ID55/2005 PROGETTO R&S Lo sviluppo di nuovi inibitori delle istone deacetilasi per un approccio epigenetico alla terapia dei tumori.
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- Albana Ferrari
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1 SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI CONGENIA - CONGENIA Srl Milano - DAC Srl Milano - NIKEM RESEARCH Srl Bollate MI - ISTITUTO EUROPEO DI ONCOLOGIA Milano - ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE Milano - UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO ID55/2005 PROGETTO R&S Lo sviluppo di nuovi inibitori delle istone deacetilasi per un approccio epigenetico alla terapia dei tumori. AREA MD BIOTECNOLOGIE NON ALIMENTARI DURATA 24 MESI QUADRO ECONOMICO PREVISIONE INIZIALE ,00 COSTO FINALE ,63 INTERVENTO FINANZIARIO EROGATO ,00 DESCRIZIONE Il progetto di Ricerca si è proposto di approfondire la conoscenza del meccanismo di azione delle istone deacetilasi e degli HDACi, per consentire, nell ambito del progetto stesso, il disegno di nuovi HDACi potenzialmente più potenti e più selettivi ed il loro test in modelli preclinici. Più specificamente il Progetto ha ipotizzato due principali obiettivi: 1. L analisi proteomica e genetica del ruolo delle HDAC e del meccanismo di azione degli HDACi in modelli sperimentali/ preclinici.
2 2. La sintesi di nuovi HDACi mediante una strategia di rational based drug design e loro caratterizzazione; Per il perseguimento del primo obiettivo sono stati utilizzati svariati approcci biologici per ottenere una maggiore comprensione del ruolo delle HDAC. Scopo di questi studi è stata l ottimizzazione delle modalità di trattamento, l individuazione di marcatori di risposta agli HDACi, l identificazione di target secondari per programmi successivi di drug discovery. Tali analisi hanno consentito di: a) Determinare quali HDAC siano maggiormente coinvolte nel mantenimento del fenotipo leucemico. b) Identificare i circuiti genetici responsabili della sensibilità o resistenza a vari HDACi Il Progetto, attraverso il perseguimento del secondo obiettivo, ha contribuito allo sviluppo di una via terapeutica innovativa attraverso l identificazione di nuove molecole con attività inibitoria le istone deacetilasi. Gli HDACi, infatti, si sono rivelati come una delle più promettenti classi di molecole anti-tumorali, essendo tali enzimi frequentemente deregolati in tale patologia. L inibizione delle HDAC rappresenta dunque una via terapeutica molto promettente per il trattamento delle patologie tumorali. L identificazione di nuove molecole con attività inibitoria delle istone deacetilasi è stata raggiunta attraverso due modalità differenti: a) la determinazione delle strutture cristallografiche delle HDAC umane ( genomica strutturale delle istone deacetilasi umane ) b) una strategia di chimica computazionale. Entrambe le modalità sopra indicate hanno consentito lo sviluppo di nuove molecole con attività inibitoria le istone deacetilasi. Ulteriore obiettivo del progetto è stato quindi la caratterizzazione biologica dei nuovi inibitori identificati attraverso saggi biochimici e cellulari e attraverso analisi in vivo. Gli inibitori con le migliore caratteristiche sono stati quindi sottoposti ad analisi farmaco-cinetiche e farmaco-dinamiche comparative rispetto agli inibitori attualmente utilizzati in clinica. RISULTATI PROGETTO Analisi del meccanismo di azione delle istone deacetilasi (HDAC) e degli inibitori di HDAC Studi di knock-down in cellule di mammifero. Mediante la tecnologia dell RNA interference, sono stati generati diversi modelli cellulari nei quali è stata ridotta del 90% l espressione di specifiche HDAC di classe I (i.e HDAC1, 2 e 3). Le cellule con ridotta espressione delle singole HDAC sono state analizzate per la loro capacità proliferativa e differenziativa. In tale studio sono stati osservati diversi fenotipi dovuti all abolizione dell espressione di specifiche HDAC. In particolare, l abolizione dell espressione di HDAC1 e HDAC3
3 causa una modulazione del differenziamento ematopoietico nei vari sistemi studiati. Questo fenomeno risulta essere specifico per cellule esprimenti la proteina di fusione PML-RAR in quanto l abolizione delle stesse HDAC1 e 3 in un contesto normale non altera il potenziale differenziativo della cellula. Dati preliminari riguardanti il knock-down di HDAC2 rivelano un fenotipo simile alle cellule non interferite suggerendo un contributo non essenziale di questa proteina nel processo differenziativo ematopoietico (nel contesto di cellule esprimenti la proteina di fusione PML-RAR). Al fine di studiare più in dettaglio il contributo delle singole HDAC nello sviluppo della leucemia promielocitica acuta, si è deciso di valutare gli effetti del loro knock-down anche in vivo (utilizzando un modello murino nel quale l oncogene PML-RAR e espresso nel solo compartimento ematopoietico). Il knock-down di HDAC1 ha dimostrato che l abolizione della proteina modula in modo sensibile l insorgenza della leucemia. Il meccanismo molecolare alla base di tale fenomeno è al momento sotto investigazione. Approcci genomici e meccanicistici per identificare i chemical genetic profiles ed i meccanismi d azione di HDAC inhibitors. VPA e TSA, due inibitori noti delle HDACs sono stati usati in screenings genomici per identificare mutazioni di lievito che conferiscano ipersensibilità ai due composti. I profili genetici di ipersensibilità, sebbene molto diversi fra loro, evidenziano la presenza di mutazioni nei pathways del DNA damage response e del double strand break repair. I risultati ottenuti hanno consentito di focalizzare gli studi successivi sugli effetti causati da VPA sulla risposta cellulare al danno al DNA. Studi meccanicistici indicano che VPA influenza il checkpoint da danno al DNA. Al fine di dimostrare che l effetto di VPA si esplica mediante l inibizione di specifiche HDACs, è stato analizzata la risposta cellulare ai danni al DNA in diversi background genetici di lievito alterati nei geni codificanti le varie HDACs I risultati hanno consentito di identificare due HDAC che rappresentano i bersagli molecolari del VPA. Sono stati inoltre condotti screenings genomici mediante synthetic genetic array per identificare i profili genetici che determinano letalità in combinazione con mutazioni nei geni codificanti le HDACs inibite da VPA. Sintesi di nuovi inibitori di HDAC e loro caratterizzazione. Per il perseguimento del secondo obiettivo del progetto sono state sviluppate le seguenti attività: 1. Studi di SAR (relazioni struttura attività) ed approfondimento delle caratteristiche farmacocinetiche di [(3-oxo-3-fenilpropenil)-fenil]-N-idrossi-acrilammidi; 2. Valutazione dell inibizione delle istone deacetilasi in cellule tumorali (K562); 3. Analisi del meccanismo molecolare di azione di molecole
4 selezionate; 4. Studi di farmacodinamica nel modello di leucemia PML-RAR con il composto selezionato; 5. Studi di efficacia in vivo in modelli di xenograft di coloncarcinoma umano con il composto selezionato; 6. Disegno e sintesi di inibitori a struttura nuova. Per quanto riguarda i punti 1 3 Il lavoro si è incentrato su variazioni strutturali di [(3-oxo-3-fenil-propenil)- fenil]-n-idrossi-acrilammidi con l obiettivo di modularne l attività biologica e di ottenere molecole aventi un profilo preclinico drug-like con particolare attenzione all ottenimento di molecole con alta solubilità. Si sono ottenuti composti con caratteristiche biochimiche e cellulari ottimali. Per i composti più potenti si è valutata la capacità di inibire le istone deacetilasi in cellule tumorali, seguendo l effetto sul livello di acetilazione basale, in un linea cellulare di leucemia umana: K562. Il lavoro svolto ha portato al deposito del brevetto: A new class of histone deacetylase inhibitors. Un successivo estensivo lavoro di analisi delle principali caratteristiche fisico chimiche, di permeabilità delle membrane cellulari, di stabilità metabolica utilizzando estratti microsomiali in due specie (topo e uomo), del legame alle proteine plasmatiche e possibile interferenza con citocromi, ha consentito di identificare, tra i prodotti sintetizzati, quelli che potessero avere proprietà tali da meritare un analisi, in vivo, del loro profilo farmocinetico. Dall analisi è risultato che i composti selezionati possiedono una clearance medio-alta (paragonabile, ed in alcuni casi migliore, al composto di riferimento) ed una disponibilità orale paragonabile a quella del composto di riferimento. Successivamente, abbiamo selezionato un composto le cui caratteristiche di potenza, biochimiche, cellulari e farmacocinetiche apparivano, nel complesso, superiori al composto di riferimento, per valutarne l efficacia in vivo. Per quanto concerne il punto 4 Sono stati condotti studi di farmacodinamica nel modello di leucemia PML- RAR sfruttando la possibilità di verificare in parallelo se una possibile efficacia antitumorale (valutata come riduzione della splenomegalia determinata dall infiltrazione delle cellule leucemiche) si associasse o meno ad un inibizione del bersaglio molecolare (incremento di acetilazione della milza). Gli esperimenti condotti hanno consentito di verificare che il composto selezionato fosse in grado di causare una riduzione della milza (paragonabile alla dose ottenuta con il Vorinostat) associata alla modulazione del bersaglio molecolare. Alla luce dei dati ottenuti sono stati quindi pianificati ulteriori esperimenti in cui si valuterà la capacità del prodotto di determinare un incremento di
5 sopravvivenza dei topi leucemici Per quanto riguarda il punto 5 Sulla base del buon profilo del prodotto sopra descritto, si e deciso di valutare il possibile effetto antitumorale dello stesso in un modello di xenograft di colon-carcinoma umano: HCT-116. Il trattamento, iniziato su topi in cui i tumori erano palpabili con dimensioni medie di 100 mm 3, non ha evidenziato alcun problema di tollerabilità. L analisi delle dimensioni dei tumori ha altresì evidenziato un eccellente attività antitumorale del composto selezionato. Per quanto riguarda il punto 6 È stata pianificata la sintesi di una nuova serie di inibitori delle istone deacetilasi. Applicando un approccio di sintesi parallela sono stati sintetizzati svariati composti di questa nuova classe chimica. Composti di questa nuova serie si sono dimostrati particolarmente attivi nei saggi biochimici e cellulari, con buona solubilità in acqua e buona stabilità metabolica in microsomi di uomo e topo. Ugualmente alla serie chimica precedentemente descritta, per i composti più potenti dal punto di vista biochimico e cellulare, è stata analizzata la capacità di inibire le istone deacetilasi, capacità valutata come effetto sul livello di acetilazione basale, in un linea cellulare di leucemia umana: K562. Questa serie chimica in via di completa espansione è stata inclusa in un nuovo brevetto: Nuovi derivati eterociclici come nuova classe di inibitori delle istone deacetilasi.
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