Stress ossidativo e integrazione alimentare. Raffaella Cocco Facoltàdi Medicina Veterinaria di Sassari

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1 Stress ossidativo e integrazione alimentare Raffaella Cocco Facoltàdi Medicina Veterinaria di Sassari

2 La ricerca sul significato del termine benessere animale e sullapossibilitàdi quantificarlo e valutarlo scientificamente si èsviluppata inizialmente sulla base di una serie di considerazioni, relative agli allevamenti intensivi, estese poi a tutti i tipi di animali, compresi i piccoli animali. Queste considerazioni hanno determinato l esigenza di utilizzare metodologie adeguate per valutare la possibilitàdi adattamento degli animali alle tecnologie di allevamento e di gestione da parte dell uomo, e le conseguenze di queste sulla loro omeostasi complessiva, quindi sul loro livello di benessere.

3 Con il termine adattamento si indica la risposta morfofisiologica degli esseri viventi agli stimoli dell ambiente e quindi adattarsi significa avere il controllo della stabilità fisica e mentale (Broom 1986). Il benessere si riferisce quindi a caratteristiche misurabili dell individuo e varia lungo un continuum da molto buono a molto carente. Condizioni di benessere molto carente influiscono sia sul comportamento degli animali sia sulla loro fisiologia, potendo determinare stati prepatologici o addirittura patologici.

4 Il tema del benessere animale èpiùche mai attuale visto anche il Trattato di Lisbona ratificato ed eseguito con legge 2 agosto 2008, n. 130 sancisce che l'unione Europea e gli Stati membri tengano conto delle esigenze in materia di benessere degli animali in quanto esseri senzienti

5 In medicina umana la lotta contro le malattie ha determinato un aumento della vita media delle popolazioni; da ciò èsuccessivamente scaturita l esigenza di migliorare anche la qualitàdella vita dei pazienti, oggi un grande impegno e notevoli risorse sono destinati proprio a questo obiettivo. Anche nel campo della medicina veterinaria si è registrato un incremento della vita media dei piccoli animali ma, relativamente alla qualitàdella loro vita, il dibattito èancora all inizio, sia pur favorito dall evolversi della discussione sulla relazione uomo-animale.

6 Da millenni il cane èconsiderato il migliore amico dell uomo:ottimo strumento di difesa e valido aiuto nella vita quotidiana:basti pensare ai cani impiegati dalla polizia,dalla finanza,dai gruppi di protezione civile, e non ultimi nella pet therapy (Interventi Assistiti dagli Animali). Per svolgere questi servizi è necessario che l animale abbia una forza,resistenza e attitudine a sopportare tale lavoro;tutto questo gli viene fornito da un buon grado di allenamento e da una corretta alimentazione.

7 Le condizioni di impegno dell organismo sono naturalmente differenti,sia in senso qualitativo che quantitativo, a seconda del tipo e dell intensità del lavoro svolto. Un alimentazione equilibrata è dunque essenziale per la copertura del fabbisogno energetico e plastico dell organismo e va commisurata alle sue specifiche necessità: tipo ed entità delle attività svolte,condizioni ambientali,età,razza,sesso etc. Nello stesso tempo non bisogna dimenticare che il lavoro e la competizione inducono,al pari di altri fattori,uno stress fisiologico e psicologico,pertanto questo si ripercuote anche sull alimentazione,che rischia di essere carente o eccedente.

8 La ricerca scientifica e la maggiore divulgazione delle recenti scoperte hanno reso la popolazione dei paesi industrializzati sempre piùconsapevole del ruolo che alcuni alimenti o loro costituenti possono avere nel mantenere lo stato di salute. Com ènoto, il regime alimentare influisce, talvolta in modo sensibile, sulla salute degli animali. Esso può comportare tanto carenza acuta o cronicadi nutrienti essenziali quanto eccessi e squilibri nutrizionali individuati quali fattori di rischio per l insorgenza di malattie metaboliche e degenerative.

9 Tra i vari meccanismi con cui componenti alimentari della dieta possono influire positivamente sullo stato di salute, particolarmente importante appare la modulazione del bilancio ossidanti/antiossidanti nell organismo. Reazioni ossidative avvengono costantemente come parte integrante del metabolismo, e normalmente la produzione di radicali liberi da esse derivata ècontrobilanciata da una serie di molecole definite antiossidanti.

10 Lo stress ossidativo è un tipo particolare di stress chimico indotto dalla presenza in un organismo vivente di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate sull ossigeno (Reactive Oxygen Species ROS), secondario ad un aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta efficienza dei fisiologici sistemi di difesa antiossidanti.

11 Stress ossidativo Dal punto di vista biochimico: i radicali liberi sono molecole particolarmente instabili (possiedono un solo elettrone anzichédue). Questo li porta a cercare un equilibrio appropriandosi di un elettrone delle altre molecole con cui vengono a contatto, molecole che a loro volta divengono instabili e ricercano un elettrone, si innesca un meccanismo a catena

12 Stress ossidativo Lo sbilanciamento tra la produzione di ossidanti e la capacitàantiossidante dell organismo può portare ad una condizione di stress ossidativo.

13 I principali meccanismi con cui i radicali liberi, non contrastati efficacemente dal sistema antiossidante, possono provocare condizioni patologiche sono: La perossidazione lipidica. Èun processo durante il quale i lipidi contenenti acidi grassi insaturi e i loro esteri vengono direttamente ossidati dall ossigeno molecolare. Èun evento dannoso capace di propagarsi mediante una reazione a catena L azione mutagena sul DNA: I radicali liberi prodotti dai fagociti possono indurre la rottura delle catene di DNA ed essere causa di aberrazioni cromosomiche. L apoptosi:èun meccanismo di morte cellulare che permette il ricambio cellulare dei tessuti. Molti degli agenti che inducono l apoptosi sono ossidanti oppure attivatori del metabolismo ossidativo cellulare e molte sostanze capaci di inibire l apoptosi sono antiossidanti. L apoptosi indotta da radicali liberi svolge un ruolo patogeneticoimportante nelle infezioni. La proteolisi incontrollata: Il principale inibitore delle proteasi, l alfa-1-antitripsina, ricopre un ruolo cruciale nella protezione dei tessuti dagli enzimi proteolitici, ma èestremamente sensibile all inattivazione da parte di sostanze ossidanti. L attivazione cronica dei fagociti può pertanto condurre ad uno squilibrio tra le proteasi e i loroinibitori tessutali, a vantaggio delle prime, con conseguente proteolisi tissutale incontrollata.questo èprobabilmente uno dei meccanismi responsabili del danno tessutale che si osserva in corso di infiammazioni e infezioni croniche.

14 I principali meccanismi con cui i radicali liberi, non contrastati efficacemente dal sistema antiossidante, possono provocare condizioni patologiche sono: La disfunzione immunitaria: I radicali ossidanti prodotti dai fagociti e rilasciati nello spazio extracellulare inibiscono la chemiotassi, la fagocitosi e l attività antimicrobica dei fagociti circostanti. Sembra inoltre che inibiscano la proliferazione del linfociti T e B, così come l attività delle cellule natural killer. I radicali liberi svolgono un ruolo importante nella difesa dalle infezioni poiché possono danneggiare e uccidere i microrganismi attraverso la per ossidazione lipidica (con conseguente denaturazione delle membrane batteriche), il danneggiamento del DNA e l ossidazione dei citocromi (con arresto della respirazione mitocondriale).

15 Possiamo avere diverse cause di riduzione delle difese antiossidanti una ridotta assunzione di antiossidanti, come nel caso di ipovitaminosi e diete sbilanciate; un ridotto assorbimento di antiossidanti, nelle sindromi da malassorbimento e nella malattia celiaca; una ridotta capacitàdi utilizzazione di antiossidanti, nei deficit dei meccanismo di trasporto o di captazione; una insufficienza dei sistemi enzimatici antiossidanti, per fattori genetici o iatrogeni; un eccessivo consumo di antiossidanti, per eccessiva produzione di specie reattive; per assunzione di farmaci, per sovraccarico del sistema microsomiale.

16 I fattori che influenzano un iperproduzione di radicali liberi possono essere: diete sbilanciate : obesità, diete povere di vitamine e proteine ad alto valore biologico; esercizio fisico intenso: caccia, corsa, mostre ed agility; malattie croniche debilitanti: Leishmaniosi, IRC, diabete, parassitosi, tumori, gastropatie, epatopatie; stati fisiologici: gravidanza, lattazione, vecchiaia; Farmaci: terapie antibiotiche prolungate, postoperatorio.

17 Per valutare lo stress ossidativo è possibile adottare una doppia strategia di azione: valutare il grado di attacco dell organismo,attraverso diversi test come il d-roms test, MDA, LPO, F2-isoprostani plasmatici;valutare il grado di difesa dell organismo attraverso OXY-Absorbent test, FRAP,BAP test, TAS, SHp test. Occorre sempre effettuare una prevenzione ed un monitoraggio delle malattie correlate con lo stress ossidativo.

18 Nel cane che lavora, gli stress indotti da sforzo fisico, concentrazione mentale e condizioni ambientali sono tanto più nocivi in quanto si accumulano a livello dell organismo dell animale e finiscono per generare problemi comportamentali o patologici molto specifici (modificazioni neurovegetative, disturbi digestivi, anemia detta dello sportivo, disturbi endocrini ).

19 Le ricerche condotte in questi ultimi anni hanno chiaramente dimostrato che questi radicali liberi sono implicati in numerose affezioni riguardanti il cane da lavoro (patologie muscolari, articolari, digestive e cardiache).

20 Il progetto si pone come fine di valutare l azione antiossidante in vivo di un alimento nella sua complessità costitutiva. Lo scopo di questo studio era quello di dimostrare se e quanto gli antiossidanti contenuti nell alimento siano efficaci nel mantenimento in vivo delle capacità antiossidanti cellulari in condizione di assunzione nutrizionale.

21 19 cani anziani T0 (settembre 2010) visita clinica e prelievo di sangue per l effettuazione di alcuni esami: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea); test sierologici (Immunofluorescenza indiretta) per valutare la positività per alcune patologie che presentano una particolare diffusione in Sardegna (Leishmaniosi, Ehrlichiosi, Rickettsiosi, Anaplasmosi, Bartonellosi). Visita cardiologia completa, test di Uchino per valutazione deficit cognitivi, gli animali con deficit cognitivi verranno sottoposti a risonanza magnetica, per valutare alterazioni legate a patologie neurodegenerative del cane anziano. Verranno effettuati Il d-roms test per la determinazione dei ROS, ed in particolare degli idroperossidi plasmatici, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) test per la valutazione della barriera antiossidante plasmatica totale. I cani nei quali sarà evidente lo stress ossidativo saranno divisi in due gruppi uno alimentato con mangime arricchito con antiossidanti e l altro (gruppo controllo) alimentato con un mangime di mantenimento per cani anziani. T1( maggio 2011) Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) T2: (giugno 2011) Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) T3 (luglio 2011) Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential)

22 24 cani da caccia, razza Segugio Maremmano. T0: visita clinica e prelievo di sangue per l effettuazione di alcuni esami: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea); test sierologici (Immunofluorescenza indiretta) per valutare la positività per alcune patologie che presentano una particolare diffusione in Sardegna (Leishmaniosi, Ehrlichiosi, Rickettsiosi, Anaplasmosi, Bartonellosi). Verranno effettuati Il d-roms test per la determinazione dei ROS, ed in particolare degli idroperossidi plasmatici, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) test per la valutazione della barriera antiossidante plasmatica totale. T1 (prima giornata di caccia grossa,): 25 cani da caccia, razza Segugio Maremmano. Verranno effettuati Il d-roms test per la determinazione dei ROS, ed in particolare degli idroperossidi plasmatici, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) test per la valutazione della barriera antiossidante plasmatica totale. I cani nei quali sarà evidente lo stress ossidativo saranno divisi in due gruppi uno alimentato con mangime arricchito con antiossidanti e l altro (gruppo controllo) alimentato con un mangime di mantenimento per cani adulti, lo stile di vita e l allenamento saranno mantenuti uguali nei due gruppi. T2 dopo 45 giorni di alimentazione controllata Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) T3 dopo 45 giorni di alimentazione controllata Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential)

23 10 cani coterapeuti T0 (prima dell inizio attività)visita clinica e prelievo di sangue per l effettuazione di alcuni esami: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea); test sierologici (Immunofluorescenza indiretta) per valutare la positività per alcune patologie che presentano una particolare diffusione in Sardegna (Leishmaniosi, Ehrlichiosi, Rickettsiosi, Anaplasmosi, Bartonellosi). Verranno effettuati Il d-roms test per la determinazione dei ROS, ed in particolare degli idroperossidi plasmatici, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) test per la valutazione della barriera antiossidante plasmatica totale. T1 (ottobre 2010) Verranno effettuati Il d-roms test per la determinazione dei ROS, ed in particolare degli idroperossidi plasmatici, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) test per la valutazione della barriera antiossidante plasmatica totale. I cani nei quali sarà evidente lo stress ossidativo saranno divisi in due gruppi uno alimentato con mangime arricchito con antiossidanti e l altro (gruppo controllo) alimentato con un mangime di mantenimento per cani adulti, lo stile di vita e l allenamento saranno mantenuti uguali nei due gruppi. 6 sessioni di TAA/AAA alla settimana, della durata di 30 minuti ciascuna. Il lavoro nelle sedute di TAA richiede un intenso impegno sia dal punto di vista fisico che mentale; infatti la complessità della comunicazione richiede il riconoscimento di un livello cognitivo che permetta la sua applicazione. Nella terapia assistita dagli animali l interazione tra l animale e l uomo è molto elevata, richiede quindi da parte del cane un alto grado di socializzazione, di educazione, di istruzione e di addestramento. Le richieste che ciascun cane è chiamato a soddisfare durante una seduta sono: vieni, seduto, terra, resta, sali su, scendi da, abbaia, cuccia, zampa, porta, lascia, libero, destra, sinistra, dietro, fermo, fai il morto, rotola, gira, prendi, sopra, sotto, in piedi (su due zampe), pancia, inchino, batti 5, apri, saluta, luce (accendi spegni), salta, ecc. T2 (dicembre 2010) Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential) T3 ( febbraio 2010) Rivalutazione nei due gruppi di cani: emocromo, elettroforesi delle proteine sieriche, e profilo metabolico completo (albumina, ALP, amilasi, bilirubina tot., calcio, colesterolo, CPK, creatinina, fosforo, GGT, glucosio, GOT, GPT, lipasi, proteine totali, trigliceridi, urea), d-roms test, ed il BAP (Biological Antioxidant Potential)

24 Metodiche Il d-rom s Test determinazione dei ROS, ed in particolare degli idroperossidi plasmatici. Il d-rom s Test dosato in Unità Caratelli. ( U-CARR). È oggi di frequente uso e di facile attuazione negli studi policentrici, utilizzato e consigliato come test di base per tutti i protocolli di studio dello stress ossidativi del paziente e nel controllo delle terapie. Tale esame non misura la quantità di radicali liberi ma i derivati del perossido di idrogeno che ne rappresentano una formazione spia del loro passaggio. Tale esame permette però di valutare lo stato ossidativo in generale indicando uno stato di Stress ossidativo di base. Valore di riferimento nel cane: U.CARR Il valore di 1U.CARR corrisponde ad una concentrazione di perossido di idrogeno di 0.08 mg%. I valori del d-rom s test : - valore di riferimento: U.CARR - valore di soglia border line: U.CARR - condizione di lieve stress ossidativo : U.CARR - condizione di stress ossidativo : U.CARR - condizione di forte stress ossidativo : U.CARR - fortissimo stress ossidativo: oltre 300 U.CARR

25 Metodiche Il BAP (biological antioxidant potential) test valuta il potere antiossidante del plasma in termini di capacitàdi quest ultimo di ridurre gli ioni ferrici a ioni ferrosi, rilevando per via fotometrica le variazioni cromatiche di un apposito cromogeno. Nel plasma èidentificabile una vera e propria barriera antiossidante, alla cui costituzione contribuiscono sostanze sia assunte dall esterno con l alimentazione (es. carotenoidi, ascorbato, vitamina E, ecc.) che prodotte dall organismo (es. GSH, proteine bilirubina, acido urico, ecc.). Ognuno di questi componenti, essendo in grado di donare,sebbene in diversa misura, elettroni, blocca la potenziale lesivitàdei radicali liberi, la cui reattivitàèproprio legata alla particolare carenza di queste piccole particelle negative.

26 VARIAZIONI DI d-roms d E BAP IN RELAZIONE AL MANGIME SOMMINISTRATO

27 CAMBIO DI ALIMENTAZIONE CANI CO-TERAPEUTI GRUPPO ADDIZIONATI GRUPPO cani co-terapeuti alimentati con mangime addizionato: variazioni dei valori di d-roms e BAP dopo il cambio di alimentazione

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33 RISULTATI PROFILI METABOLICI PARAMETRI ALB 2-3,3 g/dl ALP 1,5-90 U/L AM U/L BT 0,05 0,5 mg/dl CAL 8-10 mg/dl COL mg/dl CPK U/L CRE 0,5-1,5 mg/dl GGT 6-16 U/L GLU mg/dl GOT U/L GPT U/L LIP U/L P 3,5 6,5 mg/dl PRO 5,3 8,3 g/dl TRI mg/dl UR mg/dl L analisi statistica effettuata sui parametri metabolici dei cani coterapeuti alimentati con mangime long life e mantenimento ha messo in evidenza delle variazioni statisticamente significative per i parametri: d ROMs Amilasi (Am) Calcio (Ca) Creatinfosfochinasi (Cpk) Creatinina (Cre) Gammaglutamiltransferasi (ggt) Urea (Ur)

34 TEMPO ZERO TEMPO ZERO

37 Grazie dell attenzione