologiche eseguite nel 2009 per la ricerca del virus della malattia di Aujeszky hanno evidenziato una percentuale del 11,8% di risultati positivi (Tab. 1). Nell anno 2009 è stato isolati un ceppo di virus della Malattia di Aujeszky da un suino e un ceppo da un cervello di cane.

4 Tabella 1: Risultati delle indagini sierologiche e virologiche nei suini relative al periodo 1/12/ /11/2009 Reparto Virologia Sezioni provinciali dell IZSLER Esaminati Positivi % Esaminati Positivi % gb anticorpi ,9% ,7% ge anticorpi ,8% ,1% Indagini virologiche ,4% 0 PCR ,9% Immunofluorescenza Le indagini sierologiche sono state eseguite anche su cinghiali selvatici, che hanno evidenziato una positività del 29% nel periodo considerato (Tab. 2). Tabella 2: Risultati delle indagini sierologiche nei cinghiali relativi al periodo 1/12/ /11/2009 Reparto Virologia Esaminati Positivi % gb anticorpi ,1% ge anticorpi % 2.3 Circuiti interlaboratorio organizzati dal C. d. R Nel corso dell anno 2009 è stato organizzato un ring test per la diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky, in cui sono stati impiegati i sieri dei suini delle infezioni sperimentali descritte nelle relazioni degli anni precedenti. Il pannello comprendeva 50 sieri, positivi e negativi per anticorpi anti-prv, in provette contenenti 0.5 ml di siero e identificate con numeri progressivi da 1 a 50. Al ring test hanno partecipato 21 laboratori delle 10 sedi centrali degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali dislocati su tutto il territorio nazionale. Ad ogni laboratorio partecipante è stato assegnato un numero identificativo del singolo laboratorio e che verrà utilizzato nel report finale. I risultati dovranno essere inviati entro il 12 febbraio 2010 ed i dati ottenuti dai singoli laboratori saranno trasmessi all Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regione Lombardia (OEVRL), che provvederà ad aggregarli ed analizzarli. Nel 2010 sarà, quindi, prodotto il report relativo al ring test 2009, che verrà distribuito ad ogni laboratorio partecipante e che ci consentirà di ottenere ulteriori informazioni sulle metodiche ELISA impiegate dai diversi laboratori ubicati sul territorio italiano e di monitorare nel tempo i livelli di competenza tecnica dei laboratori che effettuano la diagnosi sierologica della Malattia di Aujeszky mediante la metodica ELISA. Nel 2010, inoltre, sarà organizzato un circuito interlaboratorio che prevederà l esame di un pannello di campioni positivi e negativi per il virus della Malattia di Aujeszky. I laboratori

5 interessati potranno partecipare ed impiegare le metodiche in uso per la diagnosi virologica della Malattia di Aujeszky presso il proprio laboratorio. 3. Ricerca e sperimentazione A. Infezioni sperimentali Presso il Reparto di Virologia ed in collaborazione con il Reparto Animali da Laboratorio è stata eseguita un infezione sperimentale per la produzione di sieri di riferimento. Sperimentazione anno 2008: prima dell inizio della sperimentazione, i sieri di tutti gli animali oggetto dello studio, sono stati testati con esito negativo per la presenza di anticorpi anti-virus di Aujeszky. Tre suini SPF sono stati vaccinati per via intramuscolare con un vaccino inattivato ge-deleto del commercio e posti a contatto con altri due suini SPF. Dopo 30 giorni tutti i suini sono stati sottoposti ad infezione sperimentale con TCDI50/narice di un ceppo ADV di campo /2006 isolato da un suino in magronaggio nella provincia di Brescia. I prelievi ematici sono stati effettuati 26 giorni dopo l intervento vaccinale, a 11gg post-infezione e, al momento dell eutanasia, a 24 giorni per i suini precedentemente vaccinati ed a 25 giorni post-infezione per i suini non vaccinati. La produzione di questi sieri ha integrato la collezione di sieri a titolo anticorpale differente (comprendente sieri precoci, sieri da vaccinazione e sieri da infezione in animali vaccinati e non vaccinati) ottenuti da infezioni sperimentali in suini SPF effettuate in precedenza. B. Monitoraggio al macello In collaborazione con i servizi veterinari ASL competenti per territorio è stato predisposto un piano di sorveglianza sierologica e virologica al fine di ottenere informazioni sullo stato immunitario degli animali inviati al macello e regolarmente macellati e di valutare la corretta applicazione e l efficacia del piano di vaccinazione e di stimare l incidenza del fenomeno della latenza. Nel periodo 30/9/2008 e 27/2/2009 sono stati prelevati 20 campioni di sangue suino di 69 partite macellate presso il macello Mec-Carni di Marcaria (MN), per un totale di 1380 sieri. Questo lavoro è stato effettuato dal Dr. Loris Alborali della Sezione Diagnostica dell IZSLER in collaborazione con colleghi liberi professionisti. Presso il reparto di Virologia è stata, quindi, condotta la ricerca di anticorpi verso la glicoproteina B ed E (gb e ge) della Malattia di Aujeszky, tramite metodica ELISA competitiva (Tab. 3). 01/09/ /08/2009 Esaminati Positivi % gb anticorpi ,4% ge anticorpi ,8%

6 Tab. 3: Risultati delle indagini sierologiche condotte nel periodo 01/09/ /08/2009 in suini in sede di macellazione. Nel corso del 2009 sono state sottoposte a monitoraggio sierologico complessivamente 69 partite di suini prelevati in sede di macellazione, di cui 23, pari al 33,3%, con soggetti positivi alla Malattia di Aujeszky. Tra le partite esaminate tre allevamenti presentavano un solo animale sieropositivo per anticorpi verso ge. Un ulteriore analisi di questi allevamenti ha evidenziato che possa trattarsi di animali single reactor, in quanto provenienti da allevamenti indenni per SHV-1. Fra gli allevamenti negativi per anticorpi verso ge, uno è risultato negativo anche in gb, a testimonianza del fatto che possono giungere in sede di macellazione animali non vaccinati o vaccinati non correttamente. C. Monitoraggio in allevamento. In questa fase del progetto sono state condotte indagini sulla presenza di single reactor (SR) animali sieropositivi verso la glicoproteina E della Malattia di Aujeszky in allevamenti indenni da SHV1. Questo fenomeno, che sembrerebbe un evento indipendente da quello della latenza e che richiede ulteriori studi per comprendere meglio il ruolo e l importanza nell epidemiologia della malattia, rappresenta un importante minaccia al programma di eradicazione della malattia. E quindi importante determinare se questi suini sono solo falsi positivi al test sierologico ge o se sono di fatto animali infetti con un ceppo di campo di SHV-1. Da suini SR la cui sieropositività è stata svelata durante l attività di monitoraggio sierologico e destinati alla macellazione è stato prelevato il ganglio del trigemino. Successivamente, presso il reparto di Virologia, sono state effettuate indagini virologiche tramite co-coltura e PCR, con esito negativo. In particolare è stata utilizzata una metodica PCR ge specifica, descritta da Jacobs et al. (1999), con la quale è possibile distinguere tra suini single-reactor infetti e animali sierologicamente falsi positivi al test ge. Per eseguire le indagini di tipo epidemiologico è stata predisposta una scheda, denominata Biosicurezza e infezione da virus Aujeszky, che ha la finalità di valutare le caratteristiche dell allevamento e l applicazione delle norme di biosicurezza. Il questionario sarà compilato durante la raccolta dei campioni oppure in seguito a comparsa di focolai e per i sopralluoghi negli allevamenti ubicati nelle strette vicinanze di allevamenti in cui si è verificato il focolaio. D. Monitoraggio sierologico nei cinghiali ed eventuale tipizzazione dei ceppi virali isolati da questi. Considerato che il cinghiale può divenire un reservoir selvatico del virus importante in caso di eradicazione dell infezione dal suino domestico, è stata valutata l incidenza dell infezione da PRV in questa specie tramite indagini sierologiche per la ricerca di anticorpi diretti nei confronti della glicoproteina E (ge) e indagini virologiche tramite isolamento in coltura cellulare (Tab. 4).

7 01/09/ /08/2009 Esaminati Positivi % ge anticorpi ,8% Indagini virologiche Tab. 4: Risultati delle indagini sierologiche e virologiche condotte presso il reparto di Virologia nel periodo 01/09/ /08/2009 nei cinghiali del territorio di competenza dell IZSLER. Le indagini sierologiche che sono state eseguite su cinghiali selvatici hanno evidenziato una positività del 18,8% nel periodo considerato, confermando il ruolo del cinghiale come reservoir selvatico di SHV-1. Nessun isolamento virale è stato ottenuto dalle indagini virologiche condotte su organi e tessuti conferiti presso il laboratorio. 4. Aggiornamento e formazione professionale 4.1. Convegni/congressi che il C. d. R. ha organizzato o a cui ha partecipato TITOLO Convegno-Corso etc. 3 rd ESVV Veterinary Herpesvirus Symposium ENTE organizzatore Friedrich-Loeffler Institut LOCALITA' evento Greifswald- Insel Riems Data Aprile 2009 TITOLO relazione 5. Consulenze, attività di docenza, collaborazioni nazionali TITOLO Convegno-Corso etc. Piani regionali di controllo ad adesione volontaria per IBR e Malattia di Aujeszky: risultati e criticità evidenziate in corso d opera ENTE organizzatore IZS LOCALITA' evento Torino Data 27 Ottobre 2009 TITOLO relazione Principali malattie da herpesvirus in animali da reddito: malattia di Aujeszky ed IBR 6. Pubblicazioni scientifiche e divulgative Durante l anno 2009 sugli Atti del 3 rd ESVV Veterinary Herpesvirus Symposium è stata pubblicata una comunicazione scientifica, il cui titolo è Comparison among different

8 serological ge ELISA kits for Aujeszky s disease by testing sera from experimental infections. 7. Sito Web Le pagine dedicate al Centro di Referenza per la Malattia di Aujeszky-Pseudorabbia (CRMA), pubblicate sul sito dell IZSLER nella sezione dedicata ai Centri di referenza e consultabile all indirizzo è stato aggiornato ed stata inserita una galleria fotografica degli effetti citopatici che manifesta il virus della Malattia di Aujeszky in diverse colture cellulari, primarie e continue, sia di origine suina che non. Obiettivo del 2010 sarà predisporre una pagina web dove poter iscriversi ed accedere all attività delle prove interlaboratorio on line.